Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Özet

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Özet

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Giriş

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

Protokol

Tüm deney prosedürleri Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Not: Şekil 1, deneysel prosedürler şematik görünümünü gösterir.

Oosit hazırlanması 1.

1. Ön asal X oosit izolasyon önceden Gebe Kısrak Serum Gonadotropin 150 U (PMSG) yaklaşık bir hafta ile kadın laevis. 29 G iğne ile 1 cc steril şırınga ile dorsal lenf kese içine 1 ml 150 U / ml PMSG enjekte edilir.
2. Oosit enjeksiyonu ve oosit-hayvan kap deneyi için çözümler hazırlayın.
   1. Ca Hazırlama ^{++ / Mg ++} içermeyen OR2 (OR2-): 82 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1.5 mM Na ₂ HPO _4, 50 mM HEPES pH 7.2.
   2. OR2- artı 1 _mM CaCl2 ve 1 mM _MgCl2: ya da 2'yi _{hazırlayın.}
   3. % 60 Leibovitz L15, 0.4 mg / ml BSA, 100 ug / ml gentamisin, pH 7,8: OCM hazırlayın.
   4. Ön1x MBS hazırlanması: 88 mM NaCI, 1 mM KCI, 0.7 mM _CaCl2, 1 mM MgSO _4, 5 mM HEPES (pH 7.8), 2.5 mM _{3 NaHCO.}
   5. 1x MBS% 3 Ficoll hazırlayın.
   6. 1x NAM hazırlayın: 110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO _{3) 2,} 1 mM MgSO _4, 0.1 mM EDTA, 1 mM NaHCO _3, 2 mM Na ₃ PO _4, pH 7.4 ile yıkanır.
3. 0.1X MBS Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzunun% 0.03 çözeltisi (MS222) 'de kadın anestezisi için çözelti kurbağa yerleştirerek (ilk 10 ml% 95 etanol içinde 0.3 g MS222 çözülür, daha sonra 1 L, 0.1X MBS sulandırmak) 10-15 dakika veya tepkisiz kadar.
   1. Bu anestezi yanıt vermiyor sağlamak (eksik anestezi kurbağa uzuvları taşımak veya bedeni teslim) onun sırtına anestezi kurbağa çevirerek tam olup olmadığını kontrol edin.
4. Cerrahi forseps ile yumurtalık dokusu izole bisturi cilt ve vücut duvarı boyunca abdominal insizyon yapılıp, yumurtalık fragmanlarını izoleve makas. OR2- içine yumurtalık parçaları yerleştirin. 24 mm'lik kavisli iğne 3-0 ipek sütür ile vücut duvarı kapatın ve aynı sütür ile ayrı ayrı cilt kapatın. Su içinde 1 g / L akvaryum tuzu kadın kurtarma izin verir.
5. (- 20 oosit 10) adet ve taze OR2- transfer küçük içine ince forseps, gözyaşı yumurtalık dokusu kullanma.
6. 1 saat boyunca karıştırma cihazı üzerinde, hafifçe ajite taze kolajenaz geçiş ve bir saat daha çalkalayarak OR2- 2.0 mg / ml kollajenaz A Defolliculate yumurtalık fragmanları.
7. Yıkama küçük oosit atarak OR2 ^[Ca ++ / Mg ⁺⁺ ihtiva eden] 10 kez, oositlerde.
8. OCM iki kez oosit yıkayın ve taze OCM transfer. Görsel inceleme üzerine boyutuna göre Evre VI oosit izole edin ve olgunlaşmamış (küçük) oosit atın: Sahne VI oositlerin hayvan yarımkürede bile pigmentasyon ile olgunlaşmamış oositlerin büyüktür ve çapı yaklaşık 1.2-1.4 mm.
9. 20 ° C i - 18 oosit koruyunenjeksiyondan önce n OCM. Not: Agaroz kaplı petri kaplarına çanak oositlerin yapışmasını en aza indirmek için de kullanılabilir.

Kütüphane Transkriptler 2. Enjeksiyon

1. Gelişme uygun bir aşamada (örneğin, nöral plak aşaması 14 ¹⁰⁾ ekstre yönlü bir cDNA kütüphanesi ¹⁵ kullanarak, RNA yı hazırlamak. Bir cDNA kütüphanesi satın alın ya da aşağıda dört adımda genel başına bir ticari kit kullanılarak bir inşa.
   1. Poli (A) + RNA (Malzeme Tablo bakınız) için zenginleştirmek için bir ürünü kullanırken ve üreticinin yönergeleri izleyerek yaklaşık 5 ug mRNA izole edin. Not: transkript (istenilen doku mikrodiseksiyon sonra, nöral levha gibi) bir indükleme dokuya sınırlı olabilir cDNA kütüphanesini üretmek için kullanılır, ya da belirli bir aşamada bütün embriyolardan olabilir.
   2. Üreticinin yönergeleri izleyerek bir ticari kit ile cDNA üretin.
   3. Bir Vecto içine cDNA ng, yaklaşık 20 Arterr ticari kit veya uygun başka bir vektör ile birlikte. Uygun bir plazmid vektörü mRNA stabilitesi gibi 5 'β-globin ve 3 poli (A) sekansları (PCS2 +, pTnT, pCS105) için dizileri içerir.
   4. Isı şok dönüşümü için tedarikçinin önerdiği protokol kullanılarak yetkili bakteri hücrelerine ligasyonu Transform.
      Not: Alternatif olarak, açık okuma çerçevesi (ORFeome) klonları koleksiyonu, ticari olarak mevcuttur ve enjeksiyon için transkriptleri oluşturmak için kullanılabilir.
2. 10 ⁴ karmaşıklık ⁽¹⁰ Nisan - 10 Mayıs toplam karmaşıklığı) 10 ³ Plazmidlerin 10 havuzları hazırlayın. 10.000 kolonilerin her - Bu 1000 ile 10 plakaları temsil eder.
   1. 37 ˚C de 18 saat ve 7 ml LB bir cam dağıtıcı ile hafif basınç her gelen koloniler toplamak - Plaka kütüphane kültürü 10 15 cm LB-ampisilin plakalar üzerine, 12 büyüyecek
   2. 0.5 ml bir gliserol stok hazırlayın (-20 & 0.2 ml steril gliserol ve mağaza eklemek# 730 C) ve bir standart ile, üretici firmanın talimatlarına aşağıdaki ticari olarak temin edilebilir DNA miniprep kiti DNA hazırlamak için, kalan 6.5 ml kullanılır.
3. 1.5 saat - Enzim 1 için 37 ° C'da ¹⁶ sindirimi, uygun kısıtlama - (2,0 ug 1,0) havuzlanmış plazmid DNA Linearize. Kullanılan RNA polimeraz kit özelliklerine göre su içinde etanol çökeltme ve yeniden süspansiyon haline getirildi, fenol / kloroform ekstraksiyonu ile linearize DNA izole edin. Üreticinin yönergeleri izleyerek bir ticari RNA polimeraz kiti ile duyu RNA sentez.
4. Yaklaşık 20 mikron çapında (cam kılcal boru ile bir iğne çektirmenin kullanarak) mikroenjeksiyon için iğne hazırlayın; kalibre oküler mikrometre ile bir bileşik mikroskop iğne uçları ölçün. Not: İğne çektirmesi ayarları ince forseps ile kırıldığı zaman istenilen uç boyutu ortaya çıkarır şekilde ince uçlu bir iğne üretmek ampirik olarak tespit edilmelidir.
5. (Içine kil itin hazırlayınçanak alt) üzerine muntazam tabakalı kil astarlı 35 x 10 mm mikroenjeksiyon sırasında yerinde oosit tutmak için paralel oluklar petri yemekler; alev ucunda erimiş bir alışveriş merkezi probu veya Pasteur pipeti ile oluklar üretirler. Kil, bir alternatif olarak, bir elastomer kalıp ^17, girinti yaparak agaroz yemekler hazırlamak. Kil astarlı yemekleri satırları 1X MBS% 3 Ficoll (yaklaşık 2 ml) geniş çaplı bir pipet ile Aktarım oosit.
6. Mikroenjektör kullanarak, 1 ng / nl RNA ile iğne doldurup (oosit sitoplazması kadar çizim önlemek için) hafif pozitif basınç üretmek için dengesini ayarlamak.
7. Ekvator bölgesinde yaklaşık 20 nl RNA ile oosit enjekte edilir. Daha sonra, Ficoll-MBS kalır 1x MBS yavaşça aktarmak için enjekte edilmiş oositlerde için 1 saat izin verin. Önceden hayvan başlık tahlili için 20 ° C'de 24 saat - 8 inkübe edin.

3. Hayvan Cap Testi

1. Ince forseps, saç döngü, kavisli lamel parçaları, kil astarlı dis 3 / 4x NAM hazırlayın ve eldefincan şekilli girinti çıkıntılar ile hes oosit tutun. Kavisli parça üreten, (4 mm - - 2 mm x 2 yaklaşık 1) ve kenarları lehçe ve sarkık kadar alev geçerek küçük parçalara cam lamelleri ayrı kırarak kavisli lamel parçaları olun.
2. X döller laevis yumurta in vitro veya doğal çiftleşme ve aşamaları gastrula kültürün içinden ¹⁸ - önceden aşamaya göre sıralama için 0.1x MBS (10 oda sıcaklığında 11 saat sonrası fertilizasyon); ¹⁰ embriyoların - orta gastrula (11.5 aşama 11) toplamak.
3. 3 / 4x NAM yaklaşık yarısı dolu bir petri embriyolar transfer. Ince forseps iki çift kullanarak, gastrulae gelen fertilizasyon (vitellin) membran kaldırmak.
4. Aktarım kil astarlı yemekleri 3 / 4x NAM (yaklaşık 2 ml) oocytes ve oluklar yukarıda açıklandığı gibi bireysel embriyolar karşılamak için gösterim üreten, kil bireysel izlenimler hareketsiz.
5. Kil astarlı yemekleri embriyolar transfer ve g kapalı hayvan kesim kapaklarıastrulae ince forseps iki çift kullanarak. Değil, sadece ekvator doku ¹⁸ hayvan kap ektoderm izole etmek için özen gösterin.
6. Oosit ile temas hayvan kapağın iç yüzeyi ile her bir oosite hayvan yarımkürede bir hayvan kapağını yerleştirin. 8 saat veya daha uzun - 6 oosit yüzeyine maruz iç tabaka ile açık kalabilir (lamel kontaklar olarak hayvan kapakları kil ektoderm düzleşme, bombeli cam lamel fragmanı uygulanması ve cama aşağı doğru basınç uygulayarak rekombinantlarını arada tutmak ).
   Alternatif olarak, yukarı doğru bakan iç yüzeyi ile bir kil girinti hayvansal takarak ve kapağı üzerinde bir oosit yerleştirmek; Not: kil, küçük uzantıları ile rekombinant sabitleyin.
7. 20 ° C'de Kültür kontrol embriyolar tahlil için sahne istenen ulaştıkları kadar.
8. Lamel / kil kaldırılması ve forseps ve saç döngü ile ektoderm izole ederek ayrı rekombinant.
9. MEMFA 1 saat (% 3.8 için ektodermal fragmanları FixMEM [0,1 M MOPS pH 7.4, 2 mM EGTA ve 1 mM MgSO _4] formaldehit).
10. -20 ˚C etanol ve mağaza MEMFA transfer fragmanları (ve kontrol embriyolar).

