Caractérisation des tissus après une nouvelle méthode de désagrégation pour la peau Micro-Greffes Generation

Résumé

Le protocole décrit une nouvelle méthode pour désagréger les tissus humains et de créer des micro-greffes autologues qui, combiné avec des éponges de collagène, donnent lieu à des bio-complexes humains prêts à l'emploi dans le traitement des lésions de la peau. En outre, ce système préserve la viabilité des cellules de micro-greffes à différents moments après la désagrégation mécanique.

Résumé

Plusieurs nouvelles méthodes ont été développées dans le domaine de la biotechnologie pour obtenir des suspensions cellulaires autologues pendant la chirurgie, afin de fournir un traitement étape pour les lésions aiguës et chroniques cutanées. En outre, la gestion des plaies chroniques, mais aussi aiguës résultant d'un traumatisme, le diabète, les infections et d'autres causes, reste difficile. Dans cette étude, nous décrivons une nouvelle méthode pour créer des micro-greffes autologues de tissu cutané d'un seul patient et leur application clinique. En outre, la caractérisation biologique in vitro du tissu cutané dérivé de la peau, de-épidermisé derme (DED) et le derme de plusieurs organes et / ou les donateurs multi-tissus a également été réalisée. Tous les tissus ont été ventilées par ce nouveau protocole, ce qui nous permet d'obtenir des micro-greffes viables. En particulier, nous avons signalé que ce protocole innovant est capable de créer des bio-complexes constitués par des micro-greffes autologues et les éponges de collagène prêt à être appliqué sur des lésions cutanées. Le Clinil'application de cal autologues bio-complexes sur une lésion de la jambe a également été rapporté, montrant une amélioration des deux processus de ré-epitalization et la douceur de la lésion. De plus, notre modèle in vitro ont montré que la viabilité des cellules après la désagrégation mécanique avec ce système est maintenue au fil du temps pour un maximum de sept (7) jours de culture. Nous avons également observé, par cytométrie de flux, que le pool de cellules obtenues à partir de désagrégation est composée de plusieurs types cellulaires, notamment les cellules souches mésenchymateuses, qui exercent un rôle clé dans les processus de régénération et de réparation tissulaire, de leur potentiel de régénération élevé. Enfin, nous avons montré in vitro que cette procédure maintient la stérilité des micro-greffes lorsqu'elles sont cultivées dans des boîtes de gélose. En résumé, nous concluons que cette nouvelle approche régénérative peut être un outil prometteur pour les cliniciens d'obtenir en une seule étape viable, stérile et prêt à utiliser des micro-greffes qui peuvent être appliqués seuls ou en combinaison avec la plupart Scaffo biologique communelds.

Introduction

Au cours des dernières années, plusieurs nouvelles méthodes ont été développées dans le domaine de la biotechnologie pour obtenir des suspensions cellulaires autologues lors de la chirurgie afin de fournir des traitements en une seule étape pour les lésions aiguës et chroniques cutanées. En outre, la gestion des plaies aiguës mais surtout chroniques résultant d'un traumatisme, le diabète, les infections, et d'autres causes, reste difficile. Il y a des preuves croissantes que les plaies chroniques sont devenues un problème mondial grave pour la santé, provoquant un énorme fardeau financier sur les systèmes de soins de santé à travers le monde ^1.

Pour augmenter le taux de réussite dans le traitement des lésions de la peau, l'absence d'une manipulation extensive (y compris le renforcement cellulaire) et le maintien de conditions stériles est indispensable, afin de créer une suspension cellulaire qui peut être immédiatement appliquée sur la zone endommagée du patients, évitant ainsi un traitement plus dans les salles blanches telles que Cell Factories. Starting de petites biopsies de peau, le broyage, centrifugation et autres procédés de séparation (par exemple, enzymatique ou mécanique), sont fréquemment utilisés pour obtenir une suspension cellulaire, qui peut être cultivée dans un milieu de croissance. Toutes ces méthodes nécessitent généralement une longue durée d'exécution, en insistant sur les structures cellulaires, et conduisant à une réduction de la viabilité cellulaire. Un autre aspect important est d'obtenir une suspension cellulaire autologue prêt à être utilisé par les cliniciens, par exemple, pour réparer des zones endommagées. Par ailleurs, il est bien établi que les greffes de tissus autologues survivent à la procédure de transfert pour survivre éventuellement dans le site receveur par les principes de l' induction et conduction ^{2, 3.} Le tissu greffé idéal doit être facilement disponible et ont une faible antigénicité et donneur morbidité du site ^4.

