Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Zusammenfassung

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Zusammenfassung

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Einleitung

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function^1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers^3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning^6,7.

Our recent aim⁸ was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent⁹ animal cap ectoderm (stage 11-11.5¹⁰) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.

The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland^6,7, also successfully used by others^11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner¹⁴), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm⁸), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb1⁸), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von der University of Virginia Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

ANMERKUNG: Abbildung 1 eine schematische Übersicht über die experimentellen Verfahren.

1. Herstellung von Oozyten

1. Pre-prime X. laevis Weibchen mit 150 U Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) etwa eine Woche im Voraus über Eizelle Isolation. Injizieren Sie 1 ml 150 U / ml PMSG in Rücken Lymphsack mit 1 cc sterile Spritze mit 29 G-Nadel.
2. Bereiten Sie Lösungen für Oocyteninjektion und Oozyten-Tierkappe Assay.
   1. Vorbereitung Ca ^{++ /} Mg ⁺⁺ -freier OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mM Na _{2 HPO 4,} 50 mM HEPES pH 7,2.
   2. Bereiten OR2: OR2- plus 1 mM CaCl _{2 und 1} mM MgCl _2.
   3. Vorbereitung OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 ug / ml Gentamycin, pH 7,8.
   4. Prepare 1x MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM _CaCl 2, 1 mM MgSO _{4, 5} mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO _3.
   5. Bereiten Sie 3% Ficoll in 1x MBS.
   6. 1fach NAM: 110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca _(NO 3) 2, 1 mM MgSO _4, 0,1 mM EDTA, 1 mM _NaHCO 3, 2 mM Na _{3 PO 4,} pH 7,4.
3. Betäuben die Frau in einer 0,03% igen Lösung von Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonatsalz (MS222) in 0,1 MBS (erste aufzulösen 0,3 g MS222 in 10 ml 95% Ethanol, dann in 1 L 0,1 x MBS verdünnen), indem Frosch in Lösung 10-15 Minuten oder bis nicht mehr reagiert.
   1. Prüfen Sie, ob der Anästhesie abgeschlossen durch Drehen narkotisierten Frosch auf den Rücken, um sicherzustellen, es reagiert nicht (vollständig betäubten Froschschenkel zu bewegen oder drehen Körper über) ist.
4. Chirurgisch zu isolieren Eierstockfragmente, indem sie ein Bauchschnitt durch die Haut und Körper Wand mit Skalpell, Isolieren Eierstockgewebe mit einer Pinzetteund Schere. Zeigen Eierstock Fragmente in OR2-. Schließen Sie die Körperwand mit einem 3-0 Seidennaht auf einem 24 mm gebogene Nadel und schließen Sie die Haut separat mit den gleichen Nähten. Eine Wiederherstellung der weiblichen in 1 g / l Aquarium Salz in Wasser.
5. Verwenden feinen Pinzette, reißEierStockGewebe in kleine (10 - 20 Eizellen) Stücke und Transfer zum frischen OR2-.
6. Defolliculate ovarian Fragmente in 2,0 mg / ml Collagenase A in OR2- durch Rühren vorsichtig auf einem Schüttler für 1 Stunde, der Übertragung auf frische Kollagenase und Rühren für eine weitere Stunde.
7. Wasch Oozyten 10mal OR2 [Ca ^{++ /} Mg ⁺⁺ enthält], Verwerfen kleiner Oozyten.
8. Waschen Sie Oozyten in OCM zweimal und übertragen an die frische OCM. Isolieren Stufe VI Oozyten nach Größe bei Sichtprüfung und entsorgen unreifen (kleinere) Oozyten: Stufe VI Oozyten sind größer als die unreifen Eizellen mit noch Pigmentierung im Tier Hemisphäre und etwa 1,2 bis 1,4 mm Durchmesser.
9. Pflegen Oozyten bei 18 - 20 ° C in OCM vor der Injektion. Hinweis: Agarose-beschichteten Petrischalen verwendet werden, um ein Anhaften von Eizellen zu minimieren, austeilen wird.

