Tissue Caratterizzazione dopo un metodo nuovo disaggregazione per Skin Micro-innesti Generation

Riepilogo

Il protocollo descrive un nuovo metodo per disaggregare tessuti umani e per creare autologhe micro-innesti che, combinato con spugne di collagene, danno origine a umani bio-complessi pronti all'uso nel trattamento delle lesioni cutanee. Inoltre, questo sistema mantiene la vitalità cellulare di micro-innesti in tempi diversi dopo disgregazione meccanica.

Abstract

Diversi nuovi metodi sono stati sviluppati nel campo della biotecnologia per ottenere sospensioni cellulari autologhi durante l'intervento chirurgico, per fornire uno step trattamenti per le lesioni cutanee acute e croniche. Inoltre, la gestione di ferite acute croniche, ma anche derivanti da traumi, diabete, infezioni ed altre cause, rimane difficile. In questo studio si descrive un nuovo metodo per creare autologhe micro-innesti di tessuto cutaneo di un singolo paziente e la sua applicazione clinica. Inoltre, è stata anche effettuata in vitro caratterizzazione biologica dei tessuti cutanei derivati ​​da pelle, derma de-epidermized (DED) e derma della multi-organo e / o donatori multi-tessuto. Tutti i tessuti sono stati disaggregati per questo nuovo protocollo, che consente di ottenere vitali micro-innesti. In particolare, abbiamo riportato che questo protocollo innovativa è in grado di creare bio-complessi composti da autologhi micro-innesti e spugne di collagene pronto per essere applicato su lesioni cutanee. il Cliniè stato anche riferito applicazione cal di autologhe bio-complessi su una lesione gamba, con un miglioramento di entrambi processo di re-epitalization e la morbidezza della lesione. Inoltre, il nostro modello in vitro hanno mostrato che la vitalità cellulare dopo disgregazione meccanica con questo sistema si mantiene nel tempo fino a sette (7) giorni di coltura. Abbiamo anche osservato, mediante citometria a flusso di analisi, che il pool di cellule ottenute da disaggregazione è composto da diversi tipi di cellule, comprese le cellule staminali mesenchimali, che esercitano un ruolo chiave nei processi di rigenerazione e riparazione dei tessuti, per il loro elevato potenziale rigenerativo. Infine, abbiamo dimostrato in vitro che questa procedura mantiene la sterilità dei micro-innesti quando coltivate in piatti Agar. In sintesi, si può concludere che questo nuovo approccio rigenerativo può essere uno strumento promettente per i medici di ottenere in un unico passaggio praticabile, sterile e pronta all'uso micro-innesti che possono essere applicati solo o in combinazione con più Scaffo biologica comuneLDS.

Introduzione

Negli ultimi anni, numerosi nuovi metodi sono stati sviluppati nel campo della biotecnologia per ottenere sospensioni cellulari autologhi durante l'intervento chirurgico per fornire trattamenti di uno stadio per le lesioni cutanee acute e croniche. Inoltre, la gestione di ferite acute, ma soprattutto croniche derivanti da traumi, diabete, infezioni, e altre cause, rimane difficile. Ci sono prove di montaggio che le ferite croniche sono diventate un grave problema di salute globale, causando un onere finanziario enorme sui sistemi sanitari in tutto il mondo ^1.

Per aumentare il tasso di successo nel trattamento di lesioni cutanee, l'assenza di una vasta manipolazione (comprese enhancement cellulare) e il mantenimento di condizioni di sterilità sono essenziali, per creare una sospensione cellulare che può essere immediatamente applicato sulla zona danneggiata del pazienti, evitando così un trattamento più lungo in camere bianche, come Cell Factories. StArting da piccole biopsie cutanee, molatura, centrifugazione e altri metodi di separazione (ad esempio, enzimatico o meccanico), sono frequentemente utilizzati per ottenere una sospensione cellulare, che possono essere coltivate in un mezzo di crescita. Tutti questi metodi generalmente richiedono un lungo tempo di esecuzione, sottolineando le strutture cellulari, e portando ad una riduzione della vitalità cellulare. Un altro aspetto significativo è quello di ottenere una sospensione cellulare autologo pronto per essere utilizzato dai clinici, per esempio, per riparare le aree danneggiate. Inoltre, è ben noto che gli innesti di tessuti autologhi sopravvivono le procedure di trasferimento di sopravvivere alla fine nel sito ricevente dai principi di induzione e di conduzione ^{2, 3.} L'innesto di tessuto ideale dovrebbe essere prontamente disponibili e hanno una bassa antigenicità e donatore sito morbidità ^4.