Sur la base de ces preuves, le premier objectif de cette étude était de créer des bio-complexes autologues appropriés pourl'application clinique dans la réparation tissulaire. A cet effet, nous décrivons une nouvelle méthode pour obtenir des micro-greffes autologues à partir de tissus cutanés qui ont été ventilés par ce protocole. Une présentation de cas est également décrit ici comme une application clinique de micro-greffes autologues obtenus par ce protocole en combinaison avec des éponges de collagène. Cette approche a déjà été rapporté pour être efficace dans la désagrégation mécanique des tissus humains ⁵ et il a été utilisé cliniquement pour les greffes et la régénération des tissus dermiques ^6,7, ainsi que pour les thérapies régénératives des tissus conjonctifs en chirurgie buccale-maxillo ^8-10 .

En outre, le deuxième objectif de cette étude était la caractérisation biologique des tissus cutanés après leur ventilation par ce protocole. A cet effet, différents échantillons de tissu cutané homologues issus de la zone de tronc de différentes multiviscéraleet ou des donateurs / multi-tissus ont été traités suivant les règles nationales en matière de récolte, la transformation et la distribution de tissus destinés à la transplantation (CNT) 2013 à la Banque de peau Emilia Romagna régionale.

CASE PRESENTATION:

A 35 ans, patiente montrant un traumatisme complexe en raison d'un accident de voiture a été admis à l'unité de l'hôpital Ancona de soins intensifs. Le patient a montré une infection à la jambe en raison d'une blessure ouverte et une fracture stabilisée avec fixation externe. Deux débridement radical ont été effectuées et lorsque la plaie est devenue propre après thérapie par pression négative (thérapie VAC) et le périoste est apparu en bonne santé, nous avons appliqué le protocole après deux mois de récupération. Après la désagrégation de ce système, les micro-greffes obtenus ont été utilisés pour créer des bio-complexes avec une éponge de collagène qui ont ensuite été implantés afin d'étudier leur efficacité sur la réparation des lésions.

Protocole

Déclaration éthique: depuis l'application clinique du protocole nécessite l'utilisation de tissu autologue cutanée du patient, sa caractérisation in vitro a été réalisée avant l' utilisation clinique sur le tissu cutané homologue à la Banque Emilia Romagna régionale de la peau en suivant les lignes directrices de la réglementation nationale sur la récolte, la transformation et la distribution de tissus destinés à la transplantation (CNT 2013).

1. Construction Bio-complexe pour l'application clinique

NOTE: Ce protocole est cliniquement basé sur l'utilisation de Rigeneracons (liste perturbateurs des tissus) et la machine Rigenera (système de disrupteur tissulaire) (figure 1A). Le disrupteur de tissu est un dispositif disruptif médical biologique des tissus humains capables de perturber les petits morceaux de tissus à l'aide d'une grille hexagonale fournie par les lames et les cellules de filtrage et des composants de la matrice extracellulaire avec une coupure d'environ 50 microns.

