를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

요약

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

초록

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

서문

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

프로토콜

모든 실험 절차는 버지니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.

참고도 1은 실험 과정의 개략도를 나타낸다.

난자 1. 준비

1. 사전 프라임 (X) 난 모세포의 분리에 앞서 임신 마레 혈청 성선 자극의 150 U (PMSG) 약 1 주일와 여성을 laevis의. 29 G 바늘 1 CC 멸균 주사기 등의 림프 낭에 1 ml의 150 U / ㎖의 PMSG를 주사.
2. 난 모세포 주입 및 난자 동물 캡 분석을위한 솔루션을 준비합니다.
   1. 칼슘을 준비 ⁺⁺ / 마그네슘 ^{+ +} - 무료 OR2 (OR2-) : 82 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.5 밀리미터 나 ₂ HPO _4, 50 mM의 HEPES pH가 7.2.
   2. OR2- 플러스 1 mM의 염화칼슘 _2, 1 밀리미터의 MgCl ₂ : OR2를 _{준비합니다.}
   3. 60 % 라이 보 비츠 L15, 0.4 ㎎ / ㎖ BSA, 100 μg의 / ㎖ 겐타 마이신, pH가 7.8 : OCM을 준비합니다.
   4. 사전1X MBS 깎다 : 88 mM의 염화나트륨, 1 mM의 KCl을을 0.7 mM의 _CaCl2를, 1mM의 _황산, 5 mM의 HEPES (PH 7.8), 2.5 mM의 _NaHCO3을.
   5. 1X MBS의 3 % 피콜을 준비합니다.
   6. 1X NAM을 제조 : 110 mM의 염화나트륨, 2 밀리미터의 KCl, 1 mM의 칼슘을 (NO _{3) 2,} 1mM의 _황산, 0.1 mM의 EDTA, 1mM의 _NaHCO3을, 2 mM의 나트륨 ₃ PO _4, pH가 7.4.
3. 0.1X MBS 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트, 메탄 술폰산 염을 0.03 % 용액 (MS222)으로 여성 마취위한 용액 개구리 배치하여 (제 10 ml의 95 % 에탄올 중의 0.3 g의 MS222을 용해하고 1 L 0.1X의 MBS에 희석) 10-15 분 또는 응답하지 않는 때까지.
   1. 그 마취가 응답하지 않도록 (불완전 마취 된 개구리가 사지를 움직이거나 몸을 뒤집)하기 위해 다시에 마취 된 개구리를 돌려 완료 확인합니다.
4. 수술 집게로 난소 조직을 분리, 메스 블레이드와 피부 및 신체 벽을 통해 복부 절개를하여 난소 조각을 분리가위. OR2-에 난소 조각을 놓습니다. 24mm 곡선 바늘에 3-0 실크 봉합사와 신체 벽을 닫고 같은 봉합 별도로 피부를 닫습니다. 물에 1g / L 수족관 소금에 여성의 복구를 허용합니다.
5. (- 20 난자 10) 조각과 신선한 OR2-로 전송 작은으로 미세 집게, 눈물 난소 조직을 사용.
6. 1 시간 동안 진탕 기에서 부드럽게 교반 신선한 콜라게나 제에 전송하고 하나의 추가 시간 동안 교반하여 OR2- 2.0 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제에 Defolliculate 난소 조각.
7. 워시 작은 난자를 폐기 OR2에 [칼슘 ^{+ +} / 마그네슘 ^{+ +를} ​​포함하는 10 번, 난자.
8. OCM에 두 번 난자를 세척하고 신선한 OCM에 전송합니다. 육안 검사에 크기에 따라 단계 VI 난자를 분리하고 미숙 (작은) 난자를 폐기 : 단계 VI 난자는 동물 반구도 색소 침착과 미성숙 난자보다 큰 약 직경 1.2-1.4 mm이다.
9. 20 ° C 형 I - 18에서 난자를 유지주입하기 전에 N OCM. 주 : 아가 로스 코팅 페트리 접시는 접시 난자의 점착을 최소화하기 위해 사용될 수있다.

