분리 및<em&gt; 전의 VIVO</emVδ1의&gt; 문화<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조

요약

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

초록

흉선, αβ T 세포와 척추 동물에서 적응 면역계의 주쇄의 생성을위한 주요 기관은, 긴 αβT 세포의 공급원으로서 만 고려되고있다. 그러나, 흉선 퇴화는 주변에 순진 αβT 세포의 대폭 감소 출력에 이르는 인생의 초기에 시작됩니다. 그럼에도 불구하고, 심지어 백세인은 새로 인수 한 병원균에 대한 면역을 구축 할 수 있습니다. 최근의 연구 기능의 흉선 손실을 보상 할 수있다 경로의 그러나 우리의 이해는 여전히 rudimental 있으며, extrathymic αβT 전지 개발을 제안합니다. γδ ​​T 세포는 주 조직에서 T 세포 서브 세트를 구성 타고난 림프구이다. 우리는 최근 보여 γδ T 세포의 서브 세트에 지금까지 뛰어난 기능을 인정받지 기인하는 CD4의 부족한 엔티티 Vδ1 ^{+ +} γδ T 세포가 염증 상태의 세포 내로 αβT transdifferentiate있다. 여기, 우리 쪽말초 혈로부터이 선조의 분리 및 그 후속 재배 프로토콜 rovide. Vδ1 세포 양 우리가 상기 자성 라벨링 기술에 CD4 ⁺ 세포의 부족 부분을 대상으로 상기 제 2 단계이어서, 자성 비드를 이용하여 건강한 인간 공여자로부터의 PBMCs를 충실. 제 라벨링의 자력은 제 1 자기 라벨의 하나 초과하고, 따라서 관심 인구의 효율적인 양적 및 특정 양의 절연을 허용한다. 우리는 그 다음 세포를 복제하고 효율적으로 확장과 FACS 분석에 의해 생성 된 클론의 식별을 위해 필요한 기술과 문화 조건을 소개합니다. 따라서, 우리는 정제, 문화와 CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ T 세포의 생체 확장에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 지식이 αβT 세포 progenitor`s ​​생물학 관련 연구 및 IDE하는 것을 목표로 사람들을위한 전제 조건입니다그 분화에 관여하는 분자 트리거를 ntify.

서문

척추 동물에서 세포 및 면역의 체액 부분으로 구성되어 적응 면역은 병원체에 대한 방어에 중요한 역할을한다. 항원의 광범위한 인식은 T 세포와 관련하여 흉선 ^1에서 주로 생성되는 것으로 가정 hyperpolymorphic B 및 T- 세포 수용체 (TCR / BCR)에 의해 매개된다. 이에는 골수로부터 유도 된 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는, 흉선 시드 최종적 모든 T 세포 계통을 발생주고 잘 정의 된 스테이지를 따라 차별화. 및 CD8 ^{- -} 흉선 시드 조상은 CD4이며, 따라서 미성숙, 더블 네거티브 (DN) 흉선 세포의 일부를 구성한다. 흉선에서 유래 신호는 자신의 계보 헌신과 αβ 또는 γδ T 세포 중 하나에 분화를 유도. DN2 / 3 흉선 세포에 기능적으로 재 배열 된 TCR-γ 및 TCR-δ 사슬 유전자의 발현은 세포 증식의 드라이브 δTCR 단지를, γ에 이르게γ의 ΔT 세포 ^2,3로 분화를 촉진 거라고. 대조적으로, preTCR하여, Pt를 구축 preTα 페어링 수 기능적 TCR-β 사슬의 재 배열은, 전사 DN3의 흉선 세포의 TCR-γ 사슬의 사일런 및 CD4 ⁺ CD8 ⁺ 이중 양성 흉선 세포 ^(4)에 그들의 전이를 유도 . 이 단계에서, TCR-α 사슬의 재조합은 따라서 이들 세포 돌이킬 ^5-9 생산 γδTCR를 폐지, TCR-α 궤적 내에 멈춰서 TCR-δ 궤적 삭제를 발생한다. 재 배열 αβTCRs 이후자가 면역 (부정적인 선택)를 방지하기 위해 특정 임계 값을 초과 할 수 없습니다 약하게 (긍정적 인 선택을) 자기 MHC를 결합 할 수있는 능력, 선택됩니다. MHC 클래스 I 또는 II를 결합 그들의 능력에 따라, 선택된 셀 αβT은 단일 양성 CD4 ⁺ 또는 CD8 ⁺ T 세포, 흉선 출구로서 나이브 T 세포로 발달.

그러나, 흉선의 퇴화 일찍 거의 소멸 후 사춘기 ¹⁰ 나이브 T 세포의 기하 급수적으로 감소 출력에 최고의 인생에서 시작됩니다. 그럼에도 불구하고, T 세포 풀의 크기는 포스트 흉선 항상성 T 세포의 증식 및 수명이 긴 면역 메모리 ^(11)의 확산에 의해 부분적으로 만 설명 될 수 수명 내내 일정하게 유지된다. 따라서 extrathymic T 세포 발달이 발생한다. 최근의 연구-에서 extrathymic 기능 αβ T 세포 ^12-17을 초래 사이트 - 준 αβT 세포 전구 세포를 특징으로 상당한 매력을 얻고있다. 그러나, 흉선 독립적가 αβT 세포로 분화 extrathymic αβT 세포 전구체에 대한 자세한 지식은 우리가 그들이하여 수행 경로에있는 배경으로 단편이다.

우리는 최근 Vδ1 ^+의 작은 T 세포 개체를 식별 가벼운 염증 환경에서 αβT 세포에 transdifferentiate 수있는 건강한 인간 기증자의 말초 혈액에서 분리 extrathymic αβT 세포 prognitor ^(18), 같은 CD4 ⁺ γδT 세포. 흥미롭게 잠재적 새로운 항원을 인식 할 수 있도록, 따라서 레퍼토리의 다양성을 확대 후 흉선 T 세포의 항상성 증식 Vδ1 CD4 ⁺ 세포의 분화 새로운 T 세포 수용체를 생성하고, 반대로 보호 수도 새롭게 취득한 병원체에 대해 숙주. 이는 T 세포의 가소성에 가산 extrathymic T 세포 개발 원경 인정받지 새로운 경로를 추가한다.

대물이 αβT 셀 extrathymic 개발 precursor`s ​​트리거 이들 마커 분자를 식별하기위한 소스로부터 림프 정량적 격리는 단일 세포 클론의 발생 및 그 효율적인 확장이 필수적이다.

프로토콜

윤리 문 : 모든 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행하고, 튀빙겐 대학의 임상 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (38 / 2009B02 470 / 2013B02 프로젝트).

말초 혈액 단핵 세포의 1. 분리 (PBMC를)

1. 1,000 IU의 헤파린 황산을 포함하는 50 ML의 주사기를 사용하여 정맥 천자를 통해 건강한 지원자에서 50 ~ 100 mL를 취하여 혈액 1 희석 : PBS (PH = 7.2)과 (2).
2. 15 ml의 혈액 분리 솔루션에 PBS 용액 등 Biocoll로 (D = 1.077 ㎍ / ㎖) 50 ㎖에 원뿔 튜브 : 조심스럽게 혈액 35 ml의 레이어. 실온에서 800 XG에 15 분 동안 원심 분리기.
   참고 : 브레이크는 사용할 수 없습니다.
3. 피펫 림프 층의 세포를 수집하고, 적어도 50 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻어 (400 XG에서 12 분간 원심 분리). 피펫과 원심 분리 한 후 상층 액을 제거합니다.
4. 를 Lyse는 일시 중지 및 incub에 의해 적혈구 남아2-4 분간 저장성 완충액 1-5 mL를 림프 분획 ating.
   주 : 노광, 용균 완충액의 양 기간이 사용될 용균 버퍼와 림프구 분획에 남아 적혈구의 양에 의존한다.
5. 12 분 동안 250 XG에서 PBS (1시 10분)와 세포와 원심 분리기를 희석하고, 이후에 재현 탁하고 12 분 동안 300 XG에 10 ml의 PBS에 한 번 세포 펠렛을 씻는다.
6. PBS에서 림프구를 재현 탁하고 트리 판 블루에게 솔루션을 사용 노이 바 우어 계산 실에서 세포를 계산합니다.
   참고 : 일반적으로,> 1 × ⁸ 림프구가 100 ㎖에서받은 갓 말초 혈액을 그려.

Vδ1 T 세포의 격리 2.

1. Vδ1 CD4 T 세포의 빈도를 결정하는 초기 FACS를위한 <1 × ¹⁰⁶ 림프구 절연 걸릴.
   참고 :이 T 세포 개체의 인구 크기는 개인과 자신의 면역 상태에 따라 따라 크게 다를 수 있습니다. Typic아군, T 세포의 약 1 % 및 Vδ1 Vδ1 ^{+ +} 세포의 1~5 %의 시간 CD4 ^+이다.
   1. PBS가 2 % FCS, 5 mM의 EDTA를 함유하는 1 ml의 이루어져의 FACS 완충액으로 세포를 희석. 2 분 동안 660 XG에 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다. 약 100 ㎕의 FACS 완충액 환류 량은 후속 염색 충분하다. 간단히 소용돌이 5 μL는 FACS 염색의 증가 특이성을 실온에서 5 분 동안 시약 된 Fc-차단과 세포를 품어.
   2. 은 FC-차단 시약을 제거하지 않고 세포에 직접 인간 단일 클론 항체를 추가합니다. , CD8 (1 : 200)와 TCRαβ (1시 25분) : Vδ1 (1시 50분), CD3 (1시 50분), CD4 (200 1)에 대한 항체와 세포를 염색해야합니다. 해당 면역 글로불린 아이소 타입과 이소 제어를 준비합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 항체와 세포를 품어.
   3. (2 분 동안 원심 분리, 660 XG에) 1 ML의 외과 버퍼에 세포를 씻으, supern을 가만히 따르다atant 나머지 버퍼 볼륨 외과 인수를 진행합니다.
2. 12 분 동안 원심 분리하여 (FACS 분석에 사용되지 않는다) 세포를 펠릿 화; 300g에; 8 ° C. 상층 액을 제거하고 1 × 10 ⁷ 세포 당 60 μL의 맥 버퍼 pelletin 셀을 재현 탁. 1 × 10 ⁷ 세포 당 20 μL 된 Fc-차단 시약을 추가하고 4 ℃에서 5 분 동안 품어.
3. 직접 세포에 1 × 10 ⁷ 세포 당 10 μL FITC - 복합 항 - 인간 Vδ1 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 12 분 동안 품어.
4. 14 ml의 맥 버퍼를 사용하여 세포를 세척 (12 분 동안 원심 분리기를 300 g에서 8 ° C)를. 완전히 뜨는을 취소하고 1 × ⁷ 세포 당 80 μL의 맥 버퍼에있는 세포를 재현 탁.
5. 1-2 × 10 ⁵ 세포를 가지고 FACS 분석하여 라벨의 확인을 위해 100 μL FACS 버퍼를 희석. 더 이상의 첨가제는이 단계에서 필요하지 않습니다. suffi이 있는지 확인Vδ1의 밝기 효율적인 차이 ^- 그리고 Vδ1 ⁺ 세포. 그렇지 않은 경우, 반복) 2.3) 2.4 단계.
6. 나머지 셀에 1 × 10 ⁷ 세포 당 20 μl를 방지 FITC 마이크로 비드를 추가, 잘 ​​섞는다 4 ° C에서 어둠 속에서 15 분 동안 품어. 그 후, (300 XG에서 12 분 동안 원심 분리기 8 ° C)를 최소 10 ml의 맥 버퍼를 사용하여 세포를 씻으십시오.
7. 원심 분리 동안, 500 μL의 맥 버퍼와 자석에 배치 미리 냉각 자기 열 평형.
8. (세포 수보다 높은 1 × ^8이 볼륨 따라 규모를 확대) 500 μL의 MACS-버퍼에 세포를 재현 탁하고 컬럼에 조심스럽게 세포를 적용합니다. Vδ1 함유 관류 수집 ^- 셀.
9. 500 μL의 맥 버퍼로 열 세 번 세척하고 같은 튜브에 다시 흐름을 통해 수집합니다. 저수지 컬럼에 버퍼를 적용하기 전에 비어 있어야합니다.
10. 자기 장치에서 열을 제거하고 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. 빨리 단단히 열에 플런저를 밀어 1 ml의 맥 버퍼와 컬럼을 세척하십시오. 튜브에 용출액을 수집합니다.
    주 :> 98 %의 순도를 얻기 위해, 그것은 일반적으로 반복 할 필요가 초 컬럼) 2.7부터 2.9까지 단계.
11. (2.1.2 참조) 이전과 같은 항체 패널 FACS 분석 ^(18)에 의해 세포의 순도를 확인하고 세포를 카운트.