1. Recueillir skinsamples du patient à travers un biOpsy poinçon (figure 1B) et désagréger en ajoutant 1 ml de solution saline pour chaque pièce pour obtenir des micro-greffes autologues ^6,7,9 (ou voir l' étape 2.1).
2. Placer 1 ml de micro-greffes sur des éponges de collagène (figure 1C) toform biologiques complexes à utiliser pour une application clinique.
3. Une autre culture 1 ml de micro-greffes sur des éponges de collagène en présence de 6 ml de milieu DMEM additionné de 10% de sérum bovin fœtal à 37 ° C dans une atmosphère de _CO2 à 5% humidifiée.
4. Après 3 jours de culture, fixer les bio-complexes avec 0,3% paraformaldéhyde pendant 10 min à température ambiante. Versez la paraffine avec un distributeur spécifique directement sur l'échantillon. Obtenir des tranches avec un microtome ayant une épaisseur de 5 pm et mettre directement dans un verre-lame.
5. Immerger les tranches de paraffine de 5 um dans un verre pour l'analyse histologique, contenant 15 - 20 ml de xylène (disponible dans le commerce - un mélange de m-xylène (40-65%), le p-xylène (20%), o-xylène (20% ) et ethyl benzène (6-20%) et les traces de toluène, le triméthylbenzène, le phénol, le thiophène, la pyridine et le sulfure d'hydrogène) pendant 3 min à chaque fois.
6. Immerger les tranches dans les classes décroissantes (100% à 70%) d'éthanol (éthanol à 100% pendant 1 heure, 95% d'éthanol pendant 1 heure, l'éthanol à 80% pendant 1 heure, éthanol à 70% pendant 1 heure) et de l'eau puis déminéralisée pour de-paraffinage et réhydrater les sections.
7. Colorer les sections avec 1 - 2 ml de 1g / L Ematoxylin pour 1 - 2 min et rincer ensuite à l'eau pour éliminer tout excédent Ematoxylin.
8. Colorer les sections pendant 4 - 5 min avec une solution alcoolique d'éosine Y à 1% de la concentration mélangée avec de l'éthanol à 70% et dilué dans l'eau.
9. Utilisez 1 - 2 ml de éosine Y pour chaque section de lame et rincer sous l'eau courante du robinet.
10. Immerger les coupes dans l' augmentation de grades de l' éthanol (voir étape 1.6) et enfin, après un passage dans Xylène pendant 1 h, avec une lamelle de montage à base de mediumand observer sous un microscope optique à grossissement 100X (figure 1D).

2. Collecte, Désagrégation et Analyse in vitro des tissus

1. À l'aide d'un dermatome, prendre un tissu indépendant de la peau, papillaires de-épidermisé derme (DED) ou le derme réticulaire (derme), respectivement, de 0,6 mm, 1 mm ou 2 mm d'épaisseur à partir de la zone de tronc de 4 multiviscérale différents et / ou multi- donneurs de tissus dans une plage de 40 à 55 ans, suivant les règles nationales sur la récolte, la transformation et la distribution de tissus destinés à la transplantation (CNT 2013).
   1. Rincer délicatement tous les échantillons en solution de NaCl à 0,9% de les mettre dans un plat sur un agitateur orbital pendant 5 min.
   2. Utilisation de la 5 mm biopsie punch, créer des échantillons qui sont uniformes de diamètre à partir du tissu de la peau, Ded et Derme et pèsent tous les échantillons de tissus avant la désagrégation.
   3. Insérez huit, trois ou quatre échantillons uniformes de tissus de la peau, Ded ou Derme respectivement, dans le disrupteur de tissu, en ajoutant 1,5 ml de solution saline pour la désagrégation.
   4. Effectuer différentstemps de désagrégation pour tous les échantillons de tissus , comme indiqué dans le tableau 1.
   5. Utilisez un nombre correspondant de biopsies dérivées à partir d'échantillons de tissus intacts comme témoins.
   6. Après la désagrégation mécanique, aspirer la solution saline contenant des micro-greffes et lieu séparément chaque échantillon dans un seul puits d'une plaque de 12 puits. Effectuez le même protocole pour les biopsies de contrôle intact.
   7. Ajouter 1 ml de milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et des antibiotiques à chaque échantillon.
   8. Évaluer immédiatement la viabilité cellulaire. Dans chaque puits contenant un micro-greffon (obtenu par la désagrégation simultanée de huit, trois ou quatre échantillons uniformes de tissu cutané, ou Déd Derme respectivement), ajouter 1 ml de milieu contenant 0,5 mg / ml de MTT (bromure de 3- [4,5- diméthylthiazol-2-yl] bromure) solution -2,5 de diphényltétrazolium et incuber pendant 3 heures à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO ₂ / air. Effectuez le même protocole pour le contrôle intactpoinçonner biopsies.
   9. Après incubation, enlever tout milieu contenant MTT et ajouter à chaque échantillon de 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) pendant 10 min.
   10. Transférer chaque échantillon et du DMSO dans une cuvette de lecture et à une densité optique (DO) à 570 nm en utilisant un spectrophotomètre. Calculer la viabilité cellulaire comme le rapport de l'absorbance à 570 nm et le poids en grammes (gr) de tissu utilisé avant la désagrégation. Effectuez le même protocole pour les biopsies de contrôle intact.
2. Après la désagrégation mécanique, aspirez le solution saline contenant des micro-greffe provenant de tissus de la peau, Ded et derme des échantillons d'un seul donneur.
   1. Placer chaque échantillon séparément dans un seul puits d'une plaque de 12 puits ou dans un flacon de culture pour le test de viabilité cellulaire et l'analyse morphologique, respectivement.
   2. La culture des micro-greffes en ajoutant 1 ml (plaque à 12 puits) ou 5 ml (flacon de culture) de milieu RPMI 1640 complété avec 10% de FBS et des antibiotiques à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO ₂ / AIr pendant 24 heures ou 7 jours.
   3. Évaluer la viabilité cellulaire après 24 h ou 7 jours (répétez les étapes 2.1.8-2.1.10).
   4. Effectuer une analyse morphologique évaluer la présence de la suspension cellulaire par microscopie optique après 24 h et 7 jours de culture en flacon.
   5. Analyser les échantillons de Derme de positivité à l'mésenchymateuses et des marqueurs de cellules hématopoïétiques, y compris CD146, CD34 et CD45 antigènes par analyse FACS ^6.
   6. Sous flux laminaire semences de hotte chaque micro-greffe (obtenu par la désagrégation simultanée de huit, trois ou quatre échantillons uniformes de tissus de la peau, Ded ou Derme respectivement) et un correspondant petit fragment de chaque échantillon de tissu pas totalement désagrégée (> 50 micron après le processus de désagrégation) sur Columbia plaque de gélose contenant 5% de bouillon de sang de mouton 100 pi.
   7. Incuber la plaque à 37 ° C pendant trois jours et effectuer des analyses microbiologiques sur Columbia plaque de gélose afin d'évaluer la stérilité ¹¹.

Résultats

Dans cette étude préliminaire, le premier objectif était d'étudier la capacité des micro-greffes autologues humaines combinées avec un support biologique, tels que le collagène, pour produire des bio-complexes prêts à l'emploi. Ces bio-complexes ont été implantés chez un patient avec une lésion de la jambe provoquée par un accident de voiture (figure 2A) et une réépithélialisation complète associée à la rép...

Discussion

Cette étude préliminaire a montré que les micro-greffes obtenus par ce protocole peuvent être combinés avec des éponges de collagène, comme déjà signalé dans d' autres applications cliniques, afin d' optimiser l'efficacité des micro-greffes d' implants ^{9, 10.} En particulier, cette étude a rapporté la capacité de bio -complexes, constitué par des micro-greffes et les éponges de collagène, de l'adjuvant de cicatrisation d'une lésion de la jambe après 30 jours de l'...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Human Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI medium	PBI International	733-2292
DMEM medium	PBI International	F 0415
Antibiotics	Biological Industries PBI	03-038-1
Antibodies for FACS Analysis	eBiosciences	code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		collagen sponge used for bio-complexes
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene	Carlo Erba