الاستنساخ وظيفية باستخدام<em&gt; القيطم</em&gt; نظام التعبير البويضة

Summary

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Abstract

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Introduction

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية من جامعة فرجينيا رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام.

ملاحظة: يبين الشكل 1 عرضا عاما للإجراءات التجريبية.

1. إعداد البويضات

1. X. قبل رئيس المورق الإناث مع 150 U من الحوامل ماري المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) أسبوع واحد تقريبا في وقت مبكر من بويضة والعزلة. حقن 1 مل 150 U / مل PMSG في ظهري الليمفاوية الكيس مع 1 سم مكعب محقنة معقمة مع 29 G الإبرة.
2. إعداد الحلول لحقن البويضة والبويضة والحيوان قبعة الفحص.
   1. إعداد كا ⁺⁺ / مغ ⁺⁺ خالية OR2 (OR2-): 82 مم كلوريد الصوديوم، و 2.5 ملي بوكل، 1.5 ملي _نا 2 هبو ₄ و 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.2.
   2. إعداد OR2: OR2- زائد 1 ملم CaCl ₂ و 1 ملي MgCl _2.
   3. إعداد OCM: 60٪ يبوفيتش L15، 0.4 ملغ / مل BSA، 100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، ودرجة الحموضة 7.8.
   4. قبلحلج 1X MBS: 88 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم بوكل، 0.7 ملي CaCl _2، 1 ملي MgSO _4، 5 ملي HEPES (درجة الحموضة 7.8)، و 2.5 ملي NaHCO _3.
   5. إعداد 3٪ Ficoll في 1X MBS.
   6. إعداد 1X حركة عدم الانحياز: 110 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي بوكل، 1 ملي كا (NO _{3) 2،} 1 ملي MgSO _4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم NaHCO _3، 2 ملي نا ₃ PO _4، ودرجة الحموضة 7.4.
3. تخدير الأنثى في حل 0،03٪ من إيثيل الملح methanesulfonate 3-أمينوبنزوات (MS222) في 0.1X MBS (أولا حل 0.3 غرام MS222 في 10 مل 95٪ من الإيثانول، ثم تمييع في 1 L 0.1X MBS) عن طريق وضع الضفدع في حل ل 10-15 دقيقة أو حتى لا تستجيب.
   1. تأكد من أن التخدير اكتمال التي تحول الضفدع تخدير على ظهرها للتأكد من أنه لا يستجيب (غير كامل الضفادع تخدير تتحرك أطرافه أو تحويل الجسم أكثر من ذلك).
4. عزل جراحيا شظايا المبيض عن طريق شق البطن خلال الجلد وجدار الجسم مع شفرة مشرط، عزل أنسجة المبيض مع ملقطوالمقص. وضع شظايا المبيض إلى OR2-. إغلاق جدار الجسم مع خياطة 3-0 الحرير على 24 ملم إبرة مقوسة وإغلاق الجلد بشكل منفصل مع نفس الغرز. السماح باستعادة الإناث في 1 غرام / لتر ماء الملح في الماء.
5. باستخدام ملقط غرامة، أنسجة المبيض المسيل للدموع إلى أقسام صغيرة (10-20 البويضات) قطع ونقل إلى OR2- الطازجة.
6. شظايا المبيض Defolliculate في 2.0 ملغ / مل كولاجيناز A في OR2- من خلال استثارة بلطف على شاكر لمدة 1 ساعة، ونقل إلى كولاجيناز الطازجة والتحريض على ساعة إضافية واحدة.
7. غسل البويضات 10 مرات في OR2 [التي تحتوي على الكالسيوم ⁺⁺ / مغ ^++]، ونبذ البويضات أصغر.
8. غسل البويضات في OCM مرتين ونقل إلى OCM الطازجة. عزل البويضات المرحلة السادسة من حيث الحجم على الفحص البصري وتجاهل غير ناضجة (أصغر) البويضات: البويضات المرحلة السادسة هي أكبر من البويضات غير الناضجة حتى مع تصبغ في نصف الكرة الحيوانية وما يقرب من 1،2-1،4 مم في القطر.
9. الحفاظ على البويضات في 18-20 ° C طن OCM قبل الحقن. ملاحظة: يمكن استخدام أطباق بتري الاغاروز المغلفة لتقليل التصاق البويضات إلى طبق.

2. حقن مكتبة النصوص

1. إعداد مكتبة [كدنا اتجاهي ¹⁵ باستخدام الحمض النووي الريبي المستخرج في مرحلة مناسبة للتنمية (على سبيل المثال، لوحة العصبية المرحلة 14 ^10). شراء مكتبة كدنا] أو إنشاء واحد باستخدام مجموعة تجارية في نظرة عامة في الخطوات الأربع التالية.
   1. عزل ما يقرب من 5 ميكروغرام مرنا باستخدام منتج لإثراء للبولي (A) + RNA (انظر الجدول المواد) وبعد تعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: النصوص المستخدمة في إنتاج مكتبة [كدنا يجوز تقييد إلى الأنسجة حمل (مثل لوحة العصبية، بعد تسليخ مجهري من النسيج المطلوب)، أو قد تكون من أجنة كاملة في مرحلة معينة.
   2. إنتاج كدنا] مع مجموعة تجارية، في أعقاب توجيهات المصنع.
   3. Ligate ما يقرب من 20 نانوغرام [كدنا إلى vectoص تضمينها مع مجموعة تجارية أو ناقلات أخرى مناسبة. يتضمن ناقلات البلازميد المناسب تسلسل للاستقرار مرنا مثل 5 "β-غلوبين و 3 بولي (A) تسلسل (pCS2 +، pTnT، pCS105).
   4. تحويل ربط إلى الخلايا البكتيرية المختصة باستخدام بروتوكول المورد الموصى بها للتحول الصدمة الحرارية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، مجموعة من إطار القراءة المفتوح (ORFeome) استنساخ متاح تجاريا، ويمكن استخدامه لتوليد النصوص للحقن.
2. إعداد 10 برك من البلازميدات من ¹⁰ مارس - 10 أبريل التعقيد ⁽¹⁰ أبريل - 10 مايو الكلي التعقيد). وهذا يمثل 10 مع لوحات 1000 - 10000 المستعمرات لكل منهما.
   1. مكتبة وحة الثقافة على 10 لوحات 15 سم LB-الأمبيسلين، وتنمو 12-18 ساعة عند 37 ج، وجمع المستعمرات من كل بواسطة ضغط لطيف مع رش الزجاج في 7 مل LB.
   2. إعداد المخزون الجلسرين من 0.5 مل (إضافة إلى 0.2 مل الجلسرين العقيمة وتخزينها في -20 &# 730؛ C)، واستخدم مل 6.5 المتبقية لإعداد DNA مع المعايير المتاحة تجاريا عدة DNA miniprep التالية توجيهات المصنع.
3. خطي DNA البلازميد المجمعة (1،0-2،0 ميكروغرام) مع تقييد انزيم الهضم المناسب ¹⁶ في 37 مئوية لمدة 1-1،5 ساعة. عزل DNA خطي مع استخراج الفينول / كلوروفورم تليها هطول الأمطار الإيثانول وإعادة تعليق في الماء فقا لمواصفات عدة RNA البلمرة المستخدمة. توليف الشعور RNA مع مجموعة RNA البلمرة التجارية التالية توجيهات المصنع.
4. تعد الإبر ل microinjection (باستخدام إبرة مجتذب مع أنابيب الزجاج الشعرية) ما يقرب من 20 ميكرون قطر. قياس نصائح إبرة في المجهر المركب مع ميكرومتر بصري معايرة. ملاحظة: يجب أن تكون إعدادات مجتذب إبرة العزم تجريبيا لإنتاج إبرة مع طرف ما يرام بحيث عندما كسر مع ملقط غرامة تعطي حجم غيض المطلوب.
5. استعد (دفع الطين إلىطبقة موحدة على الجزء السفلي من طبق) 35 × 10 مم أطباق بتري مع الأخاديد موازية لعقد البويضات في المكان خلال microinjection مبطنة الطين. إنتاج الأخاديد مع لجنة التحقيق مول أو ماصة باستير تنصهر في الطرف في اللهب. كبديل للطين، وإعداد أطباق الاغاروز مما يجعل المسافات البادئة مع قالب المطاط الصناعي ^17. نقل البويضات مع ماصة واسعة الجوف إلى 3٪ Ficoll في 1X MBS (حوالي 2 مل) في الصفوف في أطباق مبطنة الطين.
6. باستخدام microinjector، وملء إبرة مع 1 نانوغرام / RNA نيكولا لانغ وضبط التوازن لإنتاج ضغط إيجابي طفيف (لمنع وضع بويضة من السيتوبلازم).
7. حقن البويضات مع ما يقرب من 20 RNA نيكولا لانغ في المنطقة الاستوائية. السماح 1 ساعة لحقن البويضات للبقاء في Ficoll MBS-ثم نقل بلطف ل1X MBS. احتضان لمدة 8-24 ساعة عند 20 درجة مئوية قبل الغطاء الحيواني الفحص.

