שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

Summary

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Abstract

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Introduction

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

Protocol

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי אוניברסיטת וירג'יניה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

הערה: איור 1 מציג סקירה סכמטי של הפרוצדורות.

1. הכנת ביציות

1. X. טרום ראש laevis נקבות עם 150 U של הסוסה הרה סרום גונדוטרופין (PMSG) כשבוע מראש של בידוד ביצית. הזרק 1 מיליליטר 150 U PMSG / מיליליטר לצק הלימפה הגבי עם מזרק סטרילי 1 סמ"ק עם 29 מחט G.
2. הכן את הפתרונות להזרקת ביצית וביצית assay כובע-חיה.
   1. הכן Ca ⁺⁺ / Mg ⁺⁺ -חינם OR2 (OR2-): 82 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ Na ₂ HPO _4, 50 מ"מ HEPES pH 7.2.
   2. הכן OR2: OR2- בתוספת 1 ​​מ"מ CaCl ₂ ו 1 מ"מ MgCl _2.
   3. הכן OCM: 60% L15 ליבוביץ, 0.4 מ"ג / מיליליטר BSA, 100 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, pH 7.8.
   4. מִרֹאשׁלקלף MBS 1x: 88 מ"מ NaCl, 1 מ"מ KCl, 0.7 מ"מ CaCl _2, 1 מ"מ MgSO _4, 5 מ"מ HEPES (pH 7.8), 2.5 מ"מ NaHCO _3.
   5. הכן 3% Ficoll בMBS 1x.
   6. הכן NAM 1x: 110 מ"מ NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ Ca (NO _{3) 2,} 1 מ"מ MgSO _4, 0.1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ NaHCO _3, 2 מ"מ Na ₃ PO _4, pH 7.4.
3. להרדים את הנקבה בפתרון של 0.03% אתיל מלח methanesulfonate 3-aminobenzoate (MS222) ב0.1x MBS (לפזר MS222 0.3 גרם ב 10 מיליליטר אתנול 95% ראשון, ואז לדלל בL 1 MBS 0.1x) על ידי הצבת צפרדע בפתרון ל 10 - 15 דקות או עד שאינו מגיב.
   1. בדוק ההרדמה שהושלמה על ידי הפיכת צפרדע הרדים על הגב שלה, כדי להבטיח שלא מגיב (חלקי צפרדעים הרדים להזיז גפיים או להתהפך גוף).
4. ניתוח לבודד ברי השחלות על ידי ביצוע חתך בבטן דרך עור וקיר גוף עם להב סכין מנתחים, בידוד רקמת השחלה עם מלקחייםומספריים. מניחים שברי השחלות לOR2-. סגור את קיר הגוף עם תפר 3-0 משי על מחט מעוקלת 24 מ"מ ולסגור את העור בנפרד עם אותו התפרים. לאפשר התאוששות של נקבה במלח אקווריום 1 גרם / L במים.
5. באמצעות מלקחיים עדינים, רקמת השחלה מדמיע לתוך קטנות - חתיכות (10 20 ביציות) והעברה לOR2- הטרי.
6. שברי Defolliculate השחלות ב2.0 מ"ג / מיליליטר collagenase בOR2- על ידי התססה בעדינות על שייקר לשעה 1, העברה לcollagenase הטרי והתססה לשעה אחת נוספת.
7. לשטוף ביציות 10 פעמים בOR2 [המכילות Ca ⁺⁺ / Mg ^++], השלכת ביציות קטנות יותר.
8. לשטוף ביציות בOCM שתי פעמים ולהעביר לOCM הטרי. לבודד ביציות השלב השישי בגודל על בדיקה ויזואלית וזורקי ביציות לא בשלות (קטנות יותר): ביציות השלב השישי הן גדולות יותר מביציות לא בשלות עם פיגמנטציה אפילו בחצי כדור בעלי החיים וכ 1.2-1.4 מ"מ בקוטר.
9. לשמור על ביציות בגיל 18 - אני C ° 20n OCM לפני ההזרקה. הערה: צלחות פטרי מצופה Agarose ניתן להשתמש כדי למזער דבק של ביציות לצלחת.

2. הזרקה של תמלילי הספרייה

1. הכן RNA באמצעות ספריית cDNA כיוונית ¹⁵ חולץ בשלב מתאים של פיתוח (לדוגמא, שלב צלחת עצבית 14 ^10). לרכוש ספריית cDNA או לבנות אחד באמצעות ערכה מסחרית לסקירה בארבעה השלבים הבאים.
   1. לבודד כ 5 מיקרוגרם mRNA על ידי שימוש במוצר להעשרה לפולי () + RNA (ראה טבלה של חומרים) והבאים הוראות יצרן. הערה: התמלילים לשמש כדי לייצר ספריית cDNA עשוי להיות מוגבלת לרקמת התרמה (כגון צלחת העצבית, הבאים microdissection של הרקמה הרצויה), או יכולים להיות מכל עוברים בשלב מסוים.
   2. לייצר cDNA עם ערכה מסחרית, הבא הוראות יצרן.
   3. ולקשור כ 20 ng cDNA לתוך vector כלול בערכה המסחרית או אחר וקטור מתאים. וקטור פלסמיד מתאים כולל רצפים ליציבות mRNA כגון 5 'β-גלובין ורצפי 3 פולי (א) (pCS2 +, pTnT, pCS105).
   4. להפוך קשירה לתאי חיידקים המוסמכים באמצעות הפרוטוקול המומלץ של ספק לשינוי הלם חום.
      הערה: לחלופין, אוסף של שיבוטים מסגרת קריאה פתוחה (ORFeome) הוא זמין באופן מסחרי וניתן להשתמש כדי ליצור תעתיקים להזרקה.
2. הכן 10 בריכות של פלסמידים של ¹⁰ מרס - 10 אפריל מורכבות ⁽¹⁰ אפריל - 10 מאי מורכבות כוללת). זה מייצג 10 צלחות עם 1,000 - 10,000 מושבות כל אחד.
   1. ספריית צלחת תרבות על 10 צלחות LB-אמפיצילין 15 ס"מ, לגדול 12-18 שעות ב 37 C, ולאסוף מושבות מכל על ידי לחץ עדין עם מפזר זכוכית ב -7 ליטראות מיליליטר
   2. הכן מלאי גליצרול מ0.5 מיליליטר (להוסיף לגליצרול סטרילי 0.2 מ"ל ולאחסן ב -20 ו730 #; ג), ולהשתמש ב6.5 מיליליטר שנותר להכין DNA עם ערכה סטנדרטית זמינה מסחרי DNA miniprep הבא הוראות יצרן.
3. Linearize DNA נקווה פלסמיד (1.0-2.0 ק"ג) עם הגבלה מתאימה אנזים עיכול ¹⁶ ב 37 C עבור 1-1.5 שעות. לבודד את ה- DNA לינארית עם חילוץ פנול / כלורופורם ואחריו משקעים אתנול וresuspension במים למפרט של ערכת RNA פולימראז משמשת. לסנתז RNA תחושה עם ערכת RNA פולימראז מסחרית הבאים הוראות יצרן.
4. הכן מחטים עבור microinjection (באמצעות חולץ מחט עם צינורות זכוכית נימים) של כ 20 מיקרומטר קוטר; למדוד טיפים מחט במיקרוסקופ מתחם עם מיקרומטר עיני מכויל. הערה: הגדרות חולץ מחט חייבת לקבוע באופן אמפירי כדי לייצר מחט עם קצה קנס כזה שכאשר נשבר עם מלקחיים עדינים מניב גודל הקצה הרצוי.
5. הכן (לדחוף חימר לשכבה אחידה על תחתית הצלחת) 35 x 10 מ"מ צלחות פטרי עם חריצים מקבילים להחזיק ביציות במקום במהלך microinjection מרופד חימר; לייצר חריצים עם בדיקה קניון או פיפטה פסטר התמזגה בקצה בלהבה. כחלופה לחימר, להכין מנות agarose עושים חריצים עם עובש אלסטומר ^17. העברת ביציות עם טפטפת רחב נשא לFicoll 3% בMBS 1X (כ 2 מיליליטר) בשורות במנות עטורות חימר.
6. שימוש microinjector, למלא מחט עם 1 ננוגרם / RNA NL ולכוון את האיזון כדי לייצר לחץ חיובי קל (כדי למנוע עריכת של ציטופלסמה ביצית).
7. הזרק ביציות עם כ 20 RNA NL באזור הקו המשווה. הרשה שעה 1 לביציות מוזרקות להישאר בFicoll-MBS, ולאחר מכן להעביר בעדינות לMBS 1x. דגירה עבור 8 - 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לפני assay כובע בעלי החיים.

3. בעלי החיים קאפ Assay

1. הכן 3 / 4x NAM ולהשיג מלקחיים עדינים, שיער לולאה, שברי coverslip מעוקלים, דיס-מצופה חימרהס עם חריצים בצורת כוס להחזיק ביציות. הפוך ברי coverslip מעוקלים על ידי מתפרק coverslips זכוכית לרסיסים קטנים (1 כ - 2 מ"מ x 2 - 4 מ"מ) ועובר דרך להבה עד קצוות פולני ולצנוח, הפקת חתיכה מעוקלת.
2. לדשן X. laevis ביצים ¹⁸ דרך במבחנה או הזדווגות ותרבות לgastrula שלבים טבעיות (10 - 11 שעות לאחר הפריה בRT) ב0.1x MBS לפני המיון לפי שלב; לאסוף אמצע gastrula (שלב 11-11.5) ¹⁰ עוברים.
3. העברה עובר לצלחת פטרי כ חצי מלא עם 3 / 4x NAM. שימוש בשני זוגות של מלקחיים בסדר, להסיר את קרום הפריה (vitelline) מgastrulae.
4. העברת ביציות כדי 3 / 4x NAM (כ 2 מיליליטר) במנות עטורות חימר ולשתק בהופעות בודדות בחימר, הפקת הופעות כדי להכיל עוברי אדם כחריצים תוארו לעיל.
5. העברה עובר לכלים מצופה חימר ולחתוך כובעי בעלי חיים מזastrulae באמצעות שני זוגות מלקחיים בסדר. דואג לבודד את האאקטודרם כובע חיה רקמה המשוונית בלבד ולא ^18.
6. הנח כובע בעלי חיים בחצי כדור החיה של כל ביצית עם המשטח הפנימי של כובע החיה פנייה הביצית. החזק recombinants יחד על ידי יישום בר coverslip זכוכית מעוגלת והפעלת לחץ כלפי מטה על הזכוכית, משטח את האאקטודרם כאנשי קשר coverslip החימר (כובעי בעלי חיים יכולים להישאר פתוח עם השכבה הפנימית החשופה על פני השטח של הביצית ל6 - 8 שעות או יותר ).
   הערה: לחלופין, למקם את כובע החיה לכניסת חימר עם המשטח הפנימי שלה פונה כלפי מעלה ומניח את ביצית בכובע; לאבטח את רקומביננטי עם סיומות קטנות של חימר.
7. תרבות בC ° 20 עד עוברי שליטה להגיע רצוי שלב עבור assay.
8. רקומביננטי נפרד על ידי הסרת coverslip / חימר ובידוד האאקטודרם עם מלקחיים ושיער לולאה.
9. תקן שברי ectodermal עבור שעה 1 בMEMFA (3.8%פורמלדהיד בממ [0.1 M pH 7.4 מגבים, 2 מ"מ EGTA, ו 1 מ"מ MgSO _4]).
10. שברי העברה (ועוברים בקרה) מMEMFA לתוך אתנול והחנות ב -20 מעלות.

