Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Resumen

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Resumen

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Introducción

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Universidad de Virginia Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

Nota: La figura 1 muestra una vista general esquemática de los procedimientos experimentales.

1. Preparación de ovocitos

1. X. Pre-prime laevis hembras con 150 U de Mare embarazada suero de gonadotropina (PMSG) aproximadamente una semana antes de que el aislamiento de los ovocitos. Inyectar 1 ml 150 U / ml PMSG en dorsal linfático salida con 1 cc jeringa estéril con 29 G aguja.
2. Preparar soluciones para inyección de ovocitos y ensayo casquillo ovocito-animal.
   1. Preparar Ca ⁺⁺ / Mg ⁺⁺ exento de OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, KCl 2,5 mM, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, 50 mM HEPES pH 7,2.
   2. Preparar OR2: OR2- más 1 mM _CaCl2 y _MgCl2 1 _mM.
   3. Preparar OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 mg / ml de gentamicina, pH 7,8.
   4. Prepare MBS 1x: NaCl 88 mM, 1 mM de KCl, 0,7 mM CaCl _2, 1 mM MgSO _4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO _3.
   5. Preparar 3% de Ficoll en 1X MBS.
   6. Preparar NAM 1x: NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO _{3) 2,} 1 mM MgSO _4, EDTA 0,1 mM, 1 mM NaHCO _3, 2 mM Na ₃ PO _4, pH 7,4.
3. Anestesiar la hembra en una solución al 0,03% de acetato de sal metanosulfonato 3-aminobenzoato (MS222) en 0,1x MBS (primero disolver 0,3 g MS222 en etanol 10 ml de 95%, luego se diluye en 1 litro MBS 0,1x) mediante la colocación de rana en solución para 10-15 minutos o hasta que no responde.
   1. Compruebe que la anestesia es completa girando rana anestesiado sobre su espalda para asegurarse de que no responde (incompletamente ranas anestesiados mover las extremidades o girar el cuerpo más).
4. Quirúrgicamente aislar fragmentos de ovario haciendo una incisión abdominal a través de la piel y la pared del cuerpo con hoja de bisturí, aislando tejido ovárico con pinzasy tijeras. Coloque fragmentos de ovario en OR2-. Cierre la pared del cuerpo con una sutura de seda 3-0 en una aguja curva de 24 mm y cierre la piel por separado con los mismos puntos de sutura. Permitir la recuperación de la hembra en 1 g / l de sal de acuario en el agua.
5. Con unas pinzas finas, tejido ovárico lágrima en pequeños (10 - 20 ovocitos) piezas y traslado al OR2- fresco.
6. Fragmentos de ovario Defolliculate en 2,0 mg / ml de colagenasa A en OR2- agitando suavemente en un agitador durante 1 hora, la transferencia a colagenasa fresco y agitar durante una hora adicional.
7. Lavar ovocitos 10 veces en OR2 [que contienen Ca ⁺⁺ / Mg ^++], descartando ovocitos pequeños.
8. Lave ovocitos en OCM dos veces y traslado al fresco OCM. Aislar ovocitos Etapa VI por tamaño después de una inspección visual y desechar ovocitos inmaduros (más pequeñas): Etapa VI ovocitos son más grandes que los ovocitos inmaduros con pigmentación incluso en el hemisferio animales y son de aproximadamente 1,2-1,4 mm de diámetro.
9. Mantener ovocitos a 18-20 ° C in OCM antes de la inyección. Nota: placas de Petri recubiertas de agarosa se pueden utilizar para minimizar la adherencia de los ovocitos a plato.

2. La inyección de transcripciones Library

1. Preparar una biblioteca de cDNA direccional ¹⁵ usando ARN extraído en una etapa apropiada de desarrollo (por ejemplo, la etapa placa neural 14 ^10). Compra una biblioteca de ADNc o construir uno usando un kit comercial por la visión general en los cuatro pasos siguientes.
   1. Aislar aproximadamente 5 g de ARNm mediante el uso de un producto para enriquecer en poli (A) + RNA (Ver Tabla de Materiales) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: Las transcripciones que se utilizarán para producir la biblioteca de cDNA puede ser restringido a un tejido induciendo (tal como la placa neural, después de microdisección del tejido deseado), o pueden ser a partir de embriones enteros en una etapa particular.
   2. Producir ADNc con un kit comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante.
   3. Ligar aproximadamente 20 ng de ADNc en un vector incluido con el kit comercial u otro vector adecuado. Un vector de plásmido apropiado incluye secuencias para la estabilidad del ARNm tales como 5 'β-globina y 3 de poli (A) secuencias (pCS2 +, pTnT, pCS105).
   4. Transformar ligación en células bacterianas competentes utilizando el protocolo recomendado por proveedor para la transformación de choque térmico.
      Nota: Alternativamente, una colección de (ORFeome) clones marco de lectura abierto está comercialmente disponible y puede ser usado para generar las transcripciones de inyección.
2. Preparar 10 piscinas de plásmidos de ^desde 3 10 hasta abril 10 complejidad ^(desde abril 10 hasta 05 10 complejidad total). Esto representa 10 placas con 1.000 - 10.000 colonias cada una.
   1. Biblioteca placa de cultivo en 10 placas de 15 cm LB-ampicilina, crecer 12 - 18 horas a 37 ° C, y recoger colonias de cada por una suave presión con un esparcidor de vidrio en 7 ml LB.
   2. Preparar un stock de glicerol a partir de 0,5 ml (añadir a 0,2 ml de glicerol estéril y se almacena a -20 y# 730; C), y el uso de los restantes 6,5 ml para preparar ADN con un estándar comercialmente disponible kit de ADN miniprep siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Linealizar el ADN plásmido agrupada (1.0 - 2.0 g) con enzima de restricción apropiada digerir ¹⁶ a 37 C durante 1 - 1,5 h. Aislar el DNA linealizado con extracción con fenol / cloroformo seguido de precipitación con etanol y resuspensión en agua por las especificaciones del kit RNA polimerasa utilizada. Sintetizar ARN sentido con un kit de ARN polimerasa comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
4. Preparar agujas de microinyección (utilizando un extractor de aguja con un tubo capilar de vidrio) de aproximadamente 20 m de diámetro; medir puntas de aguja en un microscopio compuesto con un micrómetro ocular calibrado. Nota: La configuración del extractor de agujas deben determinarse empíricamente para producir una aguja con una punta fina de tal manera que cuando se rompen con unas pinzas finas produce el tamaño de la punta deseada.
5. Prepárese (empujar arcilla encapa uniforme sobre el fondo del plato) arcilla forrada 35 x 10 mm placas de Petri con ranuras paralelas para mantener ovocitos en su lugar durante la microinyección; producir ranuras con una sonda centro comercial o pipeta Pasteur fundido en la punta de la llama. Como una alternativa a la arcilla, preparar platos de agarosa haciendo muescas con un molde de elastómero ^17. Ovocitos Transferir con una pipeta de gran calibre a un 3% de Ficoll en 1X MBS (aproximadamente 2 ml) en las filas de los platos de barro forradas.
6. Usando microinyector, llenar la aguja con 1 ng / nl ARN y ajustar el balance para producir ligera presión positiva (para evitar la elaboración de citoplasma del ovocito).
7. Inyectar ovocitos con aproximadamente 20 nl ARN en la región ecuatorial. Permitir 1 h para los ovocitos inyectados a permanecer en Ficoll-MBS, a continuación, transferir suavemente para 1x MBS. Incubar durante 8-24 horas a 20 ° C antes del ensayo casquillo animal.

3. Cap Ensayo Animal

1. Preparar 3 / 4x NAM y obtener unas pinzas finas, bucle de cabello, fragmentos cubreobjetos curvas, dis barro forradashes con hendiduras en forma de copa para mantener ovocitos. Haga fragmentos cubreobjetos curvas rompiendo aparte cubreobjetos de vidrio en fragmentos pequeños (aproximadamente 1 - 2 mm x 2-4 mm) y que pasa por la llama hasta que los bordes pulir y caerse, produciendo una pieza curva.
2. Fertilizar X. laevis huevos ¹⁸ a través in vitro o el apareamiento natural y la cultura a la gástrula etapas (10 - 11 horas después de la fertilización a RT) en 0,1x MBS antes de la clasificación por etapas; recoger mediados de gástrula (etapa 11 - 11,5) ^{10 embriones.}
3. Embriones de transferencia a una placa de Petri, aproximadamente la mitad con 3 / 4x NAM. El uso de dos pares de pinzas finas, retire la fertilización (vitelina) membrana desde gastrulae.
4. Transferencia de ovocitos a 3 / 4x NAM (aproximadamente 2 ml) en platos de barro forradas e inmovilizar en impresiones individuales en la arcilla, que produce impresiones para dar cabida a los embriones individuales como ranuras fueron descritos anteriormente.
5. Embriones de traslado hasta los platos de barro forradas y cortar las tapas animales de gastrulae usando dos pares de pinzas finas. Tenga cuidado de aislar casquillo ectodermo animales y no tejido ecuatorial ^18.
6. Colocar un casquillo animal en el hemisferio animales de cada ovocito con la superficie interior de la tapa de los animales en contacto con el ovocito. Mantenga recombinantes juntos mediante la aplicación de fragmento de cubreobjetos de vidrio curvada y aplicando presión hacia abajo al vidrio, aplanando el ectodermo como los contactos cubreobjetos la arcilla (CAPS animal puede permanecer abierta con la capa interior expuesta a la superficie del ovocito para 6 - 8 horas o más largo ).
   Nota: Como alternativa, coloque la tapa del animal en una hendidura de la arcilla con su superficie interna orientada hacia arriba y coloque un ovocito en la tapa; asegurar el recombinante con pequeñas extensiones de arcilla.
7. Cultura a 20 ° C hasta el control de los embriones llegan a la etapa deseada para el ensayo.
8. Recombinante separada mediante la eliminación de cubreobjetos / arcilla y aislar ectodermo con unas pinzas y un bucle de pelo.
9. Fijar fragmentos ectodérmicas durante 1 hora en MEMFA (3,8%formaldehído en MEM [0.1 M MOPS pH 7.4, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO y _4]).
10. Fragmentos de transferencia (y embriones de control) de MEMFA en etanol y se almacena a -20 ° C.