3. الحيوان كاب الفحص

1. إعداد 3 / 4X حركة عدم الانحياز والحصول على ملقط غرامة، حلقة الشعر، شظايا ساترة المنحنية، ديس مبطنة الطين[هس مع المسافات البادئة على شكل كوب لعقد البويضات. جعل شظايا ساترة المنحنية التي تفكك coverslips الزجاج إلى أجزاء صغيرة (حوالي 1-2 مم × 2-4 ملم) ومرورا اللهب حتى حواف البولندية وتدلى، وتنتج قطعة المنحني.
2. تسميد X. المورق البيض ¹⁸ في المختبر من خلال التزاوج أو الطبيعي والثقافة لالمعيدة مراحل (10-11 ساعة بعد الإخصاب في RT) في 0.1X MBS قبل الفرز حسب المرحلة؛ جمع منتصف المعيدة (المرحلة 11-11،5) ¹⁰ الأجنة.
3. ونقل الأجنة إلى طبق بتري ما يقرب من نصف كامل مع 3 / 4X حركة عدم الانحياز. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، وإزالة الإخصاب (المحي) غشاء من gastrulae.
4. نقل البويضات إلى 3 / 4X NAM (حوالي 2 مل) في أطباق مبطنة الطين وشل في عدد مرات الظهور الفردية في الطين، وإنتاج الانطباعات لاستيعاب الأجنة الفردية كما وصفت الأخاديد أعلاه.
5. ونقل الأجنة إلى أطباق مبطنة الطين وقطع القبعات الحيوان ز قبالةastrulae باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة. احرص على عزل سقف الأديم الظاهر الحيوانية فقط وليس الأنسجة الاستوائية ^18.
6. وضع الغطاء الحيواني في نصف الكرة الحيوانات من كل بويضة مع السطح الداخلي للغطاء الحيوان الاتصال البويضة. عقد recombinants معا من خلال تطبيق الزجاج المنحني ساترة جزء والضغط النزولي على الزجاج، تسطيح الأديم الظاهر مثل الاتصالات ساترة الطين (القبعات الحيوان يمكن أن تظل مفتوحة مع الطبقة الداخلية تتعرض لسطح البويضة ل6-8 ساعة أو أكثر ).
   ملاحظة: بدلا من ذلك، ضع الغطاء الحيواني الى تسنن الطين مع سطحه الداخلي التي تواجه صعودا ووضع البويضة على الغطاء. تأمين المؤتلف مع ملحقات صغيرة من الطين.
7. الثقافة عند 20 درجة مئوية حتى الأجنة السيطرة تصل إلى المستوى المطلوب للمرحلة الفحص.
8. المؤتلف منفصل عن طريق إزالة ساترة / الطين وعزل الأديم الظاهر مع ملقط وحلقة الشعر.
9. إصلاح شظايا الأدمة لمدة 1 ساعة في MEMFA (3.8٪الفورمالديهايد في MEM [0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.4، 2 مم EGTA، و 1 ملي MgSO _4]).
10. شظايا نقل (والأجنة السيطرة) من MEMFA إلى إيثانول وتخزينها في -20 مئوية.