Sulla base di queste evidenze, il primo obiettivo di questo studio era quello di creare bio-complessi autologhe adattiapplicazione clinica nella riparazione tissutale. A questo scopo, si descrive un nuovo metodo per ottenere autologhe micro-innesti a partire da tessuti cutanei che sono stati disaggregati per questo protocollo. Una presentazione caso è anche qui descritto come una applicazione clinica di autologhi micro-innesti ottenuti con questo protocollo, in combinazione con le spugne di collagene. Questo approccio è già stato segnalato per essere efficace nella disgregazione meccanica di tessuti umani ⁵ ed è stato usato in clinica per innesti e rigenerazione dei tessuti dermici ^6,7 nonché per terapie rigenerative dei tessuti connettivi in chirurgia orale-maxillofacciale ^8-10 .

Inoltre, il secondo obiettivo di questo studio era la caratterizzazione biologica dei tessuti cutanei dopo loro suddivisione per questo protocollo. A questo scopo, diversi campioni omologhi di tessuto cutaneo derivate dalla zona tronco di diversa multiorganoe / o donatori multi-tessuto sono stati elaborati seguendo norme nazionali in materia di raccolta, elaborazione e distribuzione dei tessuti per i trapianti (CNT 2013) in pelle Emilia Romagna Regional Bank.

CASE PRESENTAZIONE:

A 35-year-old paziente che mostra un trauma complesso a causa di incidente stradale è stato ammesso al reparto di terapia intensiva di Ancona Hospital. Il paziente ha mostrato un'infezione sulla gamba a causa di una ferita aperta e una frattura scomposta stabilizzato con fissazione esterna. Due debridement radicale sono state effettuate e quando la ferita è diventato pulito dopo la terapia a pressione negativa (terapia VAC) e il periostio è apparso in buona salute, abbiamo applicato il protocollo dopo due mesi dalla ripresa. Dopo disaggregazione con questo sistema, i micro-innesti ottenuti sono stati usati per creare bio-complessi con una spugna di collagene che sono stati successivamente impiantato per investigare l'efficacia sulla riparazione della lesione.

Protocollo

Dichiarazione etica: dal momento che l'applicazione clinica del protocollo richiede l'utilizzo di tessuto autologo cutanea del paziente, la sua caratterizzazione in vitro è stata effettuata prima dell'uso clinico su tessuto cutaneo omologo presso la Banca della pelle Emilia Romagna Regione seguendo le linee guida di una normativa nazionale sulla raccolta, il trattamento e la distribuzione di tessuti per i trapianti (CNT 2013).

1. Costruzione Bio-complesso per l'applicazione clinica

NOTA: Questo protocollo è clinicamente basa sull'uso di Rigeneracons (disgregatori tessuto) e il Rigenera macchina (sistema disgregatore tessuto) (Figura 1A). Il disgregatore tessuto è un disgregatore medica biologica dei tessuti umani in grado di interrompere piccoli pezzi di tessuto utilizzando una griglia fornita da lame esagonali e celle filtranti e componenti di matrice extracellulare con un cut-off di circa 50 micron.

