功能性克隆使用<em&gt;爪</em&gt;卵母细胞表达系统

摘要

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

摘要

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

引言

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

研究方案

所有的实验程序都经弗吉尼亚机构动物护理和使用委员会的大学。

注意: 图1示出的实验步骤的示意图。

1.准备卵母细胞

1. 前总理X.蟾女性，150ü孕马血清促性腺激素（PMSG）大约提前一个星期的卵母细胞隔离。注射1毫升150单位/毫升PMSG到背部淋巴囊有1毫升无菌注射器用29克针。
2. 准备注入卵母细胞和卵母细胞动物帽检测解决方案。
   1. 制备的Ca ^{++ / Mg} ++的-free OR2（OR2-）:82 mM氯化钠，2.5mM的氯化钾，1.5mM的钠_{2 HPO 4，50mM}的HEPES pH7.2的。
   2. 准备OR 2:OR2-加1毫米氯化钙₂和1毫米氯化镁_2。
   3. 制备OCM:60％的Leibovitz L15，0.4毫克/毫升BSA，100μg/ ml的庆大霉素，pH值7.8。
   4. 预削1×MBS:88 mM氯化钠，1mM的氯化钾，0.7毫米氯化钙_2，1mM的_MgSO 4干燥，5mM的HEPES（pH值7.8），2.5毫_{碳酸氢钠。}
   5. 准备3％聚蔗糖在1X MBS。
   6. 制备1×NAM:110 mM氯化钠，2mM的氯化钾，1毫米的_Ca（NO 3）2，1mM的_MgSO 4干燥，0.1毫摩尔EDTA，1毫_碳酸氢钠 ，2毫的Na _{3 PO 4，pH} 7.4中。
3. 麻醉雌性在3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐在0.1倍的MBS 0.03％溶液（MS222）通过将蛙在溶液中（第一溶解在10ml 95％乙醇0.3克MS222，然后稀释在1升0.1×MBS） 10 - 15分钟或直到反应迟钝。
   1. 检查麻醉完成后转动麻醉青蛙到它的后面，以确保它不会响应（不完全麻醉的青蛙四肢移动或转动身体以上）。
4. 手术通过穿过皮肤和体壁与手术刀片腹部切口，分离卵巢组织钳分离卵巢片段和剪刀。将卵巢碎片进入OR2-。收身的墙上用3-0丝线在一个24mm弯针，并分别与相同缝合关闭皮肤。允许女性的恢复在1克/升鱼缸盐水。
5. 用细镊子，撕裂卵巢组织成小（10 - 20卵母细胞）件，转移至新鲜OR2-。
6. 在OR2- 2.0毫克/毫升胶原酶甲Defolliculate卵巢片段轻轻搅动在摇床上1小时，转移到新鲜胶原酶和搅拌一小时。
7. 洗卵母细胞的10倍OR 2 [含Ca ^{++ / Mg} ++的]，舍弃小卵母细胞。
8. 在OCM洗卵母细胞的两倍，并转移到新鲜OCM。在目视检查隔离第六阶段的卵母细胞通过尺寸和丢弃未成熟（较小）的卵母细胞:第六阶段的卵母细胞是大于未成熟卵母细胞即使色素沉着动物半球和大约1.2-1.4毫米的直径。
9. 卵母细胞保持在18 - 20°C IñOCM注射前。注意:琼脂糖包被的培养皿中，可以使用最小化的卵母细胞的粘附抛出。

