Выделение и<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Культура Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ Т-клеток, А.Н. Extrathymic αβT-клеток-предшественников

Резюме

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Аннотация

Тимус, основной орган для генерации ар Т-клеток и позвоночника адаптивной иммунной системы позвоночных, уже давно рассматривается как единственный источник αβT клеток. Тем не менее, инволюция тимуса начинается рано в жизни, ведущей к снижению производительности резко наивных αβT клеток в периферии. Тем не менее, даже долгожители могут построить иммунитет против вновь приобретенных патогенов. Последние исследования показывают, развитие extrathymic αβT клеток, однако наше понимание путей, которые могут компенсировать потери тимуса функции по-прежнему рудиментарные. γδ Т-клетки-лимфоциты, что врожденные составляющие основную подмножество Т-клеток в тканях. Мы недавно приписывали до сих пор недооцененный выдающийся функцию к γδ Т-клеток подмножества, показав, что мало субъект ^CD4 + Vδ1 ⁺ γδ Т-клетки могут трансформироваться в αβT клеток в воспалительных процессах. Здесь мы рrovide протокол для изоляции этого прародителя из периферической крови и ее последующего выращивания. Vδ1 клетки положительно обогащенные от РВМС от здоровых доноров с использованием магнитных шариков, после чего на второй стадии, где мы нацелены на дефицитный фракцию ^CD4 + клеток с последующей техники магнитного маркировки. Магнитная сила второго маркировки превышает одним из первых магнитного этикетке, и, таким образом позволяет эффективно, количественный и конкретные положительные изоляции населения интерес. Затем мы вводим техники и культуры условие, необходимое для клонирования и эффективно расширять клетки и для идентификации созданных клонов анализа FACS. Таким образом, мы предоставляем подробный протокол для очистки, культуры и экс естественных условиях расширения CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ Т-клеток. Это знание является непременным условием исследований, которые относятся к этой αβT сотовые progenitor`s биологии и для тех, кто стремиться к IDEntify молекулярные триггеры, которые участвуют в его трансдифференцировки.

Введение

У позвоночных, адаптивный иммунитет, который структурирован сотовый и гуморального звена иммунитета играет важную роль в защите от патогенов. Признание широкого спектра антигенов опосредуется hyperpolymorphic Т- и В-клеточных рецепторов (TCR / BCR), который в связи с Т-клетками, как предполагается, производится в основном в тимусе ^1. Туда, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), полученные из костного мозга, семя тимуса и дифференцироваться строго определенные этапы, наконец, давая начало всем клеточных клонов Т. Тимуса посева предшественники CD4 ^- и CD8 ^- и, таким образом составляют незрелые, двойное отрицание (DN) тимоцитов фракции. Тимус-полученные сигналы, то индуцировать их коммитирование и дифференциацию в любой ар или γδ Т-клеток. Выражение функционально перестроенных ТКС-Г и TCR-дельта генов цепей в Dn2 / 3 тимоцитов приводит к Г δTCR комплексы, которые приводят сотовой ап оружияd способствовать дифференциации в γ & Delta; t клеток ^2,3. В противоположность этому, перестановка функционального TCR & beta; цепи, которые могут спариваться с preTα построить preTCR рт, индуцирует транскрипцию молчание ТКР гамма цепи в DN3 тимоцитов и их переход в ^CD4 + CD8 ^{+ двойной} положительных тимоцитов ⁴ , На этом этапе, рекомбинация ТКР -цепи имеет место, удалив TCR-дельта локус, что прижимается в TCR-альфа локуса, таким образом, отменяя продукции в γδTCR в этих клетках безвозвратно ^5-9. Переставленные αβTCRs впоследствии отобраны за их способности связывать собственного MHC слабо (положительный выбор), который не может превышать определенный порог, чтобы избежать аутоиммунных реакций (негативный отбор). По своей способности связывания МНС класса I или II, выбранные ячейки αβT развиваться в клетках одного-положительных ^CD4 + или ^CD8 + Т, выход из тимуса, как наивных Т-клеток.

Тем не менее, инволюция тимуса начинается рано в жизни, ведущей к экспоненциально уменьшается выход наивных Т-клеток, что является почти потушен после отрочества ^10. Тем не менее, размер ячейки бассейн Т остается постоянным на протяжении всей жизни, что может быть объяснено только в рамках пост-тимуса гомеостатической пролиферации Т-клеток и пролиферации долгоживущего иммунологической памяти ^11. Следовательно, extrathymic развитие Т-клеток должно произойти. Недавние исследования приобрела значительный аттракцион, который характеризуется клеток предшественников αβT, которые, по крайней extrathymic сайтов-породили функциональный ар Т-клеток ^12-17. Тем не менее, детальное знание о extrathymic предшественников клеток αβT, что независимо от тимуса дифференцируются в клетки αβT как фрагментарно в качестве фона, что у нас на маршруте, таким образом, они берут.

Мы недавно определили небольшой объект Т-клеток Vδ1 ^{+ CD4} + клетки γδT качестве extrathymic αβT клеток prognitor ^{18, который,} когда, выделенных из периферической крови здоровых доноров может трансформироваться в αβT клеток в мягком воспалительного среды. Интересно и то, в отличие от гомеостатического распространения пост-тимуса Т-клеток, трансдифференцировкой Vδ1 CD4 ^{+ клеток} генерирует новые Т-клеточные рецепторы, тем самым расширяя репертуар разнообразие, так что потенциально новые антигены могут быть признаны и могут защита хозяина против вновь приобретенных патогенов. Это добавляет к пластичности Т-клеток и добавляет так далеко недооцененными новый путь для развития extrathymic Т-клеток.

Количественный изоляция от лимфоцитов источников, генерация одного клеточных клонов и их эффективное расширение имеют важное значение для цель идентифицировать те маркеры и молекулы, которые вызывают это αβT клеток precursor`s extrathymic развития.

протокол

Этика себе: Все процедуры были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено клинической Комитета по этике в университете Тюбингена на (проекты 38 / 2009B02 и 470 / 2013B02).

1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)

1. Возьмем 50-100 мл из здорового добровольца с помощью венепункции, используя 50 мл шприц, содержащий 1000 МЕ гепарина сульфата и разбавленной крови 1: 2 PBS (рН = 7,2).
2. Тщательно слой 35 мл крови: PBS раствора на 15 мл крови, разделяющей раствор, такой как Biocoll (D = 1,077 г / мл) в 50 мл коническую трубку. Центрифуга в течение 15 мин при 800 х г при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тормоз не должен использоваться.
3. Сбор клетки лимфоцитарного слоя с помощью пипетки и промыть клетки дважды в, по меньшей мере 50 мл PBS (центрифуги в течение 12 мин; 400 мкг на). Удалить супернатант после центрифугирования с помощью пипетки.
4. Lyse остальные эритроциты путем приостановления и incubэксплуатации данного лимфоцитарный фракцию с 1-5 мл гипотонического буферного раствора дл 2-4 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность воздействия и объема лизиса буфер зависит от используемого лизирующим буфера и количества красных кровяных клеток, оставшихся во фракции лимфоцитов.
5. Развести клетки с PBS (1:10) и центрифугируют при 250 х г в течение 12 мин, а затем ресуспендируют и промывают осадок клеток один раз в 10 мл PBS при 300 х г в течение 12 мин.
6. Ресуспендируют лимфоцитов в PBS и считать клетки в счетной камере Neubauer использованием трипанового синий раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило,> 1 х 10 ⁸ лимфоцитов, полученных от 100 мл свежего обращается периферической крови.