Vδ1CD4 ⁺ T 세포의 3. 분리

1. > 30 초 동안 소용돌이와 CD4 비즈의 25 μl를 재현 탁. 1 분 동안 자석에 튜브를 배치하여 1.5 ml의 반응 튜브에 1 ㎖의 MACS 완충액 비드 (제조자에 의해 도시 된 바와 같이 최소한의 양)을 세척한다. 작은 규모의 피펫 (200 μL) 조심스럽게 뜨는을 취소하고 맥 버퍼의 원래 볼륨에서 구슬을 재현 탁.
2. 1 Vδ1 ⁺ 세포 (원심 분리기를 펠릿2 분; 등) 300 XG에서하면 뜨는을 대기음 500 μL의 맥 버퍼의 모든 Vδ1 ⁺ 세포를 재현 탁하고 구슬이 들어있는 튜브에 추가합니다. 적극적으로 믹스 (회 전자에서, 예를 들어) 일정한 경사와 4 ° C에서 20 분 동안 품어.
3. 2 분 동안 자석에 세포를 포함하는 튜브를 놓는다. 뚜껑에는 잔해가 없는지 확인합니다.
   주 : CD4 ^{+ 세포는} 자성 비드를 결합하고 자석에 대향 관의 측면에 부착 한 것이다.
4. 소규모 피펫을 사용하여 Vδ1가 ⁺ 세포를 ^- 조심스럽게 자기 장치 내부에 튜브를 유지하면서 뚜껑을 열고 CD4이 포함 된 상층 액을 수집합니다. 별도의 튜브에 Vδ1가 ⁺ 세포 인구에서 CD4 세포 또는 구슬 남아 가능성 피하기 위해 다시 자석으로이 관을 배치 ^- CD4를 놓습니다.
   1. CD4 워시 ^- 세포를 5 ml의 맥 - 버퍼 (원심 분리기 12 분 동안 300 XG에)ND 100 μL 용지 당 1 × ¹⁰⁵ 세포의 농도로 재현 탁 그들을. CD4 ^- 세포 용이 (4.2) 아래에 주어진 조건에서 재배 할 수있다.
5. , 외부 자계의 CD4 ^{+ 세포} 표적과 관을 배치 500 μL의 MACS 완충액에 세포를 재현 탁하고, 자기 장치에 다시 넣어. 반복은 더 높은 순도를 얻기 위해 두 번 3.3-3.5 단계를 반복합니다. 피펫으로 상층 액을 제거
6. 100 μL 문화 미디어에서 CD4 ⁺ 세포 (RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % L 글루타민, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신)를 재현 탁하고 비드 분리 용액 10 μl를 추가합니다. 일정한 경사 (예를 들면, 회전)에 45 분 동안 RT에서 배양한다.
7. 1 분 동안 자석에서 세포를 놓습니다. 신중 소규모 피펫을 사용하여 비드없는 Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ 세포를 포함하는 상층 액을 모은다.
8. 자석의 외부, 100 μL 문화 미디어와 반복과 구슬을 재현 탁CD4 ^{+ 세포의} 높은 세포 수를 얻기 위해 두 번 3.6 및 3.7 단계를 반복합니다.
9. 세포를 펠릿 화 (12 분, 300 XG에 원심 분리기)와 피펫 팅에 의해 완전히 상층 액을 버린다. 신선한, 미리 예열 미디어 세포를 재현 탁하고이를 계산합니다. 2.1.1-2.1.3 단계에 묘사 된 FACS 분석에 의해 Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ 세포의 순도를 검사합니다.