2.注射图书馆成绩单

1. 制备定向cDNA文库¹⁵使用RNA在发展的适当阶段（例如，神经板级14 ^10）萃取。购买的cDNA文库，或者使用下面的四个步骤每概览​​商品化试剂盒构造之一。
   1. 通过使用产品以富集多聚（A）+ RNA（见表材料）和下列制造商的说明分离约5微克的mRNA。注意:要使用的转录物产生的cDNA文库可以被限制为一个诱导的组织（如神经板，以下所需组织的显微切割），或者可以是从全胚胎在特定阶段。
   2. 产生的cDNA用市售试剂盒，按照制造商的指示。
   3. 结扎大约20纳克的cDNA到vectoř附带市售试剂盒或其他合适的载体中。合适的质粒载体包括用于mRNA稳定性如5'β珠蛋白和3多聚（A）序列（PCS2 + pTnT，pCS105）序列。
   4. 转换连接入使用供应商推荐的协议，用于热休克转化能力的细菌细胞。
      注意:可替换地，开放阅读框（ORFeome）克隆的集合是可​​商购，并且可以用于产生转录物用于注射。
2. 制备的¹⁰ 3的质粒的10池¹⁰ 4复杂性^（10 4〜10 ⁵的总的复杂性）。这代表10板的1000 - 每套1殖民地。
   1. 板库培养到10 15厘米LB-氨苄青霉素板，成长12 - 18小时在37℃，并收集从每个用一个玻璃吊具温和的压力菌落在7ml LB.
   2. 从0.5毫升准备甘油股票（添加到0.2毫升无菌甘油并储存在-20℃＃730; C）中，并用剩余的6.5 ml至与标准制备DNA市售的DNA miniprep试剂依照制造商的指示。
3. 线性合并的质粒DNA（1.0 - 2.0微克）用合适的限制性酶消化¹⁶在37℃，1 - 1.5小时。隔离用苯酚/氯仿提取，随后用乙醇沉淀和再悬浮在每所使用的RNA聚合酶试剂盒的规格水的线性化的DNA。合成有义RNA用市售RNA聚合酶试剂盒按照生产商的指示。
4. 制备约20微米的直径的针显微注射（使用针拔出器与玻璃毛细管）;衡量一个复合式显微镜与校准的目镜测微尺针尖。注:针拔出器设置必须根据经验确定生产针用细尖，这样当用细镊子破碎产生期望的针尖大小。
5. 准备（粘土推入在培养皿底部）均匀一层黏土衬里35×10毫米，平行的凹槽显微注射期间举行的地方卵母细胞培养皿中;产生的凹槽与融合在火焰尖端商场探头或巴斯德吸管。作为一种替代粘土，准备做的压痕的弹性^模 17琼脂糖菜肴。转移的卵母细胞用宽口移液管至3％聚蔗糖在1X MBS（约2毫升）中的粘土内衬菜肴行。
6. 用微量注射器，填补针1毫微克/ NL RNA和调整平衡，产生轻微的正压力（以防止制订卵母细胞胞浆内）。
7. 注入的卵母细胞，在赤道区域大约20 NL核糖核酸。允许1小时的注入卵母细胞留在菲-MBS，然后轻轻地转移到1X MBS。在20℃之前动物帽测定24小时 - 孵育8。

3.动物帽化验

1. 准备3/4倍不结盟运动和获得细镊子，发圈​​，弯曲盖玻片碎片，黏土衬里的DISHES杯状凹陷举行的卵母细胞。 （ - 2毫米×2 - 4 mm产品大约1），并穿过火焰直到边缘抛光和下垂，产生弯曲片通过分解盖玻片成小片段，使弯曲盖玻片片段。
2. 施肥X.蟾卵¹⁸通过在体外或自然交配和文化的原肠胚阶段-在0.1倍MBS（10 11小时受精后在室温）之前逐步排序;收集中期原肠胚（阶段11 - ^11.5）10胚胎。
3. 转移到胚的培养皿大约半满与3/4×NAM。使用两对细镊子，从原肠胚取出施肥（卵黄）膜。
4. 卵母细胞转移到3/4倍NAM（约2毫升）的粘土成荫的菜肴和固定在粘土个人的印象，产生的印象，以适应单个胚胎的凹槽中如上所述。
5. 转移胚胎到粘土内衬菜切动物帽关克使用两对细镊子的astrulae。小心分离的动物帽外胚层，而不是只赤道组织^18。
6. 放在每个卵母细胞与动物帽接触卵母细胞的内表面形式的动物用半球动物帽。 8小时或更长的时间 - 通过将弯曲的玻璃盖玻片片段并施加向下的压力施加到玻璃，压扁外胚层作为盖玻片接触粘土（动物帽可以保持与暴露于卵母细胞为6的表面内层开放保持重组体一起）。
   注意:可替换地，将动物帽成粘土压痕与它的内表面朝上，并放置在盖的卵母细胞;保护与粘土的小扩展重组。
7. 文化在20°C，直到控制胚胎达到所需要的阶段检测。
8. 分离重组去除盖玻片/粘土和外胚层分离钳和吹风循环。
9. 修复外胚层片段1小时的MEMFA（3.8％甲醛在MEM [0.1M的MOPS pH为7.4，2mM的EGTA，和1mM _MgSO 4干燥]）。
10. 转移片段（和控制胚胎）从MEMFA成乙醇和储存在-20℃。

