توصيف الأنسجة بعد طريقة جديدة تصنيفها فيما يتعلق الجلد الصغرى الطعوم الجيل

Summary

يصف بروتوكول طريقة جديدة لتفصيل الأنسجة البشرية وخلق ذاتي الطعوم الدقيقة التي، جنبا إلى جنب مع الإسفنج الكولاجين، وتؤدي إلى الحيوي المجمعات البشرية جاهزة للاستخدام في علاج آفات الجلد. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النظام يحافظ على بقاء الخلية الطعوم الدقيقة في أوقات مختلفة بعد التقسيم الميكانيكية.

Abstract

وقد وضعت عدة أساليب جديدة في مجال التكنولوجيا الحيوية للحصول على تعليق الخلوية ذاتي أثناء الجراحة، من أجل توفير العلاجات خطوة واحدة للآفات الجلدية الحادة والمزمنة. وعلاوة على ذلك، فإن إدارة الجروح الحادة المزمنة ولكن أيضا الناجم عن الصدمات النفسية، ومرض السكري والالتهابات وأسباب أخرى، لا يزال تحديا. في هذه الدراسة وصفنا طريقة جديدة لخلق ذاتي الطعوم الصغيرة من الأنسجة الجلدية للمريض واحد وتطبيقاتها السريرية. وعلاوة على ذلك، كما أجريت في المختبر توصيف البيولوجي للأنسجة الجلدية المستمدة من الجلد، والأدمة-epidermized دي (ديد) والأدمة متعددة الجهاز و / أو الجهات المانحة متعددة الأنسجة. تم تصنيف جميع الأنسجة هذا البروتوكول الجديد، مما يتيح لنا الحصول قابلة للتطبيق الطعوم الدقيقة. على وجه الخصوص، وذكرت أن هذا البروتوكول مبتكرة قادرة على إنشاء المجمعات الحيوية ألحان ذاتي الطعوم الدقيقة والإسفنج الكولاجين جاهزة ليتم تطبيقها على الآفات الجلدية. وكلينيوذكرت تطبيق كال من ذاتي المجمعات الحيوية على آفة الساق أيضا، أظهرت حدوث تحسن في كل عملية إعادة epitalization ونعومة الآفة. بالإضافة إلى ذلك، أظهر لنا في المختبر النموذج الذي بقاء الخلية بعد التقسيم الميكانيكية مع هذا النظام هو الحفاظ على مر الزمن لمدة تصل إلى سبعة (7) أيام من الثقافة. لاحظنا أيضا، من خلال تحليل التدفق الخلوي، الذي يتكون من مجموعة من الخلايا التي تم الحصول عليها من تصنيف العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية الوسيطة، التي تمارس دورا رئيسيا في عمليات تجديد الأنسجة وإصلاحها، لإمكانات التجدد العالية. وأخيرا، أثبتنا في المختبر أن هذا الإجراء يحافظ على عقم الطعوم الدقيقة عندما مثقف في أطباق أجار. وباختصار، فإننا نستنتج أن هذا النهج التجديدي الجديد يمكن أن يكون أداة واعدة بالنسبة للأطباء للحصول على في خطوة واحدة قابلة للحياة، معقمة وجاهزة للاستخدام الطعوم الدقيقة التي يمكن تطبيقها وحدها أو بالاشتراك مع معظم scaffo البيولوجية المشتركةلدس.

Introduction

في السنوات الأخيرة، وقد وضعت عدة أساليب جديدة في مجال التكنولوجيا الحيوية للحصول على تعليق الخلوية ذاتي أثناء الجراحة من أجل تقديم العلاج خطوة واحدة للآفات الجلدية الحادة والمزمنة. وعلاوة على ذلك، فإن إدارة الجروح الحادة ولكن المزمنة أساسا الناجمة عن الصدمات النفسية، ومرض السكري، والالتهابات، وغيرها من الأسباب، لا يزال تحديا. وهناك أدلة متزايدة على أن الجروح المزمنة أصبحت مشكلة صحية عالمية خطيرة، مما تسبب عبئا ماليا هائلا على أنظمة الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم ^1.

لزيادة نسبة النجاح في علاج آفات الجلد، وعدم وجود تلاعب واسعة النطاق (بما في ذلك تعزيز الخلوي) والحفاظ على ظروف معقمة ضرورية، من أجل خلق تعليق الخلوية التي يمكن تطبيقها على الفور على المنطقة المتضررة من المرضى، وبالتالي تجنب تجهيز أطول في غرف الأبحاث مثل مصانع الخلية. شارعarting من خزعات الجلد الصغيرة، والطحن، الطرد المركزي وطرق الفصل أخرى (على سبيل المثال، الأنزيمية أو الميكانيكية)، كثيرا ما تستخدم للحصول على تعليق الخلوية، التي يمكن تربيتها في وسط النمو. كل من هذه الأساليب تحتاج عادة إلى فترة طويلة من التنفيذ، مشددا على هياكل الخلية، ويؤدي إلى الحد من بقاء الخلية. الجانب المهم الآخر هو الحصول على تعليق الخلوي الذاتي على استعداد لاستخدامها من قبل الأطباء، على سبيل المثال، لإصلاح المناطق المتضررة. وعلاوة على ذلك، فإنه من الثابت أيضا أن ترقيع الأنسجة ذاتي البقاء على قيد الحياة إجراءات نقل البقاء على قيد الحياة في نهاية المطاف في موقع المتلقي بمبادئ الاستقراء والتوصيل ^{2 و 3.} وينبغي أن تكون الأنسجة الكسب غير المشروع مثالية متاحة بسهولة ويكون منخفض استضداد والجهات المانحة موقع الاعتلال ^4.

على أساس هذه الأدلة، كان الهدف الأول من هذه الدراسة هو خلق ذاتي المجمعات الحيوية المناسبة لالتطبيق السريري في إصلاح الأنسجة. لهذا الغرض، ونحن تصف طريقة جديدة للحصول على ذاتي الطعوم الدقيقة بدءا من الأنسجة الجلدية التي كانت مصنفة حسب هذا البروتوكول. كما يوصف عرض القضية هنا بمثابة التطبيق السريري لذاتي الطعوم الدقيقة التي حصلت عليها هذا البروتوكول في تركيبة مع الإسفنج الكولاجين. وقد سبق وذكرت هذا النهج لتكون فعالة في تصنيف الميكانيكي للأنسجة البشرية ⁵ و تم استخدامه سريريا لترقيع وتجديد الأنسجة الجلدية ^6،7 فضلا عن علاجات التجدد الأنسجة الضامة في جراحة الفم-الفكين ^8-10 .

وبالإضافة إلى ذلك، كان الهدف الثاني من هذه الدراسة توصيف البيولوجي للأنسجة الجلدية بعد التقسيم من خلال هذا البروتوكول. لهذا الغرض، وعينات مثلي مختلفة من الأنسجة الجلدية المستمدة من منطقة جذع مختلف الأعضاء المتعددةوتمت معالجة / أو الجهات المانحة متعددة الأنسجة التالية قوانين الوطنية على حصاد ومعالجة وتوزيع الأنسجة للزرع (CNT 2013) في بنك الجلد إميليا رومانيا الإقليمي.

حالة عرض تقديمي:

وقد اعترف المريضة البالغة من العمر 35 عاما تظهر الصدمة معقدة بسبب حادث سيارة إلى وحدة العناية المركزة في مستشفى أنكونا. أظهر المريض التهاب في الساق بسبب جرح مفتوح وكسر مركب استقر مع تثبيت خارجي. تم تنفيذ اثنين التنضير جذري وعندما أصبح الجرح نظيفة بعد العلاج الضغط السلبي (العلاج VAC) والسمحاق ظهر صحية، وتطبيق البروتوكول بعد شهرين من الانتعاش. بعد التقسيم مع هذا النظام، تم استخدام الطعوم الدقيقة التي تم الحصول عليها لإنشاء المجمعات الحيوية مع اسفنجة الكولاجين التي تم زرعها في وقت لاحق من أجل تحقيق فعاليتها على إصلاح الآفة.

Protocol

بيان الأخلاق: منذ التطبيق السريري البروتوكول يتطلب استخدام الأنسجة ذاتي الجلدية للمريض، وإجراء توصيف في المختبر قبل الاستخدام السريري في الأنسجة الجلدية مثلي في بنك الجلد إميليا رومانيا الإقليمي فقا للمبادئ التوجيهية للقوانين الوطنية على التجميع و التصنيع وتوزيع الأنسجة للزرع (CNT 2013).

1. بناء السيرة الذاتية المعقدة لتطبيق السريرية

ملاحظة: يستند هذا البروتوكول سريريا على استخدام Rigeneracons (اختلال والأنسجة) وآلة Rigenera (انسجة الجهاز اختلال) (الشكل 1A). واختلال والأنسجة هو اختلال والطبي البيولوجي للأنسجة البشرية قادرة على تعطيل قطع صغيرة من الأنسجة باستخدام شبكة تقدمها شفرات سداسية الخلايا وتصفية ومكونات المصفوفة خارج الخلية مع قطع من حوالي 50 ميكرون.

1. جمع skinsamples للمريض من خلال ثنائيةopsy لكمة (الشكل 1B) وتفصيلها بإضافة 1 مل من محلول ملحي لكل قطعة الحصول ذاتي-الطعوم الدقيقة ^6،7،9 (أو راجع الخطوة 2.1).
2. ضع 1 مل من الطعوم الدقيقة على الإسفنج الكولاجين (الشكل 1C) toform المجمعات الحيوية لاستخدامها في التطبيق السريري.
3. ثقافة أخرى 1 مل من الطعوم الدقيقة على الإسفنج الكولاجين في وجود 6 مل من المتوسط ​​DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ جو مرطب.
4. بعد 3 أيام من الثقافة، وتحديد المجمعات الحيوية مع 0.3٪ امتصاص العرق لمدة 10 دقيقة في RT. صب البارافين مع موزع معين مباشرة على العينة. الحصول على شرائح مع مشراح مع سمك من 5 ميكرون وضعت مباشرة في الزجاج الشرائح.
5. تزج شرائح البارافين من 5 ميكرون في كوب لتحليل النسيجي، تحتوي على 15 - 20 مل الزيلين (متوفرة تجاريا - مزيج من م-زيلين (40 - 65٪)، ف زيلين (20٪)، الزيلين (20٪ ) وETHالبنزين YL (6-20٪) وآثار التولوين والبنزين ثلاثي، الفينول، ثيوفين، البيريدين وكبريتيد الهيدروجين) لمدة 3 دقائق لكل منهما.
6. تزج الشرائح في خفض درجات (100٪ إلى 70٪) من الإيثانول (الإيثانول بنسبة 100٪ ل1HR، 95٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة، 80٪ من الإيثانول ل1HR، 70٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة) والماء ثم منزوع الأيونات لإزالة paraffinizing والمضادة للجفاف الفروع.
7. وصمة عار على أقسام مع 1-2 مل من 1G / L Ematoxylin 1 - 2 دقيقة وبعد ذلك يشطف في الماء لإزالة أي فائض Ematoxylin.
8. وصمة عار على الأبواب ل4-5 دقيقة مع يوزين Y حل الكحولية بنسبة 1٪ من تركيز مختلطة مع الايثانول 70٪ والمخفف في الماء.
9. استخدام 1-2 مل من يوزين Y لكل قسم الشرائح وشطف تحت ماء الحنفية.
10. تزج المقاطع في زيادة درجات من الإيثانول (راجع الخطوة 1.6)، وأخيرا، وبعد مرور في الزيلين ل1H، ساترة مع تركيب أساس mediumand مراقبة تحت المجهر في ضوء التكبير 100X (1D الشكل).

2. جمع وتبويب وتحليل في المختبر من الأنسجة

1. باستخدام جلدي، واتخاذ الأنسجة مستقلة الجلد، وحليمي الأدمة-epidermized دي بدبي أو الأدمة الشبكية (الأدمة) على التوالي من 0.6 ملم، 1 مم أو 2 مم في السمك من منطقة جذع 4 مختلف الأعضاء المتعددة و / أو متعددة الجهات المانحة الأنسجة في نطاق 40-55 عاما، بعد قوانين وطنية حول حصاد ومعالجة وتوزيع الأنسجة للزرع (CNT 2013).
   1. شطف بلطف جميع العينات في 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم وضعها في طبق على شاكر المداري لمدة 5 دقائق.
   2. عن طريق خزعة لكمة 5 ملم، وخلق عينات التي تكون موحدة في قطر من أنسجة الجلد، ديد والأدمة وتزن كل عينات الأنسجة قبل التقسيم.
   3. إدراج ثمانية، ثلاثة أو أربعة نماذج موحدة للأنسجة الجلد، ديد أو الأدمة على التوالي، في اختلال والأنسجة، مضيفا 1.5 مل من محلول ملحي للتصنيف.
   4. أداء مختلفةأوقات تفصيل لجميع عينات الأنسجة كما هو مبين في الجدول رقم 1.
   5. استخدام عدد مراسل الخزعات لكمة المستمدة من عينات أنسجة سليمة والضوابط.
   6. بعد التقسيم الميكانيكية، ونضح محلول ملحي يحتوي على الطعوم الدقيقة ومكان منفصل كل عينة في بئر واحدة من لوحة ال 12 أيضا. تنفيذ نفس بروتوكول لالخزعات لكمة سيطرة سليمة.
   7. إضافة 1ml من المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) والمضادات الحيوية على كل عينة.
   8. تقييم بقاء الخلية على الفور. إلى كل منها يحتوي أيضا على الكسب غير المشروع الصغير (تم الحصول عليها من قبل التفصيل في وقت واحد من ثمانية، ثلاثة أو أربعة نماذج موحدة للأنسجة الجلد، ديد أو الأدمة على التوالي) إضافة 1ml من المتوسط ​​تحتوي على 0.5 ملغ / مل من الإنتقالي العسكري (3- [4،5- dimethylthiazol-2-YL] -2،5 diphenyltetrazolium بروميد) حل واحتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO ₂ / الهواء. تنفيذ نفس بروتوكول للسيطرة على حالهالكمة خزعات.
   9. بعد الحضانة، وإزالة كافة المتوسطة التي تحتوي على الإنتقالي العسكري وإضافة إلى كل عينة 1 مل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لمدة 10 دقيقة.
   10. نقل كل عينة وDMSO في كفيت وقراءة في الكثافة الضوئية (OD) في 570 نانومتر باستخدام مطياف. حساب بقاء الخلية على أنها نسبة الامتصاصية في 570 نانومتر، والوزن في غرام (غرام) من الأنسجة المستخدمة قبل التقسيم. تنفيذ نفس بروتوكول لالخزعات لكمة سيطرة سليمة.
2. بعد التقسيم الميكانيكية، ونضح محلول ملحي يحتوي على الكسب غير المشروع الصغير المشتقة من أنسجة الجلد، ديد والأدمة عينات من متبرع واحد.
   1. وضع على حدة كل عينة في بئر واحدة من لوحة 12-جيدا أو في قارورة الثقافة لاختبار سلامة الخلية والتحليل الصرفي على التوالي.
   2. ثقافة الصغيرة الطعوم بإضافة 1 مل (لوحة 12 أيضا) أو 5 مل (الثقافة قارورة) من المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع 10٪ FBS والمضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO ₂ / منظمة العفو الدوليةص 24 ساعة أو 7 أيام.
   3. تقييم بقاء الخلية بعد 24 ساعة أو 7 أيام (كرر الخطوات 2.1.8-2.1.10).
   4. أداء التحليل الصرفي تقييم وجود تعليق الخلية بواسطة المجهر الضوئي بعد 24 ساعة و 7 أيام الثقافة في قارورة.
   5. تحليل عينات من الأدمة بالفيروس إلى الوسيطة وعلامات الخلية المكونة للدم، بما في ذلك CD146، CD34 CD45 والمضادات عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية ^6.
   6. تحت الصفحي تدفق البذور غطاء محرك السيارة كل الكسب غير المشروع الصغير (تم الحصول عليها من قبل التفصيل في وقت واحد من ثمانية، ثلاثة أو أربعة نماذج موحدة للأنسجة الجلد، ديد أو الأدمة على التوالي) ومراسل جزء صغير من كل عينة الأنسجة عدم تفصيل تماما (> 50 ميكرون في الحجم بعد عملية التقسيم) على لوحة أجار كولومبيا تحتوي على 5٪ الدم الأغنام مرق 100 ميكرولتر.
   7. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام وإجراء تحليل الميكروبيولوجي في كولومبيا لوحة آغار من أجل تقييم العقم ¹¹.

النتائج

في هذه الدراسة الأولية، وكان الهدف الأول للتحقيق في قدرة ذاتي الطعوم الدقيقة الإنسان جنبا إلى جنب مع دعم البيولوجي، مثل الكولاجين، لإنتاج المجمعات الحيوية جاهزة للاستخدام. تم زرع هذه المجمعات الحيوية في المريض مع آفة الساق الناجم عن حاد?...

Discussion

وأظهرت هذه الدراسة الأولية أن الطعوم الدقيقة التي حصلت عليها هذا البروتوكول يمكن الجمع مع الإسفنج الكولاجين، كما سبق أن ذكرت في التطبيقات السريرية الأخرى، لتحسين فعالية زرع الجزئي الطعوم ^{9 و 10.} وعلى وجه الخصوص، وذكرت هذه الدراسة قدرة الحيوية -complexes، مكونة من ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Human Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI medium	PBI International	733-2292
DMEM medium	PBI International	F 0415
Antibiotics	Biological Industries PBI	03-038-1
Antibodies for FACS Analysis	eBiosciences	code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		collagen sponge used for bio-complexes
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene	Carlo Erba