Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Células T, γδ um Extrathymic αβT de células progenitoras

Resumo

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Resumo

O timo, o órgão primário para a geração de células T e ap espinha dorsal do sistema imune adaptativa em vertebrados, tem sido considerada como a única fonte de células αβT. No entanto, a involução do timo começa no início da vida que conduz a uma saída drasticamente reduzido de células αβT naive para a periferia. No entanto, mesmo centenários pode construir a imunidade contra patógenos recém-adquiridas. Uma pesquisa recente sugere o desenvolvimento de células αβT extrathymic, no entanto a nossa compreensão das vias que podem compensar a perda da função do timo são ainda rudimentar. γδ células T são os linfócitos inatos que constituem o principal subconjunto de células T nos tecidos. Recentemente atribuída uma função notável, até agora não apreciado a um subconjunto de células T γδ, mostrando que a entidade escasso ^de células CD4 + Vδ1 ⁺ γδ células T podem transdiferenciar em células αβT em condições inflamatórias. Aqui, nós provide o protocolo para o isolamento do presente progenitoras do sangue periférico e o seu cultivo subsequente. Vδ1 células são enriquecidas a partir de PBMC positivamente de dadores humanos saudáveis ​​usando esferas magnéticas, seguido por um segundo passo em que temos como alvo a fracção escasso de células ^CD4 + com uma outra técnica de marcação magnética. A força magnética do segundo rótulo for superior a da primeira etiqueta magnética, e assim permite o isolamento positivo eficiente, quantitativa e específico da população de interesse. Em seguida, introduzir o estado da técnica e da cultura requerido para a clonagem eficiente e expansão das células e para a identificação dos clones gerados por análise de FACS. Assim, nós fornecemos um protocolo detalhado para a purificação, a cultura e expansão ex vivo de células T γδ CD4 ⁺ Vδ1 ^+. Este conhecimento é pré-requisito para estudos relacionados a esse αβT progenitor`s celulares biologia e para aqueles que pretendem identify os gatilhos moleculares que estão envolvidos na sua transdiferenciação.

Introdução

Nos vertebrados, a imunidade adaptativa, que está estruturado na celular e uma parte humoral da imunidade desempenha um papel importante na defesa contra agentes patogénicos. O reconhecimento de uma vasta gama de antigénios é mediada por T-hyperpolymorphic e receptores de células B (TCR / BCR), que diz respeito às células T são assumidos para ser produzida principalmente no timo ^1. A esta, as células estaminais hematopoiéticas (HSCs), derivadas de medula óssea, o timo sementes e se diferenciam ao longo de etapas bem definidas, finalmente, que dão origem a todas as linhagens de células T. Timo progenitores de semeadura são CD4 ^- e CD8 ^- e constituem, assim, a fração de timócitos imaturos, dupla negativa (DN). Sinais derivados do timo, em seguida, induzir a sua linhagem compromisso e a diferenciação em células T, quer ap ou γδ. A expressão de TCR e TCR-y-ô genes das cadeias funcionalmente rearranjados em DN2 / 3 timócitos leva a y δTCR complexos, que levam uma proliferação celulard promover a diferenciação em células γ AT ^2,3. Em contraste, o rearranjo de uma cadeia de TCR-β funcional, que pode emparelhar com preTα para construir um preTCR Pt, induz o silenciamento transcricional da cadeia TCR-γ em timócitos DN3 e a sua passagem em células CD4 ⁺ CD8 ⁺ duplo-positivos timócitos ⁴ . Nesta fase, a recombinação da cadeia TCR-α ocorre, a exclusão do locus TCR-δ que se aninha no interior do locus TCR-α, revoga assim a produção de um γδTCR nestas células irrevogavelmente ^5-9. ΑβTCRs reorganizados são posteriormente seleccionados pela sua capacidade de se ligar a auto-MHC fracamente (seleção positiva), que não pode exceder um determinado limiar para evitar a auto-imunidade (seleção negativa). De acordo com a sua capacidade de se ligar a MHC de classe I ou II, as células seleccionadas αβT desenvolvem em células de um único positivo ^CD4 + ou ^T CD8 +, que a saída do timo células T como naive.

No entanto, a involução do timo começa cedo na vida levando a exponencialmente reduziu a produção de células T naive que é quase extinto pós-adolescência ^10. No entanto, o tamanho do conjunto de células T permanece constante durante toda a vida, o que pode ser explicado apenas parcialmente por uma proliferação homeostática pós-timo de células T e a proliferação de memória imunológica de longa duração ^11. Por conseguinte, o desenvolvimento de células T extrathymic deve ocorrer. Uma pesquisa recente ganhou atração substancial que caracterizou progenitores de células, que αβT-at-extrathymic locais deram origem às células T ap funcional ^12-17. No entanto, o conhecimento detalhado sobre precursores de células extrathymic αβT que independente de um timo diferenciam em células αβT é tão fragmentado como o fundo que nós temos na rota tomam assim.