4. تحليل الاستجابة في الأدمة من قبل في الموقع التهجين (ISH)

1. إعداد الحلول لISH.
   1. إعداد برنامج تلفزيوني 1X: 0.01 M الفوسفات مخزنة المالحة، كلوريد الصوديوم 0.138 M، ودرجة الحموضة 7.4
   2. إعداد برنامج تلفزيوني توين (PTW) ما يلي: 1X PBS، 0.1٪ توين-20
   3. يعد حل 100X Denhart في: 2٪ BSA، 2٪ بوفيدون، 2٪ Ficoll
   4. إعداد التهجين العازلة: 50٪ الفورماميد، 5X SSC، 1 ملغ / مل بالمستخفيات الخميرة RNA، 1 ميكروغرام / مل الهيبارين، والحل 1X Denhart، وبنسبة 0.1٪ 0.1٪ CHAPS، 10 ملي EDTA توين-20، DEPC-H _{2 O}
   5. إعداد حمض المالئيك العازلة (MAB): 100 ملم حمض الماليك، 150 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5
   6. إعداد MAB + كتلة: MAB، 2٪ عرقلة كاشف (الحرارة إلى 60 مئوية إلى حل)
   7. إعداد الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) العازلة: 100 ملي تريسدرجة الحموضة 9.5، 50 ملي MgCl _2، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ توين، درهم _{2 O}
2. إعداد RNA التحقيق.
   1. استخدام عدة RNA البلمرة التجارية وحفر-NTP المزيج، إضافة إلى أنبوب 1.5 مل (50 ميكرولتر رد فعل): 25.5 ميكرولتر DEPC-H ₂ O، 10 ميكرولتر 5X النسخ الاحتياطي، 2.5 ميكرولتر 10X حفر-NTP المزيج، 5 ميكرولتر 100 ملي DTT، 2 ميكرولتر RNAsin، 2 ميكرولتر قالب DNA خطي (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر)، 3 ميكرولتر RNA البلمرة واحتضان 37 مئوية لمدة 90 دقيقة.
   2. إضافة 2 ميكرولتر RNA البلمرة واحتضان 37 مئوية لمدة 60 دقيقة.
   3. تحقق 2 ميكرولتر من رد فعل على 1٪ agarose هلام.
   4. إضافة 1 ميكرولتر RQ1-ريبونوكلياز مجانا الدناز واحتضان 37 مئوية لمدة 20 دقيقة.
   5. يعجل التحقيق بإضافة 50 ميكرولتر DEPC-H ₂ O، 25 ميكرولتر 10 M الأمونيوم خلات و 313 ميكرولتر الايثانول. مخزن في -20 مئوية خلال الليل (يا / N) ثم استعادة RNA بواسطة الطرد المركزي في 13800 x ج لمدة 20 دقيقة. يغسل مع 500 ميكرولتر الايثانول 75٪، وتدور لفترة وجيزة، وإزالةالإيثانول والسماح بيليه الهواء الجاف. إضافة 50 ميكرولتر DEPC-H ₂ O.
   6. إضافة التهجين العازلة للتركيز النهائي من ~ 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر.
3. إعداد الأنسجة لالتهجين. ما لم يذكر خلاف ذلك، وملء قارورة إلى الأعلى مع كل تغيير الحل هو موضح (حوالي 4 مل).
   1. إزالة الإيثانول من قوارير ونقل الأجنة إلى 75٪ من الإيثانول / PTW، ثم 50٪ من الإيثانول / PTW لمدة 10 دقيقة لكل منهما، أفقيا على الروك.
   2. يغسل ثلاث مرات في PTW لمدة 5 دقائق كل يوم الروك.
   3. نقل إلى 10 ميكروغرام / ميكرولتر بروتين K العلاج في PTW. أنابيب الصخور عموديا 15 دقيقة.
   4. شطف مرتين كل 10 دقيقة في 0.1 M ترايثولامين درجة الحموضة 7.8 - أنابيب الصخور عموديا.
   5. إضافة 12.5 ميكرولتر أنهيدريد الخل إلى أنابيب والصخور عموديا 5 دقائق. كرر مع إضافي 12.5 ميكرولتر أنهيدريد الخل لمدة 5 دقائق.
   6. يغسل في PTW 5 دقائق عموديا على الروك.
   7. Refix في 4٪ امتصاص العرق 20 دقيقة على الروك. الحرارة التهجين العازلةإلى 60 مئوية.
   8. يغسل ثلاث مرات في PTW لمدة 5 دقائق كل يوم الروك.
   9. إزالة كافة ولكن ~ 1 مل من PTW من كل أنبوب وإضافة 250 ميكرولتر HYB العازلة. دوامة بلطف أنابيب لخلط. أنابيب الصخور عموديا 5 دقائق.
   10. استبدال 60 ج HYB العازلة (0.5 مل)، وتستنهض الهمم بلطف في 60 ج 10 دقيقة. استبدال الطازجة HYB العازلة وتستنهض الهمم في 60 ج سنتين إلى 4 ساعات.
   11. مسبار الحرارة (1 مل عند 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر في HYB الواق) إلى 60 ج (3 دقائق). إزالة HYB العازلة وإضافة التحقيق لأنابيب. تستنهض الهمم بلطف O / N عند 60 مئوية.
4. إعداد الأنسجة لجسم.
   1. دافئ HYB العازلة و2X SSC + 0.1٪ توين-20 حلول ل60 مئوية.
   2. استبدال حل التحقيق مع HYB العازلة (حفظ تحقيقات في -20 مئوية لمدة 2 - 3X إعادة الاستخدام). يغسل في 60 مئوية لمدة 10 دقيقة.
   3. يغسل ثلاث مرات في 60 مئوية في 2X SSC-توين (20 دقيقة لكل منهما مع الإثارة).
   4. يغسل ثلاث مرات في 60 مئوية في 0.2x SSC-توين (20 دقيقة لكل منهما مع الإثارة).
   5. يغسل مرتين في MAB (RT) لمدة 15 دقيقة لكل منهما أفقيا على الروك.
   6. إضافة 1 مل MAB + كتلة. غسل 2 ساعة عموديا على الروك.
   7. نقل إلى 1 مل MAB + كتلة تحتوي على 1/2000 لمكافحة digoxygenin-AP. صخرة عموديا في 4 CO / N.
5. إعداد الأنسجة لاللون الكاشف.
   1. استبدال حل الأجسام المضادة مع MAB؛ يغسل ثلاث مرات في MAB 5 دقائق كل أفقيا على الروك.
   2. يغسل ثلاث مرات في MAB 1 ساعة كل أفقيا على الروك.
   3. يغسل مرتين في AP العازلة 10 دقيقة كل أفقيا على الروك.
   4. نقل الأنسجة لعدة جيدا علبة من البلاستيك، وإزالة AP العازلة وإضافة BM كاشف الأرجواني (~ 1 مل). السماح رد فعل على المضي قدما في الظلام 5 دقائق لO / N.
   5. عندما يتحقق تلطيخ المناسب، ونقل الأنسجة إلى قارورة من PTW. غسل مرتين كل 10 دقيقة في PTW على الروك.
   6. إصلاح في حل بوان في 4 CO / N على الروك.
   7. تغسل في بوين مع ثلاثة الايثانول 70٪ / 30٪ PTW يغسل في RT. المضي قدما رس التقاط الصور باستخدام برنامج التحصين الموسع في الإضاءة والكاميرا محمولة على المجهر، وتبيض إذا لزم الأمر ^18.