1. Raccogliere skinsamples del paziente attraverso un biopsy punzone (Figura 1B) e disaggregare l'aggiunta di 1 ml di soluzione fisiologica per ogni pezzo di ottenere autologhe micro-innesti ^6,7,9 (o vedere passo 2.1).
2. Mettere 1 ml di micro-innesti su spugne di collagene (Figura 1C) toform bio-complessi da utilizzare per l'applicazione clinica.
3. Culture altre 1 ml di micro-innesti su spugne di collagene in presenza di 6 ml di terreno DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino a 37 ° C in atmosfera umidificata CO ₂ 5%.
4. Dopo 3 giorni di cultura, fissare i bio-complessi con 0,3% paraformaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente. Versare la paraffina con uno specifico erogatore direttamente sul campione. Ottenere fette con un microtomo con uno spessore di 5 micron e mettere direttamente in un vetro scorrevole.
5. Immergere le fette di paraffina 5 micron in un bicchiere per le analisi istologiche, contenente 15 - 20 ml di xilene (disponibile in commercio - un mix di m-xilene (40 - 65%), p-xilene (20%), o-xilene (20% ) e ethyl benzene (6 - 20%) e tracce di toluene, trimetil benzene, fenolo, tiofene, piridina e acido solfidrico) per 3 minuti ciascuno.
6. Immergere le fette in gradi decreasing (100% al 70%) di etanolo (100% di etanolo per 1 ora, 95% di etanolo per 1 ora, 80% di etanolo per 1 ora, etanolo al 70% per 1 ora) e poi acqua deionizzata per de-paraffinizing e reidratante sezioni.
7. Macchiare le sezioni con 1 - 2 ml di 1 g / L Ematoxylin per 1 - 2 min e successivamente sciacquare con acqua per rimuovere eventuali eccedenze Ematoxylin.
8. Macchiare le sezioni per 4-5 minuti con soluzione alcolica Eosina Y all'1% della concentrazione mescolato con etanolo al 70% e diluito in acqua.
9. Utilizzare 1 - 2 ml di eosina Y per ogni sezione vetrino e sciacquare sotto acqua corrente.
10. Immergere le sezioni in aumento gradi di etanolo (vedi punto 1.6) e, infine, dopo un passaggio in xilene per 1h, vetrino con una base di montaggio mediumand osservare al microscopio ottico a ingrandimento 100X (Figura 1D).

