Gewebecharakterisierung nach einer neuen Disaggregation Methode für Haut Micro-Grafts-Generation

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine neue Methode menschliche Gewebe zu disaggregieren und autologe Mikrotransplantate zu schaffen, die mit Kollagenschwämmen kombiniert, bereit Anstieg der menschlichen bio-Komplexe geben bei der Behandlung von Hautläsionen zu verwenden. Dieses System erhält die Lebensfähigkeit der Zellen von Mikrotransplantaten zu verschiedenen Zeiten nach der mechanischen Disaggregation weiter.

Zusammenfassung

Mehrere neue Methoden wurden auf dem Gebiet der Biotechnologie zu erhalten autologe Zellsuspensionen während der Operation, zu schaffen, um einen Schritt Behandlungen bei akuten und chronischen Hautläsionen entwickelt. Darüber hinaus ist die Behandlung der chronischen, aber auch akute Wunden von Trauma, Diabetes, Infektionen und andere Ursachen, bleibt eine Herausforderung. In dieser Studie beschreiben wir eine neue Methode autologe Mikrotransplantate aus Hautgewebe eines einzelnen Patienten und ihre klinische Anwendung zu erstellen. Darüber hinaus kann in vitro biologische Charakterisierung von Hautgewebe , die aus Haut, de-epidermized Dermis (DED) und Dermis von Multi-organ und / oder multi-Gewebespendern wurde ebenfalls durchgeführt. Alle Gewebe wurden durch dieses neue Protokoll aufgeschlüsselt, so dass wir tragfähige Mikrotransplantate zu erhalten. Insbesondere berichteten wir, dass dieses innovative Protokoll ist in der Lage Bio-Komplexe, die durch autologe Mikrotransplantate und Kollagenschwämme bereit, auf Hautläsionen aufgetragen werden zusammensetzt. Die clinical Anwendung autologer Bio-Komplexe auf einem Bein Läsion wurde auch eine Verbesserung sowohl der Wieder epitalization Prozess und Weichheit der Läsion berichtet, zeigt. Zusätzlich haben unsere in vitro Modell zeigte , dass die Lebensfähigkeit der Zellen nach der mechanischen Disaggregation mit diesem System im Laufe der Zeit bis zu sieben (7) Tagen Kultur gehalten wird. Wir beobachteten auch durch Durchflusszytometrie-Analyse, dass der Pool von Disaggregation erhaltenen Zellen aus mehreren Zelltypen zusammengesetzt ist, einschließlich der mesenchymalen Stammzellen, die eine Schlüsselrolle in den Prozessen der Geweberegeneration und -reparatur, für ihre hohe Regenerationsfähigkeit ausüben. Schließlich haben wir gezeigt , in vitro , dass dieses Verfahren die Sterilität von Mikro-Transplantate beibehält , wenn in Agar Gerichte kultiviert. Zusammenfassend schließen wir, dass diese neue regenerative Ansatz ein viel versprechendes Instrument sein kann, für Kliniker in einem Schritt durchführbar, steril und gebrauchsfertig Mikrotransplantationen zu erhalten, die allein oder in Kombination mit den meisten gängigen biologischen scaffo angewendet werden kann,lds.

Einleitung

In den letzten Jahren haben mehrere neue Methoden auf dem Gebiet der Biotechnologie zu erhalten autologe Zellsuspensionen während der Operation, um in einem Schritt entwickelt Behandlungen für akute und chronische Hautläsionen bieten. Darüber hinaus, was die Behandlung von akuten, sondern vor allem chronische Wunden von Trauma, Diabetes, Infektionen und andere Ursachen, bleibt eine Herausforderung. Es gibt zunehmend Hinweise darauf , dass chronische Wunden ein ernstes Thema globale Gesundheit geworden sind, was eine enorme finanzielle Belastung für die Gesundheitssysteme weltweit ^1.