In situ Hibridizasyon tarafından Ektoderm içinde Yanıtın 4. Analizi (ISH)

1. ISH için çözümler hazırlayın.
   1. 1x PBS hazırlayın: 0.01 M fosfat tamponlu tuz, NaCl 0.138 M, pH 7.4
   2. Hazırlama PBS-Tween (PTW): 1x PBS,% 0.1 Tween-20
   3. 100x Denhart solüsyonu hazırlayın: 2% BSA,% 2 polivinilpirolidon,% 2 Ficoll
   4. Hibridizasyon tamponu hazırlayın:% 50 formamid, 5x SSC, 1 mg / ml maya RNA Torula, 1 ug / ml heparin, 1x Denhart solüsyonu,% 0.1 Tween-20,% 0.1 CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC _H2O
   5. Hazırlama Maleik asit tampon (MAB): 100 mM maleik asit, 150 mM NaCI, pH 7.5
   6. (Çözünmesi 60 ˚C ısı) MAB,% 2 reaktifi engelleme: MAB + blok hazırlayın
   7. 100 mM Tris: Alkalen Fosfataz (AP) Tampon hazırlayınpH 9.5, 50 _mM MgCI2, 100 mM NaCI,% 0.1 Tween, dH ₂ O
2. RNA Probe hazırlayın.
   1. 1.5 ml tüp (50 ul reaksiyon) eklemek ticari bir RNA polimeraz kit kullanılarak ve karışımı-NTP dig: 25.5 ul _DEPC, H2O, 10 ul 5X Transkripsiyon tamponu, 2.5 ul 10x dig-NTP karışımı, 5 ul 100 mM DTT, 2 ul RNAsin, 2 ul doğrusallaştırılmış DNA şablonu (~ 1 ug / ul), 3 ul RNA Polimeraz ve 90 dakika için 37 ° inkübe edin.
   2. 2 ul RNA Polymerase ekleyin ve 60 dakika için 37 ° inkübe edin.
   3. % 1 agaroz jeli üzerinde reaksiyon 2 ul kontrol edin.
   4. 1 ul RQ1 RNase-barındırmayan DNase ilave edin ve 20 dakika boyunca 37 ° inkübe edin.
   5. 50 ul DEPC _H2O, 25 ul 10 M amonyum asetat ve 313 ul etanolün eklenmesi ile prob Çökelme. -20 ° C'de saklayın, gece boyunca (O / N), daha sonra 20 dakika boyunca 13.800 x g'de santrifüjleme ile geri RNA. Kısaca spin 500 ul% 75 etanol ile yıkayın, kaldırmaketanol ve kuru hava pelet izin verir. Ekle 50 ul DEPC H ₂ O.
   6. 0.5 ug / ul ~ arasında nihai bir konsantrasyona kadar Hibridizasyon Tamponu ekleyin.
3. Hibridizasyon için Tissue hazırlayın. Aksi belirtilmediği sürece, her bir çözüm değişikliği tarif edildiği gibi (yaklaşık 4 mi) ile üst şişeler doldurulur.
   1. Yatay rocker, 10 dakika her biri için% 75 etanol / PTW, daha sonra% 50 etanol / PTW Şişelerden ve transfer embriyolar etanol çıkarın.
   2. 5 dakika rocker üzerinde her biri için PTW üç kez yıkayın.
   3. 10 ug PTW içinde / ul Proteinaz K tedavisi transfer; Kaya tüpleri dik 15 dk.
   4. Dikey kaya tüpleri - 0.1 M Triethanolamine pH 7.8 iki kez 10 dakika her durulayın.
   5. Tüplere 12.5 ul asetik anhidrit eklenir ve dikey olarak 5 dakika sallayın. 5 dakika boyunca ilave 12,5 ul asetik anhidrit ile tekrarlayın.
   6. Rocker dk dikey PTW 5 yıkayın.
   7. Rocker% 4 paraformaldehid 20 dakika içinde Refix. Isı Hibridizasyon Tampon60 ˚C ye.
   8. 5 dakika rocker üzerinde her biri için PTW üç kez yıkayın.
   9. 250 ul Hyb Buffer her tüpten PTW tüm ama ~ 1 ml çıkarın ve ekleyin; hafifçe karıştırın tüpler girdap. Kaya tüpleri dik 5 dk.
   10. 60 ˚C Hyb Tamponu (0.5 mi) ile değiştirin ve 60 ° C'de 10 dakika yavaşça çalkalayın. Taze Hyb Tampon ile değiştirin ve 60 ˚C iki 4 saat sonra çalkalayın.
   11. Isı sondası 60 ° C (3 dakika) (0.5 ug Hyb Tamponu içinde / ml 1 ml). Hyb Buffer çıkarın ve tüpler probu ekleyin. O / N 60 ° C'de yavaşça çalkalayın.
4. Antikor için Tissue hazırlayın.
   1. 60 ° C'ye ısınmaya Hyb Tampon ve 2 x SSC +% 0.1 Tween-20 çözümler.
   2. (- 3x yeniden kullanım için 2 -20 ˚C de probları kaydetmek) Hyb Tampon ile prob çözümü değiştirin. 10 dakika boyunca 60 ° C'de yıkanır.
   3. 2x SSC-Tween 60 ° (20 dakika çalkalanarak her biri) üç kez yıkayın.
   4. 0.2X SSC-Tween 60 ° (20 dakika çalkalanarak her biri) üç kez yıkayın.
   5. Rocker üzerinde 15 dakika her yatay için MAB (RT) iki kez yıkayın.
   6. 1 ml MAB + bloğu ekleyin. Rocker dikey 2 saat yıkayın.
   7. 1 / 2.000 Anti-dioksijenin-AP içeren 1 ml MAB + blok transfer. 4 CO / N dikey sallayın.
5. Renk Reaktif için Tissue hazırlayın.
   1. MAB ile antikor çözüm değiştirin; MAB 5 dakika her yatay rocker üç kez yıkayın.
   2. MAB 1 saat her yatay rocker üç kez yıkayın.
   3. AP Tampon 10 dakika içinde her yatay rocker iki kez yıkayın.
   4. Birden-iyi plastik tepsi doku aktarın AP Buffer kaldırmak ve BM Mor reaktifmi (~ 1 ml). Reaksiyon O / N karanlık 5 dakika içinde ilerlemeye izin verin.
   5. Uygun boyama elde edildiğinde, PTW ve şişelere doku aktarın. Rocker üzerinde PTW iki kez 10 dakika her yıkayın.
   6. Rocker 4 CO / N at Bouin çözeltide sabitleyin.
   7. RT'de Bouin üç% 70 etanol /% 30 PTW yıkar ile yıkayın. T DevamGerekli ¹⁸ ise epi-aydınlatma ve bir mikroskop monte kamera, ağartma kullanarak o görüntü yakalama.