도서관 성적 증명서 2. 사출

1. 개발의 적절한 단계 (예를 들어, 신경 판 단계 14 ^10)에서 추출 방향 cDNA 라이브러리 ⁽¹⁵⁾ 사용하여 RNA를 준비합니다. cDNA 라이브러리를 구입하거나 아래의 4 단계 개요 당 상용 키트를 사용하여 하나를 구축합니다.
   1. 폴리 (A) + RNA (재료의 표 참조) 풍부하게 제품을 사용하고 제조업체의 지침에 따라 약 5 μg의 mRNA의를 격리합니다. 주 : 사체 (원하는 조직의 미세 절제 다음과 같은 신경 판으로) 유도 조직에 한정 될 수있다 cDNA 라이브러리를 생성하기 위하여 사용되는, 또는 특정 단계에서 전체 배아 일 수있다.
   2. 제조업체의 지침에 따라, 상용 키트의 cDNA를 생성합니다.
   3. vecto로 cDNA를 NG 약 20 결찰R은 상용 키트 또는 다른 적절한 벡터에 포함. 적절한 플라스미드 벡터는 mRNA의 안정성 등 5 'β-글로빈 3 폴리 (A) 시퀀스 (PCS2 +, pTnT, pCS105)에 대한 시퀀스를 포함한다.
   4. 열충격 형질 전환 공급자의 권장 프로토콜을 사용하여 능력 균체 내로 결찰 변환.
      참고 : 또는 오픈 리딩 프레임 (ORFeome) 클론의 수집이 시판되고 주입 전 사체를 생성하기 위해 사용될 수있다.
2. 10 ⁴ 복잡성 ^(10월 4일에서 10월 5일까지 총 복잡성) 10 ^(3)의 플라스미드 (10) 풀을 준비합니다. 10,000 식민지 각 - 이것은 1000 10 판을 나타냅니다.
   1. 37 ℃에서 18 시간, 7 ㎖의 (LB)에 유리 스프레더와 부드러운 압력에 의해 각에서 식민지를 수집 - 플레이트 도서관 문화 10 15-CM LB-암피실린 플레이트 상에, (12)을 성장
   2. 0.5 ml의에서 글리세롤 주식을 준비합니다 (-20에서 0.2 ml의 멸균 글리세롤 및 저장에 추가# 730; C), 및 표준 제조사의 지침에 따라 시판중인 DNA 미니 프렙 키트 DNA를 제조 6.5 mL의 나머지를 사용한다.
3. 1.5 시간 - 효소 (1) 37 ℃에서 ^{16 다이제스트} 적절한 제한과 - (2.0 μg의 1.0) 풀링 된 플라스미드 DNA를 선형화. 사용 된 RNA 폴리머 라제 키트의 사양에 물 및 에탄올 침전에 재 부유 한 다음 페놀 / 클로로포름 추출과 선형화 된 DNA를 분리. 제조업체의 지침에 따라 상업 RNA 중합 효소 키트 센스 RNA를 합성.
4. 약 20 μm의 직경 (유리 모세관 튜브와 바늘 풀러를 사용하여) 미세 주입 용 바늘을 준비; 교정 된 안구 마이크로 미터와 복합 현미경에 바늘 끝을 측정한다. 참고 : 니들 풀러 설정이 미세 집게로 깨진 경우 원하는 팁 크기를 얻을 수 있도록 좋은 팁 바늘을 생산하는 경험적으로 결정되어야한다.
5. (에 점토를 밀어를 준비접시의 바닥)에 균일 한 층 점토 늘어선 35 X 10mm 미세 주입하는 동안 장소에 난자를 유지하는 병렬 홈으로 배양 접시를; 불꽃의 끝에서 융합 쇼핑몰 프로브 또는 파스퇴르 피펫으로 홈을 생산하고 있습니다. 점토에 대한 대안으로서, 엘라스토머 ^(17)와 톱니 형을 아가로 요리를 준비한다. 점토 늘어선 요리의 행에 1X MBS의 3 % 피콜 (약 2 ㎖)에 넓은 구멍 피펫으로 전송 난자.
6. 마이크로 인젝터를 사용하여, 1 NG / NL RNA와 바늘을 작성하고 (난자 세포질의 그리기 방지하기 위해) 약간의 긍정적 인 압력을 생산하기 위해 균형을 조정합니다.
7. 적도 지역에서 약 20 NL RNA와 난 모세포를 주입한다. 다음, 피콜-MBS에 남아 1X MBS에 부드럽게 전송 주입 난 모세포에 대한 1 시간을 허용합니다. 이전에 동물 캡 분석에 20 ℃에서 24 시간 - 8 품어.