Um die Erfolgsrate bei der Behandlung von Hautläsionen, die Abwesenheit umfangreiche Manipulation (einschließlich zelluläre Verstärkung) und die Aufrechterhaltung der sterilen Bedingungen sind wichtig, um erhöhen, um eine Zellsuspension zu erstellen, die auf den beschädigten Bereich der angewendet werden kann sofort Patienten, wodurch eine längere Verarbeitung in Reinräumen wie Zellfabriken zu vermeiden. Stervorragend als Start von kleinen Hautbiopsien, Mahlen, Zentrifugation und andere Trennverfahren (beispielsweise enzymatisch oder mechanisch), werden häufig eine Zellsuspension zu erhalten , verwendet, die in einem Wachstumsmedium kultiviert werden kann. Alle diese Methoden erfordern im allgemeinen eine lange Zeit der Ausführung, die Zellstrukturen Beanspruchung und zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen führt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist es, eine autologe Zellsuspension zu erhalten, bereit, durch Kliniker verwendet werden, beispielsweise beschädigte Bereiche zu reparieren. Darüber hinaus ist es bekannt, dass autologe Gewebetransplantate die Transferverfahren überleben ³ in der Empfängerstelle von den Grundsätzen der Induktion und Leitung ^2, um schließlich zu überleben. Die ideale Transplantatgewebe sollte leicht zugänglich sein und haben eine geringe Antigenität und Entnahmemorbidität ^4.

Auf der Grundlage dieser Beweise, war das erste Ziel dieser Studie autologe bio-Komplexe zu schaffen, geeignet fürklinische Anwendung bei der Reparatur von Gewebe. Zu diesem Zweck beschreiben wir eine neue Methode autologe mikro Transplantaten zu erhalten, aus Hautgewebe ausgehend, die durch dieses Protokoll wurden disaggregiert. Ein Fall Präsentation wird auch hier als eine klinische Anwendung von autologem Mikro-Transplantate durch dieses Protokoll in Kombination mit Kollagenschwämme beschrieben erhalten. Dieser Ansatz wurde bereits berichtet worden , in der mechanischen Zerlegung von menschlichen Geweben ⁵ effizient zu sein und es ist klinisch für Transplantate und Regeneration von Hautgewebe ^6,7 sowie für regenerative Therapien von Bindegewebe in oral-Maxillofazialchirurg ^8-10 verwendet worden .

Zusätzlich wurde das zweite Ziel dieser Studie die biologische Charakterisierung der Hautgewebe nach der Disaggregation durch dieses Protokoll. Zu diesem Zweck abgeleitet verschiedene homologe Proben von Hautgewebe von dem Rumpfbereich verschiedener Multi-Organund / oder Multi-Gewebespender wurden folgende nationale Vorschriften verarbeitet auf Ernte, Verarbeitung und Verteilung von Geweben zur Transplantation (CNT 2013) in der Region Emilia Romagna Hautjordanland.

CASE PRÄSENTATION:

Eine 35-jährige Patientin ein komplexes Trauma wegen Autounfall zeigte, wurde auf der Intensivstation von Ancona Krankenhaus eingeliefert. Der Patient zeigte eine Infektion am Bein aufgrund einer offenen Wunde und einer Verbindung Bruch mit Fixateur externe stabilisiert. Zwei radikale Debridement wurden durchgeführt, und wenn die Wunde wurde sauber nach Unterdrucktherapie (VAC-Therapie) und der Knochenhaut erschien gesund, wir angewendet, um das Protokoll nach zwei Monaten aus der Rückgewinnung. Nach Desaggregation mit diesem System wurden die Mikrotransplantate erhalten verwendet bio-Komplexe mit einem Kollagenschwamm zu erzeugen, das anschließend implantiert, um wurden auf ihre Wirksamkeit auf die Läsion Reparatur zu untersuchen.

Protokoll

Ethik - Erklärung: Da die klinische Anwendung des Protokolls die Verwendung von Haut autologe Gewebe des Patienten erfordert, wurde seine Charakterisierung in vitro vor der klinischen Anwendung auf homologe Hautgewebe in Region Emilia Romagna Haut Bank ausgeführt worden nach den Richtlinien der nationalen Vorschriften über die Ernte, Verarbeitung und Verteilung von Geweben zur Transplantation (CNT 2013).

1. Bio-Komplex von Gebäuden für die klinische Anwendung

Hinweis: Dieses Protokoll ist klinisch basiert auf der Verwendung von Rigeneracons (tissue Disruptor) und dem Rigenera Maschine (tissue Disruptor - System) (1A). Verwendung eines Gitters, die von hexagonal Klingen und Filterzellen und Komponenten der extrazellulären Matrix mit einem cut-off von etwa 50 um das Gewebe Disruptor ist eine biologische medizinische Disruptor von menschlichen Geweben können kleine Stücke von Gewebe zu stören.

1. Sammeln skinsamples des Patienten durch eine biOPSY Stempel (1B) und disaggregieren Zugabe von 1 ml Kochsalzlösung für jedes Stück autologe Mikrotransplantate erhalten ^6,7,9 (oder dem Schritt 2.1 zu sehen).
2. Platz 1 ml Mikrotransplantate auf Kollagenschwämme (1C) toform bio-Komplexe für die klinische Anwendung zu verwenden.
3. Kultur weitere 1 ml von Mikrotransplantaten auf Kollagenschwämmen in Gegenwart von 6 ml DMEM - Medium mit 10% fötalem Rinderserum bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ befeuchteten Atmosphäre.
4. Nach 3 Tagen nach der Kultur, fixieren die bio-Komplexe mit 0,3% Paraformaldehyd für 10 min bei RT. Gießen Sie das Paraffin mit einem bestimmten Spender direkt auf die Probe. Erhalten Scheiben mit einem Mikrotom mit einer Dicke von 5 & mgr; m und direkt in einem Glasobjektträger gegeben.
5. Tauchen Paraffinschnitten von 5 um in einem Glas für histologische Analysen, enthaltend 15 - 20 ml Xylene (im Handel erhältlich - eine Mischung aus m-Xylol (40 - 65%), p-Xylol (20%), o-Xylol (20% ) und ethyl benzol (6-20%) und Spuren von Toluol, Trimethylbenzol, Phenol, Thiophen, Pyridin und Schwefelwasserstoff) für 3 min pro.
6. Eintauchen der Scheiben in abnehmOrten (100% bis 70%) aus Ethanol (100% Ethanol für 1 h, 95% Ethanol für 1 h, 80% Ethanol für 1 h, 70% Ethanol für 1 h) und anschließend entionisiertes Wasser für de-paraffinizing und Rehydratisieren der Abschnitte.
7. Stain die Abschnitte mit 1 bis 2 ml 1 g / l Ematoxylin mit 1 - 2 Minuten und spülen Sie anschließend in Wasser jeden Ematoxylin Überschuss zu entfernen.
8. Stain die Abschnitte für 4 - 5 min mit Eosin Y alkoholischer Lösung bei 1% Konzentration gemischt mit Ethanol 70% und in Wasser verdünnt.
9. Mit 1 - 2 ml Eosin Y für jede Folie Abschnitt und spülen Sie unter fließendem Leitungswasser.
10. Tauchen Abschnitte in den Klassen von Ethanol zu erhöhen (siehe Schritt 1.6) und schließlich nach einer Passage in Xylen für 1h, Deck mit einer Basis-Montage mediumand beobachten unter einem Lichtmikroskop bei 100 - facher Vergrößerung (Abbildung 1D).

2. Erhebung, Disaggregation und In - vitro - Analyse der Gewebe

1. Mit einem Dermatom, nehmen unabhängige Hautgewebe, papillär de-epidermized Dermis (DED) oder Retikulärdermis (Dermis), die jeweils von 0,6 mm, 1 mm oder 2 mm Dicke aus dem Kofferraum von 4 verschiedenen Multi-Organ-und / oder multi- Gewebespender in einem Bereich von 40 bis 55 Jahren, nach nationalen Vorschriften über die Ernte, Verarbeitung und Geweben zur Transplantation (CNT 2013) zu verteilen.
   1. Spülen Sie vorsichtig alle Proben in 0,9% NaCl-Lösung sie in einer Schale auf einem Orbitalschüttler für 5 Minuten setzen.
   2. Mit dem 5-mm-Biopsie Stempel erstellen Proben, die einen Durchmesser von Hautgewebe einheitlich sind, DED und Dermis und wiegen alle Gewebeproben vor dem Disaggregierung.
   3. Legen Sie acht, drei oder vier einheitliche Proben von Hautgewebe, Ded oder Dermis bzw. im Gewebe Disruptor, Zugabe von 1,5 ml Salzlösung für die Disaggregation.
   4. Führen Sie verschiedeneZeiten der Disaggregation für alle Gewebeproben , wie in Tabelle 1 angegeben.
   5. Verwenden Sie ein Korrespondent Anzahl von Stanzbiopsien abgeleitet aus intakten Gewebeproben als Kontrollen.
   6. Nach der mechanischen Disaggregierung absaugen Salzlösung, die Mikro-Transplantate und Ort separat jede Probe in einer einzigen Vertiefung einer 12-Well-Platte. Führen Sie das gleiche Protokoll für intakte Kontrolle Stanzbiopsien.
   7. 1ml RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika zu jeder Probe.
   8. Bewerten Sie sofort die Lebensfähigkeit der Zellen. Zu jeder Vertiefung ein Mikro-Graft (erhalten durch die gleichzeitige Disaggregation von acht, drei oder vier einheitliche Proben von Hautgewebe, Ded oder Dermis beziehungsweise) enthält, fügen Sie 1 ml Medium, das 0,5 mg / ml MTT (3- [4,5- Dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyltetrazoliumbromid) Lösung und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO ₂ / Luft. Führen Sie das gleiche Protokoll für intakte KontrolleStanzbiopsien.
   9. Nach der Inkubation entfernen Sie alle MTT-Medium mit und für 10 Minuten zu jeder Probe 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzuzufügen.
   10. Übertragen, um jede Probe und DMSO in einer Küvette und Lesen bei der optischen Dichte (OD) bei 570 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. Berechnen Zellebensfähigkeit als das Verhältnis der Extinktion bei 570 nm und das Gewicht in Gramm (g) des Gewebes vor Disaggregation verwendet. Führen Sie das gleiche Protokoll für intakte Kontrolle Stanzbiopsien.
2. Nach der mechanischen Disaggregierung absaugen Salzlösung Mikro-Graft aus Hautgewebe, DED und Dermis Proben von einem einzigen Spender abgeleitet enthält.
   1. Platzieren separat jede Probe in einem einzigen Well einer 12-Well-Platte oder in einer Kulturflasche für Zelllebensfähigkeit-Test und morphologische Analyse sind.
   2. Kultur Mikrotransplantate Zugabe von 1 ml (12-Well - Platte) oder 5 ml (Kulturflasche) RPMI 1640 - Medium mit 10% FBS und Antibiotika ergänzt bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO ₂ / air für 24 Stunden oder 7 Tage.
   3. Bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellen nach 24 Stunden oder 7 Tage (wiederholen Sie die Schritte 2.1.8-2.1.10).
   4. Führen Sie die morphologische Analyse das Vorhandensein von Zellsuspension durch Lichtmikroskopie nach 24 Stunden und 7 Tagen der Kultur in der Flasche zu bewerten.
   5. Analysieren Sie die Proben der Dermis für Positivität auf die mesenchymalen und hämatopoetischen Zellmarker, einschließlich CD146, CD34 und CD45 - Antigene durch FACS - Analyse ^6.
   6. Unter Laminarströmungsabzug Samen jeder Mikro-Graft (erhalten durch die gleichzeitige Disaggregation von acht, drei oder vier einheitliche Proben von Hautgewebe, Ded oder Dermis beziehungsweise) und einem Korrespondenten kleines Fragment jeder Gewebeprobe nicht vollständig aufgeschlüsselte (> 50 Mikrometer Größe nach Auflösung Prozess) auf Columbia-Agar-Platte 5% Schafblut Brühe 100 & mgr; l enthält.
   7. Die Platte bei 37 ° C für drei Tage und führen die mikrobiologische Analyse auf Columbia - Agar - Platte, um die Sterilität zu bewerten ¹¹.

Ergebnisse

In dieser vorläufigen Studie war das erste Ziel, die Fähigkeit von menschlichen autologe mikro Transplantate mit einer biologischen Träger, wie Collagen kombiniert zu untersuchen, bio-Komplexe gebrauchsfertig herzustellen. Diese bio-Komplexe wurden in einem Patienten implantiert mit einer Bein Läsion durch einen Autounfall (2A) verursacht wird und eine vollständige Reepithelialisierung mit Gewebereparatur assoziiert nach 30 Tagen ...

Diskussion

Diese vorläufige Studie zeigte , dass Mikrotransplantate dieses Protokoll erhalten werden , können mit Kollagenschwämmen kombiniert werden, wie bereits in anderen klinischen Anwendungen berichtet, um die Wirksamkeit von Mikrotransplantaten Implantate ^{9, 10} zu optimieren. Insbesondere diese Studie berichtet die Kapazität von bio -Komplexe, gebildet durch Mikrotransplantate und Kollagenschwämmen, die Wundheilung eines Beines Läsion adjuvanten nach 30 Tagen aus der klinischen Anwendung. Darüber hinaus

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Human Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI medium	PBI International	733-2292
DMEM medium	PBI International	F 0415
Antibiotics	Biological Industries PBI	03-038-1
Antibodies for FACS Analysis	eBiosciences	code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		collagen sponge used for bio-complexes
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene	Carlo Erba