Recentemente, identificou a entidade pequeno de células T de Vδ1 ⁺ células T CD4 ⁺ como uma αβT γδT prognitor extrathymic célula ^18, a qual, quando isolados a partir de sangue periférico de dadores humanos saudáveis, podem transdiferenciar em células αβT num ambiente inflamatório leve. Curiosamente e ao contrário da proliferação homeostática de células T pós-timo, transdiferenciação de células Vδ1 ^CD4 + gera novos receptores de células T, ampliando assim a diversidade repertório, de modo que, potencialmente, novos antígenos podem ser reconhecidas e podem protecção do hospedeiro contra patógenos recém-adquiridas. Isso aumenta a plasticidade das células T e adiciona um novo caminho até agora pouco apreciado para o desenvolvimento de células T extrathymic.

O isolamento quantitativo a partir de fontes linfocítica, a geração de clones de uma única célula e sua expansão eficiente são essenciais para o objectivo de identificar os marcadores e moléculas que desencadeiam essa célula αβT precursor`s desenvolvimento extrathymic.

Protocolo

Declaração de ética: Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Comitê de Ética da Clínica da Universidade de Tübingen (projetos 38 / 2009B02 e 470 / 2013B02).

1. Isolamento de Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC)

1. Tome 50-100 ml de um voluntário saudável por meio de venipunctura usando uma seringa de 50 ml contendo 1000 UI de heparina e sulfato de diluir o sangue 1: 2 com PBS (pH = 7,2).
2. Camada cuidadosamente 35 ml de sangue em solução de PBS: solução de separação de 15 ml de sangue, tais como Biocoll (d = 1,077 g / ml) num tubo de 50 ml. Centrifugar durante 15 minutos a 800 xg à temperatura ambiente.
   NOTA: O freio não deve ser utilizado.
3. Recolher as células da camada linfocítica com uma pipeta e lava-se as células duas vezes em, pelo menos, 50 ml de PBS (centrifuga-se durante 12 min; a 400 xg). Remover o sobrenadante após centrifugação com uma pipeta.
4. Lyse restantes eritrócitos por suspensão e incubAting a fracção linfocítica com 1-5 ml de uma solução tampão hipotónico para 2-4 min.
   NOTA: A duração da exposição e do volume de tampão de lise dependem do tampão de lise utilizada e a quantidade de glóbulos vermelhos restantes na fracção de linfócitos.
5. Dilui-se as células com PBS (1:10) e centrifugar a 250 xg durante 12 min e, subsequentemente, lavar e ressuspender o sedimento de células uma vez em 10 ml de PBS a 300 xg durante 12 min.
6. Ressuspender os linfócitos em PBS e contar as células numa câmara de contagem Neubauer usando solução azul de Tripano.
   NOTA: Normalmente,> 1 x 10 ⁸ a partir de linfócitos são recebidos 100 ml recentemente tirado sangue periférico.