4. ניתוח של תגובה בהאאקטודרם על ידי אתר בהכלאה (עורך)

1. הכן את הפתרונות לאיש.
   1. הכן 1x PBS: 0.01 מלוח M פוספט שנאגרו, NaCl 0.138 M, pH 7.4
   2. הכן PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0.1% Tween-20
   3. הכן את הפתרון של 100x Denhart: BSA 2%, polyvinylpyrrolidone 2%, 2% Ficoll
   4. הכן הכלאה הצפת: 50 Formamide%, 5x SSC, 1 מ"ג / מיליליטר torula שמרי RNA, 1 מיקרוגרם / מ"ל הפרין, הפתרון של 1x Denhart, 0.1% Tween-20, 0.1% בחורים, 10 מ"מ EDTA, DEPC-H ₂ O
   5. הכן חומצהמאלית הצפת (MAB): חומצת maleic 100 מ"מ, 150 מ"מ NaCl, pH 7.5
   6. הכן MAB + בלוק: MAB, 2% חסימה מגיב (חום עד 60 ג 'ללפזר)
   7. הכן אלקליין phosphatase (AP) מאגר: 100 מ"מ טריסpH 9.5, 50 מ"מ MgCl _2, 100 מ"מ NaCl, Tween 0.1%, DH ₂ O
2. הכן את הבדיקה RNA.
   1. באמצעות ערכת RNA פולימראז מסחרית ולחפור-NTP לערבב, להוסיף לצינור 1.5 מיליליטר (50 תגובת μl): DEPC-H 25.5 μl ₂ O, 10 μl 5X תמלול הצפת, 2.5 μl תערובת 10x חפירה-NTP, 5 μl 100 מ"מ DTT, 2 μl RNAsin, 2 μl תבנית ה- DNA לינארית (~ 1 מיקרוגרם / μl), 3 μl RNA פולימראז ודגירת 37 צלזיוס למשך 90 דקות.
   2. הוסף 2 μl RNA פולימראז ודגירה 37 צלזיוס למשך 60 דקות.
   3. בדוק 2 μl של תגובה על 1% agarose ג'ל.
   4. להוסיף RNase ללא DNase RQ1 μl 1 דגירה 37 צלזיוס למשך 20 דקות.
   5. לזרז את הבדיקה על ידי הוספת 50 μl DEPC-H ₂ O, 25 μl 10 M אמוניום אצטט וμl 313 אתנול. חנות ב -20 מעלות למשך לילה (O / N) ולאחר מכן לשחזר RNA על ידי צנטריפוגה ב13800 XG במשך 20 דקות. לשטוף עם 500 אתנול 75% μl, ספין בקצרה, להסיראתנול ולאפשר גלולה לייבוש באוויר. הוסף 50 μl DEPC-H ₂ O.
   6. להוסיף הכלאה הצפת לריכוז סופי של ~ 0.5 מיקרוגרם / μl.
3. הכן רקמות לכלאה. אלא אם צוין אחרת, למלא בקבוקונים לראש עם כל שינוי פתרון מתואר (כ 4 מיליליטר).
   1. הסר אתנול מבקבוקונים ועוברי העברה לאתנול 75% / PTW, אז 50% אתנול / PTW במשך 10 דקות כל אחד, במאוזן על נדנדה.
   2. לשטוף שלוש פעמים בPTW במשך 5 דקות כל אחד על כיסא נדנדה.
   3. העבר עד 10 מיקרוגרם / טיפול proteinase K μl בPTW; צינורות רוק אנכי 15 דקות.
   4. יש לשטוף פעמיים 10 דקות כל אחד ב 0.1 7.8 M Triethanolamine pH - צינורות רוק אנכי.
   5. להוסיף 12.5 μl אנהידריד אצטית לצינורות ורוק אנכי 5 דקות. חזור עם אנהידריד אצטית 12.5 μl נוסף במשך 5 דקות.
   6. לשטוף בPTW 5 דקות אנכית על נדנדה.
   7. Refix ב -4% דקות paraformaldehyde 20 על כיסא נדנדה. חום הכלאה הצפת60 ג.
   8. לשטוף שלוש פעמים בPTW במשך 5 דקות כל אחד על כיסא נדנדה.
   9. הסר את כל אבל ~ 1 מיליליטר של PTW מצינור אחד ולהוסיף 250 היב הצפת μl; בעדינות מערבולת צינורות לערבב. צינורות רוק אנכי 5 דקות.
   10. החלף עם C 60 היב מאגר (0.5 מיליליטר) ולהתסיס בעדינות על 60 ג '10 דק'. החלף עם טרי היב הצפת ולהתסיס בC 60 שנים עד 4 שעות.
   11. בדיקה חום (1 ​​מיליליטר ברמה של 0.5 מיקרוגרם / μl בהיב מאגר) עד 60 C (3 דקות). הסר היב מאגר ולהוסיף בדיקה לצינורות. להתסיס בעדינות O / N ב 60 ג.
4. הכן רקמות לנוגדן.
   1. 0.1% Tween-20 פתרונות היב מאגר חם ו2x SSC + 60 ג.
   2. החלף פתרון בדיקה עם היב הצפת (להציל את הבדיקות ב -20 מעלות במשך 2 - 3x שימוש חוזר). לשטוף ב 60 צלזיוס למשך 10 דקות.
   3. לשטוף שלוש פעמים ב -60 C ב2x SSC-Tween (20 דקות כל אחד עם תסיסה).
   4. לשטוף שלוש פעמים ב -60 C ב0.2X SSC-Tween (20 דקות כל אחד עם תסיסה).
   5. לשטוף פעמיים בMAB (RT) במשך 15 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
   6. להוסיף MAB מיליליטר 1 + בלוק. לשטוף 2 שעות אנכית על נדנדה.
   7. העברה לMAB מיליליטר 1 + בלוק המכיל 1 / 2,000 אנטי-digoxygenin-AP. רוק אנכי ב 4 CO / N.
5. הכן רקמות לצבע מגיב.
   1. החלף פתרון נוגדן עם MAB; לשטוף שלוש פעמים בMAB 5 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
   2. לשטוף שלוש פעמים בשעה MAB 1 כל אופקי על נדנדה.
   3. לשטוף פעמיים בAP הצפת 10 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
   4. העבר את רקמות ולמרובה-מגש פלסטיק, להסיר ולהוסיף AP מאגר בע"מ מגיב סגול (~ 1 מיליליטר). לאפשר תגובה להמשיך בדקות 5 כהות לO / N.
   5. כאשר הצביעה מתאימה מושגת, להעביר רקמות לבקבוקונים של PTW. לשטוף פעמיים 10 דקות כל אחד בPTW על נדנדה.
   6. לתקן בפתרון של Bouin ב 4 CO / N על נדנדה.
   7. לשטוף את Bouin של עם שלושה שוטף PTW / 30% אתנול 70% ב RT. המשך to לכידת תמונה באמצעות עלית תאורה ומצלמה רכוב מיקרוסקופ, הלבנה אם ¹⁸ דרושים.