2. Raccolta, disaggregazione e L'analisi in vitro dei tessuti

1. Utilizzando un dermatome, prendere il tessuto indipendenti pelle, papillari de-epidermized derma (Ded) o derma reticolare (derma) rispettivamente di 0,6 mm, 1 mm o 2 mm di spessore dalla zona tronco di 4 differenti multi-organo e / o multi donatori di tessuti in un range da 40 a 55 anni, a seguito di norme nazionali in materia di raccolta, elaborazione e distribuzione dei tessuti per i trapianti (CNT 2013).
   1. Lavare delicatamente tutti i campioni di 0,9% soluzione di NaCl metterli in un piatto su un agitatore orbitale per 5 min.
   2. Utilizzando la biopsia del punzone 5 mm, creare campioni che sono uniformi di diametro dal tessuto della pelle, Ded e derma e pesano tutti i campioni di tessuto prima della disaggregazione.
   3. Inserire otto, tre o quattro campioni uniformi tessuto cutaneo, Ded o derma rispettivamente, nel disgregatore tessuti, aggiungendo 1,5 ml di soluzione salina per la disaggregazione.
   4. eseguire diversotempi di disaggregazione per tutti i campioni di tessuto come indicato nella Tabella 1.
   5. Utilizzare un numero corrispondente di biopsie derivati ​​da campioni di tessuto intatti come controlli.
   6. Dopo disaggregazione meccanica, aspirare la soluzione salina contenente micro-innesti e luogo separatamente ogni campione in un unico pozzetto di una 12-pozzetti. Eseguire lo stesso protocollo per il controllo intatto biopsie.
   7. Aggiungere 1 ml di RPMI 1640 medium integrato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e antibiotici per ogni campione.
   8. Valutare immediatamente la vitalità cellulare. Per ciascun pozzetto contenente un micro-graft (ottenuti rispettivamente dal disaggregazione simultanea di otto, tre o quattro campioni uniformi tessuto cutaneo, Ded o derma) aggiungere 1 ml di mezzo contenente 0,5 mg / ml di MTT (3- [4,5- -il dimethylthiazol-2] bromide) soluzione -2,5 diphenyltetrazolium e incubare per 3 ore a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO ₂ / aria. Eseguire lo stesso protocollo per il controllo intattopugno biopsie.
   9. Dopo l'incubazione, rimuovere tutto terreno contenente MTT e aggiungere a ciascun campione 1 ml dimetilsolfossido (DMSO) per 10 min.
   10. Trasferire ciascun campione e DMSO in una cuvetta e leggere alla densità ottica (OD) a 570 nm con uno spettrofotometro. Calcolare la vitalità cellulare come il rapporto di assorbanza a 570 nm e il peso in grammi (gr) di tessuto utilizzati prima disaggregazione. Eseguire lo stesso protocollo per il controllo intatto biopsie.
2. Dopo disaggregazione meccanica, aspirare la soluzione salina contenente micro-trapianto derivato dal tessuto della pelle, i campioni Ded e derma di un singolo donatore.
   1. Posizionare separatamente ogni campione in un singolo pozzetto di una piastra 12 pozzetti o in un pallone di coltura per il test di vitalità cellulare e l'analisi morfologica rispettivamente.
   2. Culture micro-innesti aggiunta di 1 ml (12-pozzetti) o 5 ml (pallone di coltura) di terreno RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e antibiotici a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO ₂ / aiR per 24 ore o 7 giorni.
   3. Valutare la vitalità cellulare dopo 24 ore o 7 giorni (ripetere i punti 2.1.8-2.1.10).
   4. Eseguire analisi morfologica valutare la presenza di sospensione cellulare mediante microscopia ottica dopo 24 ore e 7 giorni di coltura in pallone.
   5. Analizzare i campioni di derma per positività al mesenchimali e marcatori di cellule ematopoietiche, tra cui CD146, CD34 e CD45 antigeni mediante analisi FACS ^6.
   6. Sotto laminare seme cappa a flusso ogni micro-graft (ottenuto dalla disaggregazione simultanea di otto, tre o quattro campioni uniformi tessuto cutaneo rispettivamente Ded o derma) e un corrispondente piccolo frammento di ogni campione di tessuto non totalmente disaggregata (> 50 micron di dimensione dopo il processo di disaggregazione) su Columbia piastra di agar contenente il 5% di brodo sangue di pecora 100 l.
   7. Incubare la piastra a 37 ° C per tre giorni ed eseguire analisi microbiologiche di Columbia piastra di agar per valutare la sterilità ¹¹.

Risultati

In questo studio preliminare, il primo obiettivo era indagare la capacità delle umane autologhe micro-innesti combinati con un supporto biologico, come il collagene, per produrre bio-complessi pronti all'uso. Questi bio-complessi sono stati impiantati in un paziente con una lesione gamba causata da un incidente stradale (Figura 2A) e una completa riepitelizzazione associato riparazione dei tessuti dopo 30 giorni (Figura 2B...

Discussione

Questo studio preliminare ha mostrato che micro-innesti ottenuti con tale protocollo possono essere combinate con le spugne di collagene, come già riportato in altre applicazioni cliniche, per ottimizzare l'efficacia delle protesi micro-innesti ^{9, 10.} In particolare, questo studio ha riportato la capacità di bio -complessi, costituito da micro-innesti e spugne di collagene, per adiuvante la cicatrizzazione della lesione gamba dopo 30 giorni dalla applicazione clinica. Inoltre, i risultati in vitro

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Human Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI medium	PBI International	733-2292
DMEM medium	PBI International	F 0415
Antibiotics	Biological Industries PBI	03-038-1
Antibodies for FACS Analysis	eBiosciences	code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		collagen sponge used for bio-complexes
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene	Carlo Erba