Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

Resumo

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Resumo

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Introdução

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Universidade de Virginia Institutional Animal Care e do Comitê Use.

Nota: A Figura 1 mostra uma vista geral esquemática dos procedimentos experimentais.

1. Preparação de oócitos

1. X. Pré-prime laevis fêmeas com 150 U de Pregnant Mare Serum gonadotrofina (PMSG) cerca de uma semana antes do isolamento do oócito. Injectar 1 ml de 150 U / ml PMSG em dorsal saco linfático com 1 cc seringa estéril com 29 g de agulhas.
2. Preparar soluções para injecção de oócitos e oócito animal ensaio cap.
   1. Prepare ^de Ca ++ / ^Mg ++ livre de OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, KCl 2,5 mM, 1,5 mM de Na ₂ HPO _4, 50 mM de HEPES pH 7,2.
   2. Prepare OR2: OR2- adicionalmente 1 _mM de CaCl2 e 1 _mM de _MgCl2.
   3. Prepare OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / mL de BSA, 100? G / ml de gentamicina, pH 7,8.
   4. Prépare MBS 1x: NaCl 88 mM, KCl 1 mM, 0,7 _mM de CaCl2, 1 _mM de MgSO4, 5 mM de HEPES (pH 7,8), 2,5 mM de _NaHCO3.
   5. Prepare a 3% de Ficoll em 1x MBS.
   6. Prepare NAM 1x: NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM de Ca _{(NO3) 2,} 1 _mM de MgSO4, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de NaHCO _3, 2 mM Na _{3 PO 4,} pH 7,4.
3. Anestesiar a fêmea em uma solução de 0,03% de éster etílico do sal metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo (MS222) em MBS 0,1x (dissolver primeiro 0,3 g MS222 em 10 ml de etanol a 95%, depois dilui-se em 1 L de MBS 0,1x) por colocação em solução de rã 10 - 15 minutos ou até que não responde.
   1. Verifique que a anestesia é completa, rodando sapo anestesiado sobre suas costas para garantir que ele não responde (incompletamente rãs anestesiados mover os membros ou virar corpo ao longo).
4. Cirurgicamente isolar fragmentos de ovário, fazendo uma incisão abdominal através da pele e da parede do corpo com lâmina de bisturi, isolando tecido ovariano com uma pinçae tesouras. Coloque fragmentos ovarianos em OR2-. Fechar a parede do corpo com uma sutura de seda 3-0 em uma agulha curva 24 mm e feche a pele separadamente com os mesmos fios. Permitir a recuperação da fêmea no 1 g / L de sal na água do aquário.
5. Usando uma pinça fina, tecido ovariano rasgo em pequenas (10 - 20 oócitos) peças e transferência para OR2- fresco.
6. Fragmentos ovarianos Defolliculate em 2,0 mg / ml de colagenase A em OR2- agitando suavemente num agitador durante 1 hora, a transferência de colagenase fresco e agitação durante uma hora adicional.
7. Wash ovócitos 10 vezes em OR2 [contendo Ca ⁺⁺ / Mg ^++], descartando oócitos menores.
8. Lave oócitos em OCM duas vezes e transferir a nova OCM. Isolar oócitos Fase VI por tamanho após a inspeção visual e descartar oócitos imaturos (menores): ovócitos Fase VI são maiores do que os oócitos imaturos, mesmo com pigmentação no hemisfério animais e são cerca de 1,2-1,4 mm de diâmetro.
9. Manter oócitos a 18 - 20 ° C iN OCM antes da injecção. Nota: As placas de Petri revestidas com agarose pode ser utilizado para minimizar a aderência de oócitos de prato.