4. Análisis de la Respuesta en ectodermo por hibridación in situ (ISH)

1. Preparar soluciones para ISH.
   1. Preparar 1x PBS: 0,01 M tampón fosfato salino, NaCl 0,138 M, pH 7,4
   2. Preparar PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20
   3. Preparar la solución de 100x Denhart: 2% de BSA, 2% de polivinilpirrolidona, 2% de Ficoll
   4. Preparar Tampón de Hibridación: 50% formamida, 5x SSC, 1 mg / ml de ARN de levadura torula, 1 mg / ml de heparina, solución de Denhart 1x, 0,1% de Tween-20, 0,1% de CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC-H ₂ O
   5. Preparar maleico Acid Buffer (MAB): ácido maleico 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5
   6. Preparar MAB + bloque: MAB, 2% reactivo de bloqueo (calor a 60 ° C para disolver)
   7. Preparar fosfatasa alcalina (AP) Tampón: Tris 100 mMpH 9,5, 50 mM de MgCl _2, NaCl 100 mM, 0,1% de Tween, dH ₂ O
2. Prepare la sonda de ARN.
   1. El uso de un kit RNA polimerasa comercial y DIG-NTP mezcla, añadir a un tubo de 1,5 ml (50 l de reacción): 25,5 l DEPC-H ₂ O, 10 l 5X Transcription Buffer, 2,5 l de mezcla 10x dig-NTP, 5 l 100 mM TDT, 2 l ARNsin, 2 l plantilla de ADN linealizado (~ 1 g / l), 3 l ARN polimerasa e incubar 37 ° C durante 90 minutos.
   2. Añadir 2 l ARN polimerasa e incubar 37 ° C durante 60 minutos.
   3. Compruebe 2 l de reacción en un 1% en gel de agarosa.
   4. Añadir 1 l RQ1 RNasa libre de DNasa e incubar 37 ° C durante 20 minutos.
   5. Precipitar la sonda mediante la adición de 50 l DEPC-H ₂ O, 25 l 10 M acetato de amonio y 313 l de etanol. Almacenar a -20 C durante la noche (O / N) a continuación, recuperar el ARN por centrifugación a 13.800 xg durante 20 min. Lavar con 500 l 75% de etanol, girar brevemente, retireetanol y permitir pellet se seque al aire. Añadir 50 l DEPC-H ₂ O.
   6. Añadir Tampón de Hibridación a una concentración final de ~ 0,5 g / l.
3. Preparar de tejidos para la hibridación. A menos que se indique lo contrario, llenar viales a la cima con cada cambio de solución descritos (aproximadamente 4 ml).
   1. Retire etanol a partir de viales y embriones de transferencia en 75% de etanol / PTW, entonces 50% de etanol / PTW durante 10 minutos cada uno, en posición horizontal sobre rockero.
   2. Lavar tres veces en PTW durante 5 minutos cada uno en eje de balancín.
   3. Transferencia a 10 mg / l tratamiento de proteinasa K en PTW; tubos de roca vertical 15 min.
   4. Enjuague dos veces 10 minutos cada uno en 0,1 M trietanolamina pH 7.8 - tubos de roca vertical.
   5. Añadir 12,5 l anhídrido acético para tubos y el rock verticalmente 5 min. Repita el procedimiento con anhídrido acético 12,5 l adicional durante 5 min.
   6. Lave en PTW 5 min verticalmente en eje de balancín.
   7. REFIX en 4% de paraformaldehído 20 min en eje de balancín. Heat Tampón de Hibridacióna 60 ° C.
   8. Lavar tres veces en PTW durante 5 minutos cada uno en eje de balancín.
   9. Retire todos pero ~ 1 ml de PTW de cada tubo y añadir 250 l Hyb Buffer; agitar suavemente los tubos para mezclar. Tubos de roca vertical 5 min.
   10. Reemplazar con 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) y agitar suavemente a 60 ° C 10 min. Reemplazar con frescos Hyb Buffer y agitar a 60 ° C de dos a 4 horas.
   11. Sonda de calor (1 ml a 0,5 mg / l en Hyb Buffer) a 60 ° C (3 min). Retire Hyb Buffer y añadir sonda para tubos. Agitar suavemente O / N a 60 ° C.
4. Preparar tejidos para anticuerpos.
   1. Cálido Hyb Buffer y 2x SSC + 0,1% de Tween-20 soluciones a 60 ° C.
   2. Reemplace solución sonda con Hyb Buffer (salvo sondas a -20 ° C durante 2 - 3 veces reutilización). Lavar a 60 ° C durante 10 minutos.
   3. Lavar tres veces a 60ºC en 2x SSC-Tween (20 minutos cada uno con agitación).
   4. Lavar tres veces a 60 ° C en 0,2x SSC-Tween (20 minutos cada uno con agitación).
   5. Lavar dos veces en MAB (RT) durante 15 min cada uno horizontalmente en eje de balancín.
   6. Añadir 1 ml MAB + bloque. Lávese las 2 horas verticalmente en eje de balancín.
   7. Traslado a 1 ml MAB + bloque que contiene un anti-digoxigenina-AP 1/2000. Roca verticalmente en 4 CO / N.
5. Preparar Tejidos para Color reactivo.
   1. Reemplace la solución de anticuerpo con MAB; lavar tres veces en el MAB 5 minutos cada uno horizontalmente en eje de balancín.
   2. Lavar tres veces en el MAB de 1 hora cada uno horizontal en eje de balancín.
   3. Lavar dos veces en AP Buffer 10 minutos cada uno en posición horizontal sobre rockero.
   4. Traslado tejido para pozos múltiples bandeja de plástico, retire AP Buffer y añadir BM reactivo Púrpura (~ 1 ml). Permita reacción tenga lugar en la oscuridad 5 min de O / N.
   5. Cuando se logra tinción apropiada, traslado de tejidos a viales de PTW. Lavar dos veces 10 minutos en cada una PTW en eje de balancín.
   6. Fijar en solución de Bouin en 4 CO / N en eje de balancín.
   7. Lave Bouin con tres 70% de etanol / 30% PTW lavados a TA. Proceda to captura de imagen usando epi-iluminación y una cámara montada en el microscopio, el blanqueado, si es necesario ^18.

5. Selección Sib y clonación

1. Seleccione la piscina con la mayor actividad (mayor respuesta en el tejido ectodérmico).
2. Valorar (diluir con LB a la densidad apropiada) el stock de glicerol de la piscina con la mayor actividad y la placa a cabo diez nuevas placas con aproximadamente una décima parte de las colonias de la etapa previa (usando la sección 2 en el protocolo anterior).
3. Reducir el tamaño de la piscina hasta que la actividad se remonta a una sola colonia.
4. Obtener secuencia de ADN usando cebadores estándar en el vector.

Resultados

En respuesta a la expresión del ARNm inyectado en oocitos, respondiendo tejido casquillo animal se sometió a ensayo para la expresión de Otx2 mediante hibridación in situ (Figura 2 y Tabla 1); Otx2 se expresa en el ectodermo lente presuntiva (PLE) a partir de cierre del tubo neural a través de placoda del cristalino engrosamiento ^19. Sin embargo, desde Otx2 se expresa también en el ectodermo neural anterior, así como ...

Discusión

El método descrito aquí para la clonación funcional de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente puede ser usado para identificar una amplia gama de productos génicos. Este método se expande al trabajo anterior mediante la combinación de los ensayos de inducción de tejido con técnicas de clonación de expresión. Utilizamos las vías metabólicas de Xenopus el ovocito como una fuente de producción de factores de inducción de, directa o indirectamente, después de la inyección de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library