5. Sib בחירה ושיבוט

1. בריכה בחר עם הפעילות הגבוהה ביותר (התגובה הגדולה ביותר ברקמת ectodermal).
2. לכיל (לדלל עם LB לצפיפות מתאימה) מניית גליצרול לבריכה עם הפעילות הגבוהה ביותר וצלחת את עשר צלחות חדשות עם כ עשירית מושבות מהשלב הקודם (באמצעות סעיף 2 בפרוטוקול לעיל).
3. להקטין את גודל בריכה עד הפעילות היא לייחס למושבה אחת.
4. להשיג רצף ה- DNA באמצעות פריימרים סטנדרטיים בווקטור.

תוצאות

בתגובה לביטוי של mRNA מוזרק לתוך ביציות, להגיב רקמת כובע חיה assayed לביטוי של otx2 ידי הכלאה באתר (איור 2 ולוח 1); otx2 בא לידי ביטוי בהאאקטודרם העדשה המשוערת (PLE) מסגירת צינור עצבית באמצעות placode העדשה עיבוי ^19. עם זאת, מאז otx2 בא ל...

Discussion

השיטה המתוארת כאן לשיבוט הפונקציונלי של גנים מסוגלים גרימת תגובה בהאאקטודרם מוסמך יכולה לשמש כדי לזהות מגוון רחב של מוצרי גן. שיטה זו מרחיבה על העבודה האחרונה על ידי שילוב של מבחני וישכנע רקמה עם טכניקות שיבוט ביטוי. אנו מנצלים את המסלולים המטבוליים של ביצית Xenopus

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library