2. Injecção da Biblioteca Transcrições

1. Prepara-se uma biblioteca de cDNA direccional ^{15 utilizando} ARN extraído numa fase adequada do desenvolvimento (por exemplo, placa neural fase 14 ^10). Comprar uma biblioteca de cDNA ou construir um usando um kit comercial acordo com a visão geral nos quatro passos abaixo.
   1. Isolar cerca de 5 ug de ARNm usando um produto para enriquecer para poli (A) + ARN (Ver tabela de materiais) e seguindo as instruções do fabricante. Nota: Os transcritos para ser usado para produzir a biblioteca de ADNc pode ser restrita a um tecido indução (tais como a placa neural, seguindo microdissecação do tecido desejado), ou pode ser a partir de embriões inteiros numa fase particular.
   2. Produção de ADNc com um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante.
   3. Ligadura, aproximadamente, 20 ng de cDNA para um vector incluído com o kit comercial ou outro vector adequado. Um vector plasmídeo apropriado inclui sequências de estabilidade do ARNm, tal como 5 'β-globina e 3 poli (A) (sequências pCS2 +, PTNT, pCS105).
   4. Transforme ligação em células bacterianas competentes que utilizam o protocolo recomendado pelo fornecedor para a transformação de choque térmico.
      Nota: Alternativamente, um conjunto de grelha de leitura aberta (ORFeome clones) está comercialmente disponível e pode ser usado para gerar transcrições para injecção.
2. Preparar 10 piscinas de plasmídeos de 10 para ³ 10 ⁴ complexidade (10 ⁴ 10 ⁵ para a complexidade total). Isto representa 10 placas com 1.000 - 10.000 colónias cada.
   1. Biblioteca placa de cultura em 10 placas de 15 cm LB-ampicilina, crescer 12-18 horas a 37 C, e recolher colónias de cada por uma leve pressão com um espalhador de vidro em 7 ml LB.
   2. Prepare um estoque de glicerol de 0,5 ml (adicionar aos 0,2 ml de glicerol e armazenar estéril a -20 &# 730; C), e utilizar os restantes 6,5 ml para preparar DNA com um padrão disponível comercialmente kit DNA miniprep seguindo as instruções do fabricante.
3. Linearizar DNA plasmídeo em pool (1,0-2,0 mg) com restrição apropriada enzima digerir ¹⁶ a 37 ° C durante 1-1,5 h. Isolar o ADN linearizado com extracção com fenol / clorofórmio seguido de precipitação com etanol e ressuspensão em água de acordo com as especificações do kit de ARN-polimerase utilizada. Sintetizar RNA sentido com ARN-polimerase de um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante.
4. Prepare agulhas para microinjeção (usando um extrator de agulha com tubos capilares de vidro) de aproximadamente 20 mm de diâmetro; medir pontas de agulha em um microscópio composto com um micrômetro ocular calibrada. Nota: As configurações do extrator de agulhas deve ser determinada empiricamente para produzir uma agulha com uma ponta fina de tal forma que quando quebrado com uma pinça fina produz o tamanho da ponta desejado.
5. Prepare (empurrar barro emcamada uniforme na parte inferior do prato) 35 x 10 mm placas de Petri com sulcos paralelos para manter oócitos no lugar durante a microinjeção forrada com argila; produzir sulcos com uma sonda de shopping ou pipeta Pasteur fundido na ponta em chamas. Como uma alternativa para argila, preparar pratos agarose fazendo recortes com um molde de elastômero ^17. Oócitos meio de uma pipeta de todo o furo para 3% Ficoll em 1x MBS (aproximadamente 2 ml) em filas nos pratos forrado de barro.
6. Usando microinjector, preencher agulha com 1 ng / nl RNA e ajustar o equilíbrio para produzir uma ligeira pressão positiva (para evitar a elaboração de citoplasma de oócitos).
7. Injetar oócitos com aproximadamente 20 nl RNA na região equatorial. Permitir uma hora para oócitos injectados para permanecer em Ficoll-MBS, em seguida, transferir cuidadosamente para 1x MBS. Incubar durante 8 - 24 horas a 20 ° C antes do ensaio tampão animal.