5. Sib Seçimi ve Klonlama

1. En yüksek aktivite ile seçin havuzu (ektodermal dokusunda büyük tepki).
2. (Yukarıda protokol bölümü 2 kullanılarak) önceki adımda elde edilen koloniler, en yüksek etkinliği olan havuzu için gliserol stokları (uygun yoğunluğa LB ile seyreltilmiş) ile yaklaşık onda biri ile on yeni plakaları plaka titre edilir.
3. Etkinlik tek koloni takip dek havuzu boyutunu azaltın.
4. Vektör standart primerler kullanılarak DNA sekansı elde edilir.

Sonuçlar

Hayvan kap doku yanıt, oositler enjekte mRNA ekspresyonu yanıt olarak in situ hibridizasyon (Şekil 2 ve Tablo 1) e göre otx2 ekspresyonu için tahlil edilmiştir; otx2 göz taslakları nöral tüp kapanması ile ilgili olası lens ektoderm (PLE) cinsinden ifade edilir kalınlaşma ^19. Otx2 da PLE dışındaki ön nöral ektoderm olarak nöral olmayan baş ektoderm ifade edilir Bununla birlikte, bu nöra...

Tartışmalar

Yetkili ektoderm bir yanıt indükleme yeteneğine sahip genlerin fonksiyonel klonlanması için, burada açıklanan yöntem, gen ürünlerinin geniş tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem ifade klonlama teknikleri ile doku uyaran deneyleri birleştirerek geçmiş iş üzerine genişletir. Bu RNA, enjeksiyonu takiben, doğrudan veya dolaylı olarak, faktör uyarıcı üretim kaynağı olarak, Xenopus oosit metabolik yolları kullanmaktadır. Bu ilgi, bir cDNA kütüphanesi veya klonları diğer toplama ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library