反应在外胚层原位杂交4.分析（ISH）

1. 准备ISH的解决方案。
   1. 制备的1×PBS:0.01M磷酸盐缓冲盐水，氯化钠0.138男，pH 7.4的
   2. 制备PBS-吐温（PTW）:1×PBS，0.1％Tween-20的
   3. 准备100X Denhart的解决方案:2％BSA，2％的聚乙烯吡咯烷酮，2％聚蔗糖
   4. 制备杂交缓冲液:50％甲酰胺，5×SSC，1毫克/毫升圆酵母RNA，1微克/毫升肝素，1×Denhart溶液，0.1％吐温-20，0.1％CHAPS，10毫摩尔_{EDTA，DEPC-H} 2 O的
   5. 准备马来酸缓冲器（MAB）:100毫米马来酸，150毫米氯化钠，pH值7.5
   6. 准备MAB +块:MAB，2％封闭试剂（加热至60℃溶解）
   7. 准备碱性磷酸酶（AP）缓冲液:100毫米的TrispH值9.5，50毫米氯化镁_2，100毫米氯化钠，0.1％吐温，卫生署_{2 O}
2. 准备RNA探针。
   1. 用市售RNA聚合酶试剂盒，挖-NTP混合物，添加到1.5ml试管（50微升反应）:25.5微升DEPC-H _{2 O，10}微升5X转录缓冲液，2.5微升10X掏-NTP混合物，5微升100毫DTT，2微升的RNasin，2微升线性DNA模板（约1微克/微升），3μl的核糖核酸聚合酶，孵育37℃90分钟。
   2. 添加2微升的RNA聚合酶，孵育37℃60分钟。
   3. 检查2微升反应的1％琼脂糖凝胶。
   4. 加入1μlRQ1无RNA的DNA酶孵育37℃20分钟。
   5. 通过加入50μlDEPC-H _{2 O，25}微升10μM的乙酸铵和313微升乙醇沉淀探头。储存在-20℃过夜（O / N），然后通过离心分离回收的RNA在13800×g离心20分钟。用500微升75％乙醇洗涤，短暂离心，去掉乙醇并允许沉淀风干。加入50微升_DEPC-H 2 O
   6. 添加杂交缓冲液至0.5微克/微升〜的终浓度。
3. 准备组织进行杂交。除非另有说明，填充小瓶与每个解变化描述（约4毫升）中的顶部。
   1. 除去从小瓶和移植胚乙醇到75％乙醇/ PTW，然后用50％的乙醇/ PTW，每次10分钟，水平方向上的摇杆。
   2. 在PTW每个摇杆上的5分钟洗三次。
   3. 转移到10微克/微升蛋白酶K处理的PTW;岩管垂直15分钟。
   4. 岩管垂直 - 在0.1M三乙醇胺pH值7.8冲洗两次，每次10分钟。
   5. 添加12.5微升乙酸酐到管和岩石竖直5分钟。重复用另外的12.5微升乙酸酐5分钟。
   6. 在PTW 5分钟垂直于摇杆清洗。
   7. Refix在4％多聚甲醛20分钟的摇杆。热杂交缓冲液到60℃。
   8. 在PTW每个摇杆上的5分钟洗三次。
   9. 从各管中取出PTW的所有，但约1毫升加250微升HYB缓冲;轻轻摇动管混匀。岩管竖直5分钟。
   10. 替换60℃HYB缓冲液（0.5毫升）和轻轻搅动在60℃10分钟。更换新鲜HYB缓冲器和搅在60℃两至4小时。
   11. 热探针（1混合物在0.5微克/微升在HYB缓冲液）到60℃（3分钟）。删除HYB缓冲区，并添加探头管。轻轻搅动O / N在60℃。
4. 准备组织的抗体。
   1. 温暖HYB缓冲器和2x SSC + 0.1％Tween-20的溶液至60℃。
   2. 更换HYB缓冲探针溶液（保存探头在-20℃下2 - 3倍重用）。在60℃10分钟洗净。
   3. 在60℃在2×SSC-吐温（每个搅拌20分钟）洗涤三次。
   4. 在60℃在0.2×SSC-吐温（每个搅拌20分钟）洗涤三次。
   5. 在生物圈（RT）搅拌15分钟，各水平上摇杆洗两次。
   6. 加入1毫升MAB +块。在摇杆垂直洗2小时。
   7. 转移至1ml MAB +模块包含一个1 / 2,000抗洋地黄毒苷-AP。垂直岩石在4 CO / N。
5. 准备组织的显色剂。
   1. 更换单克隆抗体的解​​决方案;在人与生物圈洗三次，每次5分钟水平上的摇杆。
   2. 人与生物圈1小时，各水平上的摇杆洗三次。
   3. 在AP缓冲液10分钟，各水平上摇臂洗两次。
   4. 转移组织到多个孔塑料托盘，取出AP缓冲液，并添加BM紫试剂（〜1毫升）中。允许反应进行在黑暗5分钟，O / N。
   5. 在适当的时候染色来实现，组织转移到PTW的小瓶。在摇杆的PTW洗两次，每次10分钟。
   6. 修正了布安的4 CO / N在摇杆的解决方案。
   7. 洗出布安的三个70％乙醇/ 30％PTW洗涤在室温。继续牛逼Ø图像采集使用的外部照明，并在显微镜安装摄像头，漂白如有必要^，18。