3. animal Cap Assay

1. Prepare 3 / 4x NAM e obter uma pinça fina, laço de cabelo, fragmentos lamela curvas, dis-alinhado argilahes com recortes em forma de taça para manter oócitos. Faça fragmentos lamela curvas desmembrando-lamelas de vidro em pequenos fragmentos (aproximadamente 1 - 2 mm x 2-4 mm) e passando pela chama até que as bordas polonês e inclinar-se, produzindo uma peça curvada.
2. Fertilize X. laevis ovos ¹⁸ através in vitro ou do acasalamento natural e cultura para gastrula fases (10-11 horas pós-fertilização no RT) em 0,1x MBS antes da ordenação por etapa; recolher meados de gástrula (fase 11 - 11,5) ¹⁰ embriões.
3. Embriões de transferência para uma placa de Petri aproximadamente meio cheio com 3 / 4x NAM. Usando dois pares de uma pinça fina, retire a fertilização (vitelline) membrana de gastrulae.
4. Transferência de oócitos a 3 / 4x NAM (aproximadamente 2 ml) em placas forradas de argila e imobilizar em impressões individuais na argila, produzindo impressões para acomodar embriões individuais como ranhuras foram descritos acima.
5. Embriões de transferência para os pratos forrado de barro e cortar tampas de animais fora gastrulae usando dois pares de fórceps finos. Tome cuidado para isolar animais cap ectoderma somente e não tecido equatorial ^18.
6. Colocar uma tampa de animal no hemisfério animal de cada oócito com a superfície interior da tampa de animais contactar o oócito. Segurar recombinantes em conjunto aplicando fragmento lamela de vidro curvo e a aplicação de pressão descendente para o vidro, achatando o ectoderme como os contactos lamela da argila (tampões animais podem permanecer aberta com a camada interior exposta à superfície do oócito para 6 - 8 h ou mais ).
   Nota: Como alternativa, coloque a tampa de animais em um recuo de barro com sua superfície interna voltada para cima e coloque um oócito na tampa; fixar o recombinante com pequenas extensões de argila.
7. Cultura a 20 ° C até a embriões de controlo atingiram a fase desejada para o ensaio.
8. Recombinante separada, removendo lamela / argila e isolando ectoderma com uma pinça e um laço de cabelo.
9. Corrigir fragmentos ectodérmicas durante 1 hora em MEMFA (3,8%formaldeído em MEM [MOPS 0,1 M pH 7,4, EGTA 2 mM, e 1 mM de MgSO _4]).
10. Fragmentos de transferência de embriões (e controle) de MEMFA em etanol e armazenar a -20 C.

4. Análise de Resposta na ectoderme por hibridação in situ (ISH)

1. Preparar soluções para ISH.
   1. Prepare 1x PBS: 0,01 M de solução salina tamponada de fosfato, NaCl 0,138 M, pH 7,4
   2. Prepare PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20
   3. Preparar a solução de Denhart 100x: 2% de BSA, 2% de polivinilpirrolidona, 2% de Ficoll
   4. Preparar tampão de hibridização: 50% formamida, 5x SSC, 1 mg / ml de ARN de levedura torula, 1 ug / ml de heparina, solução de Denhart 1x, 0,1% de CHAPS a 0,1%, EDTA 10 mM, Tween-20,, _DEPC-H2O
   5. Preparar tampão de ácido maleico (MAB): 100 mM de ácido maleico, NaCl 150 mM, pH 7,5
   6. Prepare MAB + bloco: MAB, 2% reagente de bloqueio (calor a 60 ° C para dissolver)
   7. Prepare a fosfatase alcalina (FA) Tampão: 100 mM de TrispH 9,5, 50 _mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween, _dH2O
2. Prepara-se o ARN da sonda.
   1. Utilizando um kit de ARN polimerase comercial e cavar-NTP mistura, adicionar a um tubo de 1,5 ml (50 reacção ul): 25,5 mL de _DEPC-H2O, 10 uL de 5X de Transcrição Tampão, 2,5 ul 10x DIG-mistura de NTP, 5 ul de 100 mM DTT, 2 ul de RNAsin, 2 ul de molde de ADN linearizado (~ 1 ug / ul), 3 ul de ARN-polimerase de 37 ° C e incubar durante 90 min.
   2. Adicionar 2 l de ARN polimerase e incubar 37 ° C durante 60 min.
   3. Verifique 2 ul de reacção sobre 1% de gel de agarose.
   4. Adicionar 1 mL RQ1 RNase livre de DNase e incubar 37 ° C durante 20 min.
   5. Precipitar a sonda por adição de 50 ul de _DEPC-H2O, 25 mL de 10 M de acetato de amónio e 313 mL de etanol. Armazenar a -20 C durante a noite (O / N), em seguida, recuperar o ARN por centrifugação a 13.800 xg durante 20 min. Lavar com 500 ul de etanol 75%, girar rapidamente, removaetanol e permitir pellet secar ao ar. Adicionar 50 ul de _DEPC-H2O
   6. Adicionar tampão de hibridação a uma concentração final de ~ 0,5 ug / uL.
3. Prepare tecido por hibridação. Salvo disposição em contrário, encher frascos ao topo com cada mudança de solução descritos (cerca de 4 ml).
   1. Remover o etanol e a partir de frascos de transferência de embriões em 75% de etanol / PTW, em seguida, 50% de etanol / PTW durante 10 min cada, horizontalmente no balancim.
   2. Lavar três vezes em PTW durante 5 min cada em balancim.
   3. Transferir para 10 ng / mL tratamento Proteinase K em PTW; tubos de rock verticalmente 15 min.
   4. Lavar duas vezes em cada 10 min trietanolamina 0,1 M de pH 7,8 - tubos de rocha verticalmente.
   5. Adicionar 12,5 ul anidrido acético para tubos e rock verticalmente 5 min. Repita com anidrido acético adicional de 12,5 ul por 5 min.
   6. Lavar em PTW 5 min verticalmente no balancim.
   7. Refix em paraformaldeído a 4% em 20 min balancim. Calor Tampão de Hibridizaçãoa 60 ° C.
   8. Lavar três vezes em PTW durante 5 min cada em balancim.
   9. Remova todos, mas ~ 1 ml de PTW de cada tubo e adicionar 250 ul Hyb tampão; Agite cuidadosamente tubos para misturar. Tubos de rocha vertical 5 min.
   10. Substitua com 60 ° C Hyb Buffer (0,5 ml) e agitar suavemente a 60 ° C 10 min. Substitua com frescos Hyb tampão e agitar a 60 ° C de duas a quatro horas.
   11. Sonda de calor (1 ml a 0,5 mg / mL em tampão de Hib) a 60 ° C (3 min). Remover Hyb tampão e adicionar sonda para tubos. Agitar suavemente O / N a 60 ° C.
4. Prepare Tissue para o Anticorpo.
   1. Quente Hyb buffer e 2x SSC + 0,1% Tween-20 soluções a 60 C.
   2. Substitua solução de sonda com Hyb Buffer (sondas salvar a -20 C durante 2 - 3x reutilização). Lavar a 60 ° C durante 10 min.
   3. Lavar três vezes a 60 ° C em 2x SSC-Tween (20 min cada, com agitação).
   4. Lavar três vezes a 60 ° C em 0,2x SSC-Tween (20 min cada, com agitação).
   5. Lavar duas vezes em MAB (RT) durante 15 min cada horizontalmente no balancim.
   6. Adicione 1 ml MAB + bloco. Lave 2 horas verticalmente no balancim.
   7. Transferência para 1 ml MAB + bloco que contém um anti-digoxigenina-AP 1 / 2.000. Rocha verticalmente a 4 CO / N.
5. Prepare tecido por reagente de cor.
   1. Substituir solução de anticorpo com MAB; lavar três vezes em 5 min cada MAB horizontalmente no balancim.
   2. Lavar três vezes em cada MAB 1 h horizontalmente no balancim.
   3. Lavar duas vezes em tampão de AP 10 min cada horizontalmente no balancim.
   4. Transferir para tecido de múltiplas bem bandeja de plástico, remover e adicionar tampão de AP BM reagente roxa (~ 1 mL). Permitir que a reacção prossiga na obscuridade 5 min a O / N.
   5. Quando a coloração adequada é alcançado, transferir tecido para frascos de PTW. Lavar duas vezes 10 minutos cada em PTW no balancim.
   6. Corrigir em solução de Bouin a 4 CO / N no balancim.
   7. Lave a Bouin com três de 70% de etanol / 30% PTW lavagens em temperatura ambiente. Prossiga tcaptura de imagem usando o epi-iluminação e uma câmera montada no microscópio, branqueamento, se necessário ^18.