2. Injektion Bibliothek Transcripts

1. Vorbereitung einer direktionalen cDNA-Bank ¹⁵ unter Verwendung von RNA in einem geeigneten Stadium der Entwicklung (beispielsweise neuronale Platte Stufe 14 ¹⁰⁾ extrahiert. Erwerben Sie eine cDNA-Bibliothek oder konstruieren eine Verwendung eines kommerziellen Kits pro Übersicht in den vier Schritten unten.
   1. Isolieren Sie etwa 5 ug mRNA mit einem Produkt, für Poly (A) + RNA (Siehe Tabelle der Materialien) zu bereichern und nach den Anweisungen des Herstellers. Anmerkung: Die Transkripte verwendet werden, um die cDNA-Bibliothek kann auf ein induzierendes Gewebe beschränkt sein zu erzeugen (wie beispielsweise das neuronale Platte nach Mikrodissektion des gewünschten Gewebes) oder kann aus ganzen Embryonen in einem bestimmten Stadium können.
   2. Produzieren cDNA mit einem kommerziellen Kit nach Herstelleranweisungen.
   3. Ligieren ungefähr 20 ng cDNA in einen vector, das mit dem kommerziellen Kit oder einem anderen geeigneten Vektor. Einen geeigneten Plasmidvektor enthält Sequenzen, die für mRNA-Stabilität, wie beispielsweise 5'-β-Globin-3 Poly (A) -Sequenzen (pCS2 +, pTnT, pCS105).
   4. Transform-Ligation in kompetente Bakterienzellen mit Lieferanten empfohlenen Protokoll für Hitzeschock-Transformation.
      Hinweis: Alternativ ist eine Sammlung von offenen Leserahmen (ORFeome) Klone Handel erhältlich und können verwendet werden, um Transkripte für die Injektion zu erzeugen.
2. Herstellung von 10 Pools von Plasmiden ^von 10 3 bis 10 ⁴ Komplexität ^(10. April - 10. MAI Gesamtkomplexität). Dies entspricht 10 Platten mit 1.000 - je 10.000 Kolonien.
   1. Plattenbibliothekskultur auf 10 15-cm-LB-Ampicillin-Platten, wachsen 12 bis 18 h bei 37 ° C, und sammeln Sie Kolonien von jeder durch sanften Druck mit einem Glas Treuer in 7 ml LB.
   2. Bereiten Sie eine Glycerin-Stamm von 0,5 ml (0,2 ml sterilem Glycerin und Speicher hinzuzufügen bei -20 &# 730; C), und verwenden Sie die verbleibenden 6,5 ml, um DNA mit einem Standard-Vorbereitung im Handel erhältlichen DNA Miniprep Kit folgenden Herstellers.
3. Linearisieren gepoolte Plasmid-DNA (1,0 bis 2,0 & mgr; g) mit geeigneten Restriktionsenzymverdau ¹⁶ bei 37 ° C für 1 - 1,5 Stunden. Isolieren Sie die linearisierte DNA mit Phenol / Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanolfällung und Resuspension in Wasser nach den Vorgaben der RNA-Polymerase-Kit verwendet wird. Synthetisieren Sinn-RNA mit einer RNA-Polymerase kommerziellen Kits nach Herstelleranweisungen.
4. Vorbereitung Nadeln für die Mikroinjektion (Verwendung einer Nadel Abzieher mit Glaskapillarröhren) von etwa 20 um Durchmesser; messen Nadelspitzen auf einem zusammengesetzten Mikroskop mit einem kalibrierten Okularmikrometer. Hinweis: Nadelzieher Einstellungen müssen empirisch bestimmt, um eine Nadel mit einer feinen Spitze, so dass, wenn sie mit einer feinen Pinzette gebrochen ergibt die gewünschte Düsengröße zu erzeugen.
5. Prepare (Push Ton ingleichmäßige Schicht auf der Unterseite der Schale) Lehm ausgekleideten 35 x 10 mm Petrischalen mit parallelen Rillen an Eizellen in während Mikroinjektion zu halten; produzieren Nuten mit einem Einkaufszentrum Sonde oder Pasteur-Pipette an der Spitze in Flammen fusioniert. Als Alternative zu Ton, vorzubereiten Agarose Gerichte machen Vertiefungen mit einem Elastomer ^Form 17. Übertragungs Oozyten mit weiter Bohrung Pipette bis 3% Ficoll in 1X MBS (ca. 2 ml) in Reihen in den Lehm ausgekleidet Gerichte.
6. Verwendung Mikroinjektor, füllen Nadel mit 1 ng / nl RNA und stellen Balance leichten Überdruck zu erzeugen (Ausarbeitung Eizelle Zytoplasma zu verhindern).
7. Injizieren Oozyten, die mit etwa 20 nl RNA in der Äquatorregion. Lassen Sie 1 Stunde für die injizierten Oozyten in Ficoll-MBS bleiben, dann übertragen Sie vorsichtig, um 1x MBS. Inkubation für 8 bis 24 Stunden bei 20 ° C vor der animal cap Assay.

3. Tier Cap Assay

1. Bereiten Sie 3 / 4x NAM und erhalten feinen Pinzette, Haarschleife, gekrümmte Deckglas-Fragmente, Ton ausgekleideten dishes mit becherförmigen Vertiefungen, um Eizellen zu halten. Machen Sie gebogene Deckglas-Fragmente durch Auseinanderbrechen Deckgläser in kleine Fragmente (ungefähr 1-2 mm x 2 - 4 mm) und durch Flammen, bis Kanten polieren und hängen, wodurch ein Kurvenstück.
2. Düngung X. laevis Eiern ^{18 durch} in vitro oder natürliche Paarung und Kultur Stufen Gastrula (10 - 11 Stunden nach der Befruchtung bei RT) in 0,1 x MBS vor der Sortierung nach Stufe; Sammeln Mitte der Gastrula (Stufe 11 bis 11,5) ¹⁰ Embryonen.
3. Transfer-Embryonen in eine Petrischale etwa zur Hälfte mit 3/4-fach NAM. Die Verwendung von zwei Paaren von feinen Pinzette, entfernen Fertilisation (Dotter) Membran von Gastrulen.
4. Transfer Oozyten bis 3 / 4x NAM (etwa 2 ml) in Ton ausgekleideten Gerichte und unbeweglich in einzelnen Eindrücke im Ton, Erzeugung Eindrücke auf einzelne Embryonen unterzubringen als Nuten wurden oben beschrieben.
5. Transfer-Embryonen, um den Ton ausgekleideten Gerichte und schneiden animal caps off gastrulae mit zwei Paaren von feinen Pinzette. Achten Sie darauf, Tierkappe Ektoderm nur und nicht die Äquatorial Gewebe ¹⁸ zu isolieren.
6. Platzieren eines Tieres Kappe auf dem Tierhemisphäre jede Oozyte mit der Innenfläche des Tierkappe Kontaktieren der Eizelle. Halten Rekombinanten gemeinsam durch Anlegen gekrümmten Deckglas-Fragment und nach unten gedrückt, um das Glas, Abflachen des Ektoderms wie die Deckkontakte des Tons (animal caps kann mit der Innenschicht auf die Oberfläche der Eizelle für 6 ausgesetzt bleiben offen - 8 h oder länger ).
   Hinweis: Sie können auch den Tierkappe in einem Ton-Einzug mit seiner Innenfläche nach oben und legen Sie eine Eizelle an der Kappe; sichern die rekombinante mit kleinen Erweiterungen von Ton.
7. Kultur bei 20 ° C, bis Steuer Embryonen reach gewünschte Bühne für Assay.
8. Separate rekombinanten durch Entfernen Deckglas / Ton und Isolieren Ektoderm mit einer Pinzette und einer Haarschleife.
9. Fix ektodermalen Fragmente für 1 Stunde in MEMFA (3,8%Formaldehyd in MEM [0,1 M MOPS, pH 7,4, 2 mM EGTA und 1 mM MgSO _4]).
10. Transfer-Fragmente (und Kontrolle Embryonen) aus MEMFA zu Ethanol und bei -20 ˚C.

4. Analyse der Antwort in Ektoderm durch in situ Hybridisierung (ISH)

1. Bereiten Sie Lösungen für die ISH.
   1. Vorbereitung 1x PBS: 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 0,138 M NaCl, pH 7,4
   2. Vorbereitung PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% Tween-20
   3. Vorbereitung 100x Denhart-Lösung: 2% BSA, 2% Polyvinylpyrrolidon, 2% Ficoll
   4. Vorbereitung Hybridisierungspuffer: 50% Formamid, 5 × SSC, 1 mg / ml Hefe-RNA torula, 1 ug / ml Heparin, 1x Denhart-Lösung, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC-H _{2 O}
   5. Vorbereitung Maleinsäure-Puffer (MAB): 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5
   6. Bereiten MAB + Block: MAB, 2% Blockierungsreagenz (Wärme bis 60 ° C zu lösen)
   7. Vorbereitung alkalische Phosphatase (AP) Puffer: 100 mM TrispH 9,5, 50 mM MgCl _{2, 100} mM NaCl, 0,1% Tween, dH _{2 O}
2. Bereiten Sie die RNA-Sonde.
   1. Unter Verwendung eines kommerziellen RNA-Polymerase-Kit und graben-NTP-Mix, fügen Sie in ein 1,5-ml-Röhrchen (50 & mgr; l-Reaktion): 25,5 & mgr; l _DEPC-H 2 O, 10 ul 5X Transcription Buffer, 2,5 ul 10x dig-NTP-Mix, 5 ul 100 mM DTT, 2 ul RNAsin, 2 ul linearisierte DNA-Templat (~ 1 ug / ul), 3 ul RNA Polymerase und Inkubation 37 ° C für 90 min.
   2. In 2 ul RNA Polymerase und Inkubation 37 ° C für 60 min.
   3. Prüfen 2 ul Reaktions auf 1% Agarose-Gel.
   4. 1 ul RQ1 RNase-Free DNase und Inkubation 37 C für 20 min.
   5. Fällt die Sonde durch Zugabe von 50 & mgr; l DEPC-H _{2 O,} 25 ul 10 M Ammoniumacetat und 313 ul Ethanol. Lagerung bei -20 C über Nacht (O / N), dann erholen RNA durch Zentrifugation bei 13.800 × g für 20 min. Mit 500 ul 75% Ethanol waschen, kurz drehen, entfernenEthanol und ermöglichen Pellet an der Luft trocknen. In 50 ul _DEPC-H 2 O.
   6. Hinzufügen Hybridisierungspuffer bis zu einer Endkonzentration von ~ 0,5 ug / ul.
3. Bereiten Tissue für die Hybridisierung. Wenn nicht anders angegeben, füllen Fläschchen an die Spitze mit jeder Lösung Änderung beschrieben (ca. 4 ml).
   1. Entfernen von Ethanol aus Fläschchen und Transfer-Embryonen in 75% Ethanol / PTW, dann 50% Ethanol / PTW für jede 10 min, horizontal auf Wippe.
   2. Dreimal Waschen in PTW für jeden auf Wippe 5 min.
   3. Transfer zum 10 ug / ul Proteinase K-Behandlung in PTW; Rockröhren vertikal 15 min.
   4. Spülen Sie zweimal je 10 min in 0,1 M Triethanolamin pH-Wert 7,8 - Rockröhren vertikal.
   5. In 12,5 ul Essigsäureanhydrid, um Rohre und Rock vertikal 5 min. Wiederholen Sie mit zusätzlichen 12,5 ul Essigsäureanhydrid für 5 min.
   6. Waschen Sie in PTW 5 min vertikal auf Wippe.
   7. REFIX in 4% Paraformaldehyd 20 min auf Wippe. Wärmehybridisierungspufferbis 60 ° C.
   8. Dreimal Waschen in PTW für jeden auf Wippe 5 min.
   9. Entfernen Sie alle, aber ~ 1 ml PTW aus jedem Röhrchen und fügen Sie 250 ul Hyb-Puffer; leicht schwenken Rohre zu mischen. Rockröhren vertikal 5 min.
   10. Ersetzen Sie mit 60 ˚C Hyb-Puffer (0,5 ml) und leicht rühren bei 60 ° C 10 min. Ersetzen mit frischem Hyb Puffer und rühren bei 60 ° C zwei bis 4 Stunden.
   11. Wärmesonde (1 ml bei 0,5 ug / ul in Hyb-Puffer) bis 60 ° C (3 min). Entfernen Hyb Puffer und Sonde in Rohren. Leicht bewegen O / N bei 60 ° C.
4. Bereiten Tissue für Antikörper.
   1. Warm Hyb Puffer und 2x SSC + 0,1% Tween-20-Lösungen bis 60 ° C.
   2. Ersetzen Sondenlösung mit Hyb Buffer (Speichern Sonden bei -20 ° C für 2 - 3x Wiederverwendung). Für 10 Minuten bei 60 ° C waschen.
   3. Dreimal bei 60 ° C in 2 × SSC-Tween (20 min je unter Rühren) zu waschen.
   4. Dreimal bei 60 ° C in 0,2 × SSC-Tween (20 min je unter Rühren) zu waschen.
   5. Zweimal für jeweils 15 min horizontal auf Wippe waschen in MAB (RT).
   6. 1 ml MAB + Block. Waschen Sie 2 Stunden vertikal auf Wippe.
   7. Transfer zum 1 ml MAB + Block mit einer 1 / 2.000 Anti-Digoxygenin-AP. Rock vertikal bei 4 CO / N.
5. Bereiten Tissue für Farbreagenz.
   1. Ersetzen Antikörperlösung mit MAB; waschen dreimal MAB 5 min jeweils horizontal auf Wippe.
   2. Drei Mal in MAB 1 Stunde jeweils horizontal auf Wippe waschen.
   3. Zweimal in AP-Puffer jeweils 10 Minuten horizontal auf Wippe waschen.
   4. Bringen Gewebe Mehr auch Kunststoffwanne, entfernen AP-Puffer und fügen BM Lila Reagenz (~ 1 ml). Erlauben Reaktion auf in der Dunkelheit 5 Minuten bis O / N fortfahren.
   5. Wenn entsprechende Färbung erreicht ist, zu übertragen, um Gewebedurchstechflaschen mit PTW. Zwei Mal jeweils 10 Minuten auf Wippe waschen in PTW.
   6. Fix in Bouin-Lösung bei 4 CO / N auf Wippe.
   7. Waschen Sie Bouin-mit drei 70% Ethanol / 30% PTW Wäschen bei RT. Gehen to Aufnahme von Bildern mit Auflicht und ein Mikroskop montierten Kamera, Bleichen wenn nötig ^18.

5. Sib Auswahl und Klonierung

1. Wählen Sie Pool mit der höchsten Aktivität (größte Resonanz in ektodermalen Gewebe).
2. Man titriert (verdünnte mit LB, geeignete Dichte) das Glycerin Lager für den Pool mit der höchsten Aktivität und Platte aus zehn neuen Platten mit etwa einem Zehntel der Kolonien aus dem vorherigen Schritt (unter Verwendung von Abschnitt 2 in Protokoll oben).
3. Poolgröße zu reduzieren, bis Aktivität auf einzelne Kolonie zurückverfolgt.
4. DNA-Sequenz zu erhalten, unter Verwendung von Standard-Primer im Vektor.

Ergebnisse

Als Reaktion auf die Expression von mRNA in Oozyten injiziert und reagiert animal cap-Gewebe wurde für die Expression von OTX2 durch in situ-Hybridisierung (Figur 2 und Tabelle 1) untersucht; OTX2 wird in der mutmaßlichen Linsen Ektoderm (PLE) aus Neuralrohrschlusses durch Linsenplakode exprimiert Verdickung ^19. Da jedoch OTX2 ist auch in der vorderen neuronalen Ektoderm sowie nichtneuralen Kopf Ektoderm außerhalb des PLE...

Diskussion

Die für die funktionale Klonierung von Genen in der Lage, eine Antwort in kompetente Ektoderm Induzieren hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Genprodukten zu identifizieren. Diese Methode baut auf früheren Arbeiten durch die Kombination von Gewebe-induzierende Assays mit Ausdruck Klonierungstechniken. Wir nutzen die Stoffwechselwege des Xenopus-Oozyten als Quelle der Erzeugung von induzierende Faktoren, die direkt oder indirekt folgende RNA-Injektion. Dies in Kombination mit...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	12/101	Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	for ISH
Acetic anhydride	Sigma	A6404	for ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Plasmid DNA purification
Blocking Reagent	Roche	11096176001	for ISH
BM Purple	Roche	11442074001	for ISH
Boekel Hybridization Oven	Fisher Scientific	13-245-121	for ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	for ISH
BSA	Sigma	A9647	for OCM
CHAPS	Sigma	C3023	for ISH
Collagenase A	Roche	10103578001	Defolliculation of oocytes
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly embryos
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	for ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	for ISH probes
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	500233	for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 anesthetic
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	for Injection media
Formamide	Sigma	F9037	for ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	for OCM
Glass capillaries	World Precision Instruments	4878	3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials	Fisher Scientific	06-408B	for ISH
Hair loop			Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt	Sigma	H4784	for ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA library
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid	Sigma	M0375	for ISH
Manual Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manual micromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker for ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P5368	for ISH
PMSG	Sigma	G4877	to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	for ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Micropipette needle puller
Proteinase K	Sigma	P6556	for ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	cDNA library construction
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit	Life Technologies	18248013	kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk	Fisher Scientific	19-037-516	Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA	Sigma	R3629	for ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	for ISH
Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cells for transformation of cDNA library