제한 희석 4. 단일 세포 복제

1. 1.1-1.6에 도시 된 바와 같이, 동종 기증자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리.
2. γ 방사선을 사용하여 25 ml의 배양 배지에서 80 Gy를 2.5 × 10 ⁷ 동종 PBMC를 조사.
3. 96- 웰 U 형 플레이트에 5 × ¹⁰⁴ 공급기들을 조사 피더 세포에 IL-2 (200 U / ㎖), IL-7 (20 NG / ㎖) 및 PHA (2 μg의 / ㎖)를 첨가하고, 분산 물론 당 50 μL 세포.
4. 50 μL 당 0.3 세포의 농도로 Vδ1 ⁺ CD4 ^{+ 세포를} 희석. 피펫TE 각 웰 조사 세포 및 사이토 카인에 형질 세포 용액 50 μL.
   주 : 따라서, 사이토 카인을 100 U / ㎖의 IL-2, 10 NG / ml의 IL-7 및 1 μg의 / ㎖의 PHA의 최종 농도로 희석된다. 37 ° C, 5 % CO ₂ 분위기에서 가습 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 배양한다.
   1. 선택적으로, 클론과 동일한 배양 조건에서 대량으로 배양 Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ 세포를 정제하고 남은 배양.
5. 사이토 카인과 신선한 미디어 3-4 일마다 세포를 제공합니다. 이를 위해, 50 μL 피펫 신선한 배지로 웰에 배지 교환 절반. 모든 보충에 사이토 카인의 2 배 농도를 추가합니다. 수유 아니라 다른 모든 라운드 당 5 × ⁴ 조사 피더 세포를 추가합니다.
6. 배지 및 콜로니 형태의 색상을 변경할 따라서 그들은 대사로서, 제 클론 3-4 주 후 가시가 관찰하고, 현미경 사용.
   참고 : 모피를 들어THER 재배, 잘 클론을 재현 탁하고 96 웰 플레이트를 분리 전송합니다. 2.1.1-2.1.3에서 나타낸 바와 같이 FACS를 통해 세포를 분석한다. 이러한 조건에서 유지 클론은 결국 αβTCR에 Vδ1에서 자신의 TCR을 변경할 수 있습니다. 이 분화에 대한 시점은 복제하는 복제에 따라 다릅니다.

결과

도 1은 다른 단계 및 말초 혈액으로부터 Vδ1 T 세포의 분리의 결과를 도시한다.도 1a는 CD3 ⁺ 림프구 Vδ1 ⁺ 세포의 전형적인 분포뿐만 아니라 Vδ1 ^{+ 인구의} 공 수용체의 발현을 나타낸다. 이 도너에서 Vδ1 ⁺ 세포 (적색)의 주파수는 총 림프구 수가 2.3 %이고 Vδ1 ⁺ 림프구의 CD4 발현 (녹색) 2.6 %이다. 요컨대, 분리를위한 표적 집단이 도너의 ...

토론

긍정적 자기 세포 분리를 위해 Vδ1 및 CD4 : 부족한 (T-) 세포의 표현형 엔티티, 생물학 및 기능을 연구하기 위해, 즉 Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ T 세포, 우리는 두 개의 마커를 사용 하였다. CD4가 단핵 세포 및 수상 세포에 낮은 레벨, T 헬퍼 세포에 발현 한 조혈 전구 세포에 매우 낮은 레벨에있는 반면 Vδ1는 고아 수용체이다.

고순도 세포 농축하고 선택하기위한 기술은 형광 세?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D