3. 동물 모자 분석

1. 미세 집게, 헤어 루프, 곡선 coverslip에 조각, 점토 늘어선 DIS 3 / 4 배 NAM을 준비하고 획득컵 모양의 톱니와 HES는 난자를 개최합니다. 곡선 부분을 생산, (4 MM - - 2 MM × 2 약 1)과 가장자리 광택과 처지까지 불꽃을 통과하는 작은 조각으로 커버 글라스를 따로 끊어서 곡선 coverslip에 조각을 확인합니다.
2. X를 기름지게 laevis의 달걀 체외 또는 자연 교배와 단계 낭배하는 문화를 통해 ¹⁸ - 이전 단계에 의해 정렬에 0.1X MBS (10 실온에서 11 시간 포스트 수정을); ¹⁰ 배아 - 중간 낭배 (11.5 단계 11)를 수집합니다.
3. 3 / 4 배 NAM와 약 반 전체 배양 접시로 전송 배아. 미세 집게 두 쌍을 사용하여, gastrulae에서 수정 (난황) 막을 제거합니다.
4. 전송 점토 늘어선 요리 3 / 4 배 NAM (약 2 ㎖)에 난자 홈이 상기 된 개별 배아를 수용하기 위해 인상을 생산, 점토의 개별 노출에 고정.
5. 점토 늘어선 요리로 전송 배아 및 G 오프 동물 모자를 잘라astrulae 잘 포셉 두 쌍을 사용하여. 만 아니라 적도 조직 ⁽¹⁸⁾ 동물 모자 외배엽을 분리주의하십시오.
6. 난자와 접촉하는 동물 캡의 내부 표면과 각 난자의 동물 반구에 동물 캡을 놓습니다. 8 시간 이상 - 6 난자의 표면에 노출 된 내부 층으로 열려있다 (커버 슬립 연락처 동물성 캡 점토 외배엽 평탄화, 곡면 유리 커버 슬립 단편을인가하고, 유리로 하향 압력을인가하여 재조합을 함께 보유 ).
   , 또는 위쪽을 향 내면에 점토 들여 쓰기에 동물 캡을 배치하고 뚜껑에 난자를 배치; 참고 : 점토의 작은 확장자를 가진 재조합을 고정합니다.
7. 20 ° C에서 문화 제어 배아는 분석 무대를 원하는에 도달 할 때까지.
8. 커버 슬립 / 진흙을 제거하고 집게와 헤어 루프 외배엽을 분리하여 별도의 재조합.
9. MEMFA에서 1 시간 (3.8 %를 외배엽 조각을 수정(MEM) [0.1 M MOPS의 pH가 7.4, 2 mM의 EGTA, 1 mM의 황산 _4]에서 포름 알데히드).
10. -20 ℃에서 에탄올과 저장소로 MEMFA에서 전송 조각 (및 제어 배아).

에서의 현장 하이브리드 화에 의한 외배엽에서 응답 4. 분석 (ISH)