2. Isolamento de Células T Vδ1

1. Take <1 x 10 ⁶ linfócitos isolados por um período inicial de FACS que determinam a frequência de células T CD4 Vδ1.
   NOTA: O tamanho da população desta entidade de células T podem diferir muito entre os indivíduos e de acordo com seu estado imunológico. Neossoloaliado, cerca de 1% das células T são Vδ1 ^{+ e} cerca de 1-5% de células T CD4 ^{+ são} Vδ1 ^+.
   1. Dilui-se as células com 1 ml de FACS-tampão, que consiste em PBS contendo FCS a 2% e EDTA 5 mM. Centrifugar a 660 xg durante 2 minutos e decantar o sobrenadante. O volume de tampão de FACS de refluxo cerca de 100 ul é suficiente para a coloração subsequente. Resumidamente vórtex e incubar as células com 5 ul de reagente de Fc-bloqueio durante 5 min à TA, durante o aumento da especificidade da coloração FACS.
   2. Adicionar anticorpos monoclonais humanos directamente para as células sem remover o reagente de bloqueio de Fc. Certifique-se de corar as células com anticorpos contra Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) e TCRαβ (01:25). Prepara-se o controlo do isotipo de imunoglobulina com as correspondentes isotipos. Incubar as células com anticorpos durante 20 min a 4 ° C no escuro.
   3. Lave as células em 1 ml de tampão FACS (centrifugar por 2 min; a 660 xg), decantar o supernatant e proceder à aquisição FACS no volume tampão restante.
2. Peletizar as células (que não são utilizadas na análise de FACS) por centrifugação durante 12 min; a 300 g; 8 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender a célula pelletin 60 ul MACS-tampão por 1 x 10 ⁷ células. Adiciona-se 20 de Reagente de Bloqueio-Fc? L por 1 x 10 ⁷ células e incubar durante 5 min a 4 ° C.
3. Adicionar 10 ul de anticorpo anti-humano Vδ1 conjugado com FITC por 1 x 10 ⁷ células directamente para as células. Incubar durante 12 min a 4 ° C no escuro.
4. Lavam-se as células utilizando 14 mL de tampão-MACS (centrifuga-se durante 12 min; a 300 g; 8 ° C). Elimine o sobrenadante completamente e voltar a suspender as células em MACS tampão 80 ul por 1x10 ⁷ células.
5. Tome 1-2 x 10 ⁵ células e diluí-los em tampão FACS 100 ul para verificação da rotulagem por análise FACS. Não são necessários outros aditivos para este passo. Certifique-se de que existe um suficient diferença no brilho para Vδ1 ^- e células Vδ1 ^+. Se este não for o caso, repetir os passos 2.3) e 2.4).
6. Adicionar 20 pi microesferas anti-FITC por 1 x 10 ⁷ células para as células restantes, misturar bem e incubar durante 15 min no escuro a 4 ° C. Em seguida, lavar as células utilizando MACS ml de tampão de pelo menos 10 (centrifuga-se durante 12 min, a 300 xg; 8 ° C).
7. Durante a centrifugação, equilibrar a coluna magnética pré-arrefecida em um íman colocado com 500 ul de tampão MACS.
8. Ressuspender as células em 500 ul MACS-tampão (para o número de células maior do que 1 x 10 ^8, adaptar-se de acordo com este volume) e aplicam-se as células cuidadosamente na coluna. Recolher o flow-through contendo a Vδ1 ^- células.
9. Lava-se a coluna três vezes com 500 ul de tampão-MACS e recolher o fluxo de passagem de novo no mesmo tubo. Note-se que o reservatório tem de estar vazia antes da aplicação na coluna de tampão.
10. Remova a coluna do dispositivo magnético e colocá-lo em um tubo cônico de 15 ml. Rapidamente lavar a coluna com tampão de 1 ml por MACS firmemente empurrando o êmbolo para a coluna. Recolher o eluído num tubo.
    NOTA: De modo a obter um grau de pureza> 98%, é geralmente necessário repetir os passos de 2,7-2,9) com uma segunda coluna.
11. Verifique a pureza das células por análise de FACS ¹⁸ com o mesmo painel de anticorpos, como anteriormente (ver 2.1.2) e contar as células.

3. Isolamento de Células T ⁺ Vδ1CD4

1. Ressuspender 25 ul de pérolas de CD4 com um vortex para> 30 seg. Lavar as pérolas (a quantidade mínima como descrito pelo fabricante) em 1 ml de tampão de MACS em um tubo de 1,5 ml de reacção, colocando o tubo num íman durante 1 min. Descartar o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta de pequena escala (200 mL) e ressuspender as esferas no volume original de tampão-MACS.
2. Pelotizar Vδ1 ⁺ células (centrifugar por 12 min; a 300 xg) e aspirar o sobrenadante e ressuspender as células todas Vδ1 ⁺ em 500 ul de tampão-MACS e adicioná-los para o tubo contendo os grânulos. Misturar vigorosamente e incubar durante 20 min a 4 ° C com inclinação constante (por exemplo, em um rotor).
3. Colocar o tubo contendo as células em um magnete durante 2 min. Certifique-se de que não existem vestígios na tampa.
   NOTA: As células T CD4 ^{+ terá} ligado a esferas magnéticas e anexar ao lado do tubo virado para o íman.
4. Abra cuidadosamente a tampa, mantendo o tubo no interior do dispositivo magnético e recolher o sobrenadante que contém o CD4 ^- células Vδ1 ⁺ utilizando uma pipeta de pequena escala. Coloque ^- CD4 ⁺ Vδ1 células para um tubo separado e colocar este tubo para o íman de novo para evitar possivelmente remanescente células CD4 ou grânulos a partir da população.
   1. Lava-se a CD4 ^- células em 5 ml de tampão-MACS (centrifuga-se durante 12 min; a 300 xg) umND ressuspender-los em uma concentração de 1 x 10 ⁵ células por 100 uL meios. ^- Células CD4 pode ser facilmente cultivado sob as condições dadas abaixo (4.2).
5. Colocar o tubo com os alvos ^de células CD4 + fora do campo magnético, ressuspender as células em 500 ul de tampão-MACS e colocá-los de volta para dentro do dispositivo magnético. Repita duas vezes os passos de 3,3-3,5 para obter uma pureza mais elevada. Remover o sobrenadante por pipetagem
6. Ressuspender as células ^CD4 + em meio de cultura 100 ul (RPMI 1640, 10% de FCS, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina) e adicionar 10 ul de uma solução destacando-grânulo. Incubar à temperatura ambiente durante 45 min com inclinação constante (por exemplo, em um rotor).
7. Colocar as células em um íman durante 1 min. Recolher cuidadosamente o sobrenadante contendo Vδ1 ^células CD4 + livre-talão com uma pipeta de pequena escala.
8. Fora do ímã, voltar a suspender as contas com meios de cultura de 100 ul e repitaos passos 3.6 e 3.7 por duas vezes para se obter números maiores de células ^de células CD4 +.
9. Peletizar as células (centrifugar a 300 xg, durante 12 minutos) e descartar o sobrenadante completamente por pipetagem. Ressuspender as células em meios frescos, pré-aquecido e contá-los. Examinar a pureza das células ^{CD4 +} Vδ1 por análise FACS descritos nos passos 2.1.1-2.1.3.