5. السيب اختيار والاستنساخ

1. حدد التجمع مع أعلى نشاط (أعظم استجابة في أنسجة الأدمة).
2. عاير (تمييع مع LB الكثافة المناسبة) الأسهم الجلسرين لتجمع وفقا لأعلى نشاط ولوحة من لوحات عشر الجديدة مع ما يقرب من واحد على عشرة المستعمرات من الخطوة السابقة (باستخدام الجزء 2 في بروتوكول أعلاه).
3. تقليل حجم تجمع حتى يتم تتبع النشاط إلى مستعمرة واحدة.
4. الحصول على تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات القياسية في ناقلات.

النتائج

ردا على التعبير مرنا حقنها في البويضات، والاستجابة الأنسجة الغطاء الحيواني ويعاير للتعبير عن otx2 بواسطة التهجين الموضعي (الشكل 2 والجدول 1) في؛ وأعرب otx2 في الأديم الظاهر عدسة الظني (PLE) من العصبية إغلاق الأنبوب من خلال عدس?...

Discussion

الطريقة الموضحة هنا لاستنساخ وظيفي من الجينات قادرة على إحداث استجابة في الأديم الظاهر المختصة يمكن أن تستخدم لتحديد مجموعة واسعة من المنتجات الجينات. توسع هذه الطريقة على عمل في الماضي من خلال الجمع بين المقايسات الذي يحفز الأنسجة مع تقنيات الاستنساخ التعبير. نحن ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library