1. ISH을위한 솔루션을 준비합니다.
   1. 1X PBS를 준비 : 0.01 M 인산 완충 식염수, 염화나트륨 0.138 M, pH가 7.4
   2. 제조 PBS-트윈 (PTW) 1X PBS, 0.1 % 트윈 -20
   3. 100 × 덴 하르트의 용액을 제조 하였다 : 2 % BSA, 2 % 폴리 비닐 피 롤리 돈을, 2 % 피콜
   4. 혼성화 완충액을 제조 50 % 포름 아미드, 5 배 SSC, 1 mg의 / ㎖ torula 효모 RNA, 1 μg의은 / ㎖ 헤파린 1X 덴 하르트의 용액, 0.1 % 트윈 -20, 0.1 % CHAPS, 10 mM의 EDTA, DEPC-H ₂ O
   5. 제조 말레 산 완충액 (MAB) : 100 mM의 말레 산, 150 mM의 염화나트륨, pH가 7.5
   6. (용해 60 ℃에 열) MAB, 2 % 시약을 차단 : MAB + 블록을 준비
   7. 100 mM 트리스 : 알카라인 포스파타제 (AP) 버퍼를 준비합니다pH가 9.5의 50 mM의 MgCl _2, 100 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트윈, DH ₂ O
2. RNA 프로브를 준비합니다.
   1. 1.5 ML 튜브 (50 μL 반응)에 추가, 상업 RNA 중합 효소 키트를 사용하여 혼합 - NTP의 발굴 : 25.5 μL의 DEPC-H ₂ O, 10 μL 5 배 전사 버퍼, 2.5 μL 10 배 발굴-NTP 믹스, 5 μL 100 밀리미터 DTT, 2 μL RNAsin, 2 μL 선형화 DNA 주형 (~ 1 μg의 / μL), 3 μL RNA 중합 효소와 90 분 동안 37 ℃를 품어.
   2. 2 μL RNA 중합 효소를 추가하고 60 분 동안 37 ℃를 품어.
   3. 1 % 아가 로스 젤에 반응 2 μL를 확인합니다.
   4. 1 μL의 RQ1 RNA 분해 효소가없는 DNase를 추가하고 20 분 동안 37 ℃를 품어.
   5. 50 μL의 DEPC-H ₂ O, 25 ㎕의 10 M 암모늄 아세테이트 및 에탄올 313 μL를 첨가하여 침전물을 프로브. -20 ℃에서 보관 하룻밤 (O / N)은 다음 20 분 동안 13,800 XG에서 원심 분리하여 RNA를 복구 할 수 있습니다. 간단히 회전, 500 μL 75 % 에탄올로 세척, 제거에탄올과 공기 건조에 펠렛을 할 수 있습니다. 추가 50 μL의 DEPC-H ₂ O
   6. 0.5 μg의 / μL ~의 최종 농도 하이브리드 버퍼를 추가합니다.
3. 하이브리드를 위해 조직을 준비합니다. 특별히 언급하지 않는 한, 각 솔루션의 변화를 설명 (약 4 mL)로 정상에 튜브를 입력합니다.
   1. 수평 로커에, 10 분 각 75 % 에탄올 / PTW, 다음 50 % 에탄올 / PTW에 튜브 및 이식란으로부터 에탄올을 제거합니다.
   2. 5 분 로커에 각각 PTW에 세 번 씻으십시오.
   3. 10 μg의 PTW에서 / μL 테 K 처리로 이동; 바위 튜브를 수직으로 15 분.
   4. 수직 바위 튜브 - 0.1 M 트리에탄올 아민 pH가 7.8에 두 번 10 분 각 씻어.
   5. 튜브에 12.5 μL에게 무수 초산을 추가하고 수직으로 5 분 바위. 5 분 동안 추가로 12.5 μL 아세트산 무수물로 반복한다.
   6. 로커에 분 수직 PTW 5 씻으십시오.
   7. 로커에 4 % 파라 포름 알데히드 20 분에 REFIX. 열 하이브리드 버퍼60 ℃에.
   8. 5 분 로커에 각각 PTW에 세 번 씻으십시오.
   9. 250 μL HYB 버퍼를 각 튜브에서 PTW의 모든하지만 ~ 1 ml의를 제거하고 추가; 부드럽게 섞어 튜브를 소용돌이 친다. 락 튜브를 수직으로 5 분.
   10. 60 ℃ HYB 버퍼 (0.5 ml)로 교체하고 60 ℃ 10 분에서 부드럽게 교반. 신선한 HYB 버퍼로 교체하고 60 ℃에서 2 4 시간에서 교반.
   11. 열 프로브 (60) C (3 분)에 (0.5 μg의 HYB 버퍼에 / μL에서 1 ㎖). HYB 버퍼를 제거하고 튜브에 프로브를 추가 할 수 있습니다. O / N은 ​​60 ℃에서 부드럽게 선동.
4. 항체를위한 조직을 준비합니다.
   1. 60 ℃로 따뜻한 HYB 버퍼 및 배 SSC + 0.1 % 트윈 20 솔루션을 제공합니다.
   2. (- 배 재사용이 -20 ℃에서 프로브를 저장) HYB 버퍼와 프로브 솔루션을 교체합니다. 10 분 동안 60 ℃에서 씻으십시오.
   3. 배 SSC-트윈에서 60 ℃ (20 분 교반과 함께 각)에서 세 번 씻으십시오.
   4. 0.2X SSC-트윈에서 60 ℃ (20 분 교반과 함께 각)에서 세 번 씻으십시오.
   5. 로커에 15 분마다 수평에 대해 MAB (RT)에 두 번 씻으십시오.
   6. 1 ML의 MAB + 블록을 추가합니다. 로커에 수직으로 2 시간을 씻으십시오.
   7. 1 / 2,000 안티 digoxygenin-AP를 포함하는 1 ML의 MAB + 블록에 전송. 4 주 / N에서 수직 바위.
5. 색상 시약을위한 조직을 준비합니다.
   1. MAB와 항체 솔루션을 교체; MAB 5 분마다 수평 로커에 세 번 씻는다.
   2. MAB 1 시간에 각각의 수평 로커에 세 번 씻으십시오.
   3. AP 버퍼 10 분에 각각 수평 로커에 두 번 씻으십시오.
   4. 여러 웰 플라스틱 트레이로 조직을 이동 AP 버퍼를 제거하고 BM에게 보라색 시약을 추가 (1 ~ ㎖). 반응이 O / N 어두운 5 분에 할 수있게합니다.
   5. 적절한 염색이 달성되면, PTW의 바이알에 조직을 전송. 로커에 PTW에 두 번 10 분 각각을 씻으십시오.
   6. 로커에 4 주 / N에서 Bouin의 솔루션에 고정합니다.
   7. 실온에서 Bouin의 세 70 % 에탄올 / 30 % PTW 세척과를 세척 할 것. T를 진행필요한 경우 ¹⁸ 에피 조명 및 현미경에 장착 된 카메라, 표백을 사용 O 이미지 캡처.