5.同胞选择和克隆

1. 最高的活动选择池（外胚层组织中最大的响应）。
2. 滴定（的LB稀释至合适的密度）的甘油原液用于与活性最高的池和积垢10的新板用大约十分之一从（使用协议部2的上方）上一步骤的菌落。
3. 减少池大小，直到活动被追踪到单一的殖民地。
4. 使用标准的引物中的载体得到的DNA序列。

结果

响应于mRNA的注入卵母细胞，响应动物帽组织表达测定为OTX2的表达通过原位杂交（ 图2和表1）; OTX2通过透镜placode表达在推定透镜外胚层（PLE）从神经管闭合增厚^19。然而，由于OTX2也表达于前神经外胚层以及PLE外非神经外胚层头，它与这两个神经和placodal应答有关。使用foxe3筛选文库为能够产生在透镜感受态动物帽外胚?...

讨论

此处描述的基因能够诱导在主管外胚层的响应的功能性克隆的方法可以用于鉴定范围广泛的基因产物。该方法通过将组织诱导试验用表达克隆技术扩展了过去的工作。我们利用爪蟾卵母细胞的代谢途径如生产诱发因素，直接或间接地，以下的RNA注射的来源。此，在与使用已建立的方法进行克隆目的^6,7-使用从cDNA文库或其他集合克隆的产生转录物表达的基因组合，提供了一个有价值的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library