5. Sib Seleção e Clonagem

1. Selecionar piscina com a maior atividade (maior resposta no tecido ectodérmica).
2. Titular (diluir com LB a densidade adequada) o estoque de glicerol para a piscina com a maior atividade e placa out dez novas placas com aproximadamente um décimo das colônias da etapa anterior (usando a seção 2 em protocolo acima).
3. Reduzir o tamanho da piscina até que a atividade é atribuída a única colônia.
4. Obter sequência de ADN utilizando iniciadores convencionais no vector.

Resultados

Em resposta à expressão do ARNm injectado em oócitos, respondendo tecido tampão animal foi ensaiado quanto à expressão de OTX2 por hibridação in situ (Figura 2 e Tabela 1); OTX2 é expressa em ectoderme lente presuntivo (PLE) de fecho do tubo neural através plac�io lente espessamento ^19. No entanto, uma vez que OTX2 é também expressa em ectoderme neural anterior, bem como ectoderme cabeça não neurais fora d...

Discussão

O método aqui descrito para a clonagem de genes funcional capaz de induzir uma resposta em ectoderme competente pode ser utilizado para identificar uma grande variedade de produtos de genes. Este método expande trabalho passado, combinando ensaios de indução de tecido-com técnicas de clonagem de expressão. Nós utilizamos as vias metabólicas do oócito de Xenopus como uma fonte de produção de factores de induzir, directa ou indirectamente, após a injecção de ARN. Isto, em combinação com a utiliza?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library