5. SIB 선정 및 복제

1. 가장 높은 활성을 선택 풀 (외배엽 조직에 가장 큰 응답).
2. (위의 프로토콜 섹션 2를 사용) 이전 단계의 식민지를 가장 높은 활성을 가진 풀의 글리세롤 주식을 (적절한 밀도 LB로 희석) 약 십분의 일에 열 새로운 판을 판 적정한다.
3. 활동이 하나의 식민지로 추적 될 때까지 풀의 크기를 줄입니다.
4. 벡터 표준 프라이머를 이용하여 DNA 서열을 얻습니다.

결과

동물 캡 조직 응답, 난자에 주입의 mRNA의 발현에 대응하여 현장 하이브리드 (그림 2, 표 1)에 의해의 Otx2의 발현을 측정 하였다;의 Otx2이 렌즈 placode를 통해 신경관 폐쇄에서 추정 렌즈 외배엽 (PLE)로 표현된다 농축 ^(19). 도의 Otx2 PLE 외부 전방 신경 외배엽뿐만 아니라 비 - 신경 외배엽 헤드 표현이기 때문에,이를 신경과 p...

토론

유능한 외배엽에서 반응을 유도 할 수있는 유전자의 기능적 클로닝 여기 기재된 방법은 유전자 산물의 넓은 범위를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 방법은 표현의 복제 기술과 조직 유도 분석을 결합하여 과거의 일에 확장합니다. 우리는 RNA 주입 다음, 직접 또는 간접적으로 유도 인자의 생성 소스로서 제노 푸스 난 모세포의 대사 경로를 이용한다. 이것은, 관심 cDNA 라이브러리 또는 클?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library