A clonagem de células 4. Único por diluição limitada

1. Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de um dador alogénico como representado na 1,1-1,6.
2. Irradiar 2,5 x ¹⁰ 7 PBMC alogénicas com 80 Gy em 25 ml de meio de cultura utilizando-γ radiação.
3. Adicionar IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) e PHA (2 ug / ml) para as células de alimentação irradiadas e distribuí-los em placas de 96 poços formato U, 5 x 10 ⁴ alimentador células em 50 ul por poço.
4. Diluir as células Vδ1 ^{CD4 +} a uma concentração de 0,3 células por 50 ul. Pipette 50 ul de solução de células em cada cavidade que abriga as células irradiadas e citocinas.
   NOTA: Assim, as citocinas são diluídas para a concentração final de 100 U / ml de IL-2, 10 ng / ml de IL-7 e 1 ug / ml de PHA. Incubar as placas de 96 cavidades em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ atmosfera humidificada.
   1. Opcionalmente, permanecendo cultivar células purificadas Vδ1 ^{+ CD4} + como a cultura em massa sob as mesmas condições de cultura como os clones.
5. Fornecer as células a cada 3-4 dias com citocinas e meios frescos. Para isso, a troca de metade do meio nos poços com 50 ul de meio fresco por pipetagem. Adicionar concentração duas vezes superior de citoquinas para cada suplementação. Adicionar 5x10 ⁴ células de alimentação irradiadas por poço qualquer outra rodada de alimentação.
6. Utilizando um microscópio, observar primeiros clones tornam-se visíveis após 3-4 semanas, como eles metabolizam e, assim, alterar a cor das colónias de meio de cultura e forma.
   NOTA: Para pelesterap cultivo, ressuspender os clones bem e transferi-los para separar placas de 96 poços. Analisar as células via FACS, conforme indicado na 2.1.1-2.1.3. Clones mantidos nestas condições poderá vir a alterar a sua TCR a partir Vδ1 para αβTCR. O ponto de tempo para esta transdiferenciação varia de clone para clonar.

Resultados

A Figura 1 ilustra as diferentes fases e o resultado do isolamento das células T Vδ1 do sangue periférico. Figura 1A mostra uma distribuição típica das células Vδ1 ⁺ em linfócitos CD3 ^+, bem como a expressão do co-receptor da população Vδ1 ^+. Neste dador, a frequência de células Vδ1 ⁺ (vermelho) é de 2,3% das contagens totais de linfócitos e a expressão de CD4 (verde) de linfócitos Vδ1 ⁺ é de 2,6%. No total, a ...

Discussão

Para estudar o fenótipo, biologia e função de uma entidade celular escassos (T-), nomeadamente células Vδ1 ^{+ T} CD4 +, foram utilizados dois marcadores: Vδ1 e CD4 por seu isolamento de células magnético positivo. Vδ1 é um receptor órfão, enquanto que CD4 é expresso em células T auxiliares, a um nível inferior em monócitos e células dendríticas, e a um nível muito baixo em células progenitoras hematopoiéticas.

As técnicas para o enriquecimento e a selecção de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D