2. Выделение Vδ1 Т-клеток

1. Take <1 х 10 ⁶ изолированных лимфоцитов в течение начальных FACS, определяющих частоту Vδ1 CD4 Т-клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Численность населения этого Т-клеток лица могут сильно отличаться между частными лицами и в соответствии с их иммунологической государства. Typicсоюзник, около 1% Т-клетки Vδ1 ⁺ и около 1-5% Vδ1 ⁺ клеток ^CD4 +.
   1. Развести клеток с 1 мл FACS буфера, который состоит из ФБР, содержащим 2% FCS и 5 мМ ЭДТА. Центрифуга при 660 х г в течение 2 мин и декантируют супернатант. Объем рефлюкс около 100 мкл FACS буфера является достаточным для последующим окрашиванием. Кратко вихря и инкубировать клетки с 5 мкл Fc-блокирующий реагент в течение 5 мин при комнатной температуре повышенной специфичностью окрашивания FACS.
   2. Добавить человеческих моноклональных антител непосредственно к клеткам без удаления Fc-блокирующего реагента. Убедитесь, что пятно клеток с антителами против Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) и (1:25 TCRαβ). Подготовьте контроль изотипа с соответствующими изотипов иммуноглобулинов. Инкубируйте клетки с антителами в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
   3. Вымойте клеток в 1 мл FACS буфера (центрифуги в течение 2 мин, при 660 мкг), переливать supernatant и приступить к приобретению FACS в остальном объеме буфера.
2. Гранулирование клетки (которые не используются в анализе FACS) центрифугированием в течение 12 мин; на 300 г; 8 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют клетки pelletin 60 мкл MACS-буфера на 1 х 10 ⁷ клеток. Добавить 20 мкл Fc-блокирующего реагента для 1 х 10 ⁷ клеток и инкубируют в течение 5 мин при 4 ° С.
3. Добавить 10 мкл ФИТЦ-конъюгированного антитела против человеческого антитела Vδ1 для 1 х 10 ⁷ клеток непосредственно к клеткам. Инкубируют в течение 12 мин при 4 ° С в темноте.
4. Промыть клеток с использованием 14 мл MACS-буфера (центрифуги в течение 12 мин; на 300 г; 8 ° C). Удалите супернатант полностью и ресуспендирования клеток в 80 мкл MACS буфера на 1х10 ⁷ клеток.
5. Принимать по 1-2 х 10 ⁵ клеток и разбавить их в 100 мкл FACS буфера для проверки маркировки путем анализа FACS. Никаких дополнительных добавок не требуется для этого шага. Убедитесь, что есть suffiРазница циент яркости для Vδ1 ^- и Vδ1 ^{+ клеток.} Если это не так, повторите шаги 2.3 и 2.4)).
6. Добавить 20 мкл анти-FITC микрошарики на 1 х 10 ⁷ клеток на оставшиеся клетки, хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин в темноте при 4 ° С. После этого промыть клетки с помощью по меньшей мере 10 мл MACS буфера (центрифуги в течение 12 мин, при 300 х г; 8 ° C).
7. В центрифугирования уравновесить предварительно охлажденный магнитного колонку помещают в магните с 500 мкл буфера MACS.
8. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера MACS-(для количества клеток выше, чем 1 × 10 ^8, наращивать этот объем соответственно) и тщательно применять клетки в колонку. Сбор проточные, содержащий Vδ1 ^- клетки.
9. Промыть колонку три раза 500 мкл буфера MACS-и собирать проточные снова в той же пробирке. Следует отметить, что резервуар должен быть пустым перед применением буфера на колонку.
10. Удалить столбец из магнитного устройства и поместите его в 15 мл коническую пробирку. Быстро промыть колонку с 1 мл буфера MACS, крепко нажимая на поршень в колонну. Собирают элюат в пробирку.
    Примечание: Для того чтобы получить чистоту> 98%, как правило, необходимо повторить шаги 2,7-2,9) с второй колонке.
11. Проверка чистоты клеток путем FACS анализа ¹⁸ с тем же антителом панели, как и раньше (см 2.1.2) и подсчет клеток.

3. Выделение Vδ1CD4 ^{+ Т-клеток}

1. Ресуспендируют 25 мкл из бисера CD4 с вихрем для> 30 сек. Вымойте бисером (минимальное количество, как изображено на производителя) в 1 мл буфера MACS в 1,5 мл реакционной трубки путем размещения трубы в магнит в течение 1 мин. Удалите супернатант осторожно малого пипетки (200 мкл) и ресуспендируют бусины в первоначальный объем MACS-буфера.
2. Гранулирование Vδ1 ^{+ клеток} (центрифуги для 12 мин; 300 мкг) и аспирации супернатант и ресуспендирования все ^{+ клеток} Vδ1 в 500 мкл MACS-буфера и добавить их в пробирку, содержащую бусы. Смешайте энергично и инкубировать в течение 20 мин при 4 ° С с постоянным наклоном (например, в ротатор).
3. Поместите пробирку, содержащую клетки в магните в течение 2 мин. Убедитесь, что нет остатков в крышке.
   Примечание: ^CD4 + клетки были связаны будет магнитных шариков и приложить к стороне трубки, обращенной к магнит.
4. Осторожно откройте крышку, держа трубку в магнитном устройстве и собирать верхний слой, который содержит CD4 ^- Vδ1 ^{+ клеток} с помощью мелкого пипетки. Поместите CD4 ^- Vδ1 ⁺ клеток в отдельную пробирку и поместите эту трубку в магнит снова, чтобы избежать возможности оставшиеся клетки CD4 или шарики от населения.
   1. Вымойте CD4 ^- клеток в 5 мл MACS-буфера (центрифуги в течение 12 мин, при 300 XG) ай ресуспендируют их в концентрации 1 ^× 10 5 клеток на 100 мкл среды. CD4 ^- клетки могут быть легко культивируется при условиях, указанных ниже (4,2).
5. Поместите пробирку с целями клеток ^CD4 + за пределами магнитного поля, ресуспендирования клеток в 500 мкл буфера MACS-и положил их обратно в магнитном устройстве. Повторите шаги 3.3-3.5 раза, чтобы получить более высокую чистоту. Удалить супернатант с помощью пипетки
6. Ресуспендируют клеток CD4 ⁺ в 100 мкл культуральной среды (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-глутамина, 1% пенициллина / стрептомицина) и добавить 10 мкл шарик-отсоединения раствора. Выдержите при комнатной температуре в течение 45 мин при постоянном наклоне (например, в ротатор).
7. Поместите клетки в магните в течение 1 мин. Осторожно собрать супернатант, содержащий шарик без Vδ1 ^{+ CD4} + клеток с помощью мелкого пипетки.
8. Вне магнита, ресуспендируйте бусы с 100 мкл культуральной среды и повторениешаги 3.6 и 3.7 раза, чтобы получить более высокие количества клеток ^CD4 + клеток.
9. Гранулирование клетки (центрифуге при 300 мкг, в течение 12 мин) и отбросить супернатант полностью с помощью пипетки. Ресуспендируют клеток в свежей, подогретого СМИ и считать их. Изучение чистоту Vδ1 ^{+ CD4} + клеток с помощью анализа FACS, изображенных на шагах 2.1.1-2.1.3.

4. Одноклеточный Клонирование по ограниченной разведение

1. Изолировать мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) из аллогенной донора, как показано на 1,1-1,6.
2. Облучают 2,5 × 10 ⁷ аллогенных МНПК 80 Гр в 25 мл культуральной среды с помощью гамма-излучения.
3. Добавить IL-2 (200 ед / мл), IL-7 (20 нг / мл) и РНА (2 мкг / мл) в облученных питающих клеток и распределить их в 96-луночный U-формы пластин, 5 х 10 ⁴ подачи клетки в 50 мкл на лунку.
4. Развести клетки Vδ1 ^{+ CD4} + в концентрации 0,3 клеток на 50 мкл. Пипеткате 50 мкл клеточной раствора в каждую лунку укрывает облученные клетки и цитокины.
   Примечание: Таким образом, цитокины разбавляли до конечной концентрации 100 ед / мл IL-2, 10 нг / мл IL-7 и 1 мкг / мл РНА. Инкубируйте 96-луночных планшетах в термостате при 37 ° С, _5% СО 2 влажной атмосфере.
   1. При желании, развивать остальные очищают Vδ1 ^{+ CD4} + клеток, как объемной культуры в тех же условиях культивирования, как клоны.
5. Поставка клетки каждые 3-4 дня с цитокинами и свежих средств массовой информации. Для этого, обмен половина среды в лунках с 50 мкл свежей среды с помощью пипетки. Добавить 2-кратной концентрации цитокинов в каждом добавок. Добавить 5X10 ⁴ облученные фидерные клетки на лунку и любой другой раунд кормления.
6. Использование микроскопа, наблюдать первые клоны становятся видимыми через 3-4 недель, так как они усваивают и, таким образом, изменить цвет культуральной среды и образовывать колонии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для мехаь еще выращивание, ресуспендируйте клонов также и передавать их на отдельные 96-луночных планшетах. Анализ клеток с помощью FACS, как указано в 2.1.1-2.1.3. Клоны содержали в таких условиях может в конечном итоге изменить их TCR от Vδ1 в αβTCR. Момент времени для этой трансдифференцировки варьируется от клона клонирования.

Результаты

На рисунке 1 показана различные этапы и исход изоляции Vδ1 Т-клеток из периферической крови. 1А показывает типичное распределение Vδ1 ^{+ клеток} в ^CD3 + лимфоцитов, а также ко-рецептор выражение населения Vδ1 ^+. В этом донора, частота Vδ1 ^{+ клеток} (красный) ...

Обсуждение

Для изучения фенотипа, биологию и функцию мало (Т) клеток лица, а именно Vδ1 ^{+ CD4} + T-клетки, мы использовали два маркера: Vδ1 и CD4 для его положительного изоляции магнитного элемента. Vδ1 сирота рецепторов, в то время как CD4 экспрессируется на Т-клеток-хелперов, на более низком уровне на мо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D