Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Özet

protokol yeni bir yöntem, insan doku ayrıştırmak ve kollajen sünger ile birlikte, deri lezyonlarının tedavisinde kullanıma hazır insan biyo-kompleksleri doğuran otolog mikro greft oluşturmak açıklar. Bundan başka, bu sistem, mekanik ayrıştırma sonra farklı zamanlarda mikro greft hücre canlılığı korur.

Özet

Birkaç yeni yöntemler akut ve kronik deri lezyonları için bir adım tedaviler sağlamak amacıyla, ameliyat sırasında otolog hücre süspansiyonları elde etmek için biyoteknoloji alanında geliştirilmiştir. Ayrıca, travma, diyabet, enfeksiyon ve diğer nedenlere bağlı kronik fakat akut yaraların yönetimi, zorlu kalır. Bu çalışmada, tek bir hastanın cilt dokusuna ve klinik uygulama otolog mikro greft oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, deri, de-epidermized dermis (DED) ve çok-organ ve / veya çok doku donörlerin dermis türetilen cilt dokusuna in vitro biyolojik karakterizasyonu de yapıldı. Bütün dokular bize canlı mikro greft elde etmek için izin, bu yeni protokolün göre ayrıştırılmış bulundu. Özellikle, bu yenilikçi protokol deri lezyonları uygulanacak hazır otolog mikro greftler ve kollajen sünger tarafından bestelenen biyo-kompleksleri oluşturmak mümkün olduğunu bildirdi. CliniBir bacak lezyon otolog biyo-komplekslerinin cal uygulaması da yeniden epitalization süreci ve lezyonun yumuşaklık hem de bir gelişme göstererek, bildirildi. Buna ek olarak, in vitro bir model bu sistem ile, mekanik ayrıştırma sonra hücre canlılığı, kültür kadar yedi (7) gün süre ile uzun süre devam eder gösterdi. Ayrıca ayrıştırma elde edilen hücre havuzu yüksek rejeneratif potansiyeli, doku yenilenmesi ve onarım süreçlerinde önemli bir rol meydana mezenkimal kök hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin, oluştuğunu, akış sitometri analizi ile saptanmıştır. Son olarak, Ağar levhalarına kültüre Bu prosedür mikro greft kısırlığı tutar in vitro olarak gösterilmiştir. Özet olarak, klinisyen, uygun bir steril ve en sık görülen biyolojik scaffo tek başına ya da kombinasyon halinde uygulanabilir mikro greft kullanıma hazır tek bir adımda elde etmek için yeni bir reaktif yaklaşım, umut verici bir araç olabilir sonucunalds.

Giriş

Son yıllarda, birçok yeni yöntemler akut ve kronik deri lezyonlarında tek adım tedaviler sağlamak amacıyla ameliyat sırasında otolog hücre süspansiyonları elde etmek için biyoteknoloji alanında geliştirilmiştir. Ayrıca, travma, diyabet, enfeksiyonlar ve diğer nedenlere bağlı akut ama esas kronik yaraların yönetimi, zorlu kalır. Kronik yaralar sağlık sistemleri, dünya çapında ¹ üzerinde çok büyük bir mali yük neden ciddi bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir montaj kanıtlar vardır.

deri lezyonlarının tedavisi başarı oranını artırmak için, (hücre geliştirme dahil) geniş bir manipülasyon olmaması ve steril koşullar bakımı hemen hasarlı alan üzerinde uygulanabilen bir hücresel süspansiyon oluşturmak için, gerekli olan Hastalar, böylece bu tür hücre fabrikalarında olarak temiz oda daha uzun bir işlem önler. Stküçük bir deri biyopsisi, öğütme, santrifüjleme ve diğer ayırma yöntemlerinin (örneğin, enzimatik veya mekanik) arasında Arting, sık sık bir büyüme ortamında kültürlenebilir bir hücresel süspansiyon elde etmek için kullanılır. Tüm bu yöntemler, genellikle hücre yapıları vurgulayarak ve hücre canlılığının bir azalmaya yol açan, uygulama, uzun bir süre gerektirir. Bir diğer önemli bir yönü zarar görmüş alanların onarmak, örneğin, klinisyenler tarafından kullanılmak üzere hazır bir otolog hücre süspansiyonu elde etmektir. Ayrıca, iyi otolog doku greftleri sonunda indüksiyon ve iletim ^{2, 3} ilkeleri ile alıcı sitesine hayatta transfer prosedürleri hayatta olduğu saptanmıştır. İdeal greft dokusu hazır olması ve düşük antigenesiti ve donör saha morbiditesi ⁴ olmalıdır.

Bu delillerden, bu çalışmanın ilk amacı için uygun otolog biyo-kompleksleri oluşturmak oldudoku onarımında klinik uygulama. Bu amaçla, bu protokol ile ayrıştırılmış edildi deri dokulardan başlayarak otolog mikro greft elde etmek için bir yeni bir yöntem tarif. Bir olgu sunumu da burada kollajen sünger ile birlikte bu protokolü tarafından elde edilen otolog mikro greftler bir klinik uygulama olarak tarif edilir. Bu yaklaşım, daha önce insan dokularıyla ⁵ mekanik ayrıştırma etkili olduğu rapor edilmiştir ve greft ve dermal dokularda ^6,7 rejenerasyonu için hem de oral çene cerrahisi ^8-10 bağlantı dokularının rejeneratif terapisi için klinik olarak kullanılmaktadır .

Buna ek olarak, bu çalışmanın ikinci amacı da bu protokol tarafından kendi ayrıştırma sonrası deri dokuların biyolojik karakterizasyonu oldu. Bu amaçla, cilt dokusuna farklı homolog numuneler farklı çoklu organ gövde alanından türetilmişve / veya çoklu doku bağış Emilia Romagna Bölge Cilt Bankası nakli için dokular (CNT 2013) hasat, işleme Ulusal Kuralları takip eden ve dağıtan işlenmiştir.

Olgu Sunumu:

Trafik kazası nedeniyle karmaşık bir travma gösteren 35 yaşındaki kadın hasta Ancona Hastanesi Yoğun Bakım Ünitesi'ne yatırıldı. Hastada bir açık yara ve eksternal fiksatör ile stabilize bir bileşik kırık bacak bir enfeksiyon gösterdi. Iki radikal debridman ve yara negatif basınç terapisi (VAC tedavisi) sonra temiz oldu ve periost sağlıklı göründü, biz kurtarma iki ay sonra protokol uygulandı. Bu sistem ile ayrıştırma sonra, elde edilen mikro-greftler, daha sonra lezyon tamir üzerindeki etkinliğini araştırmak için implante edildi kollajen sünger ile biyo-kompleksleri oluşturmak için kullanıldı.

Protokol

Etik deyimi: protokolün klinik uygulama hastanın deri otolog doku kullanımını gerektirir çünkü, in vitro karakterizasyonu hasadı, işlenmesi Milli Kuralları yönergeleri izleyerek Emilia Romagna Bölge Cilt Bankası homolog deri dokusu üzerinde klinik kullanımdan önce gerçekleştirildi ve nakli için dokular (2013 CNT) dağıtılması.

Klinik Uygulama için 1. Bio-kompleks Yapı

NOT: Bu protokol, klinik Rigeneracons (doku Topu) ve RiGenera Machine (doku Topu sistemi) (Şekil 1A) kullanımına dayanmaktadır. Doku Topu yaklaşık 50 mikronluk bir kesme altıgen bıçaklar ve filtreleme hücreleri ve hücre dışı matris bileşenleri tarafından sunulan bir ızgara ile dokuların küçük parçalar bozmak için mümkün insan dokularının biyolojik, tıbbi bozan bir.

1. Bir bi aracılığıyla hastanın skinsamples toplayınOPSY delme (Şekil 1B) ve otolog mikro greft ^6,7,9 elde etmek için her bir parça için tuzlu su çözeltisi 1 ml ilave parçalamak (veya adım 2.1).
2. Kollajen sünger mikro greft 1 ml koyun (Şekil 1C) toform biyo-kompleksleri klinik uygulama için kullanılacak.
3. Kültür, bir% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş atmosfer içinde 37 ° C 'de% 10 fetal inek serumu ile desteklenmiş DMEM aracı maddesi içinde 6 ml mevcudiyetinde kolajen süngeri üzerine mikro greft bir 1 mi.
4. Kültür, 3 gün sonra, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile% 0.3 paraformaldehid ile biyo-kompleksleri düzeltin. numune üzerine doğrudan belirli bir dağıtıcı ile parafin dökün. 5 um kalınlığında bir mikrotom ile dilimleri elde edilir ve cam slayt doğrudan koydu.
5. 20 mi ksilen (ticari olarak temin - - m-ksilen (40 karışımı -% 65), p-ksilen (% 20), o-ksilen (20% 15 ihtiva eden, histolojik analizler için bir cam içinde 5 um'lik parafin dilim daldırın ) ve ETHil benzen (6-20%) ve 3 dakika her biri için, tolüen, trimetil benzen, fenol, tiyofen, piridin ve hidrojen sülfid) izleri.
6. de-paraffinizing ve daha sonra deiyonize su (1 saat, 1 saat için% 80 etanol,% 70 etanol, 1 saat boyunca için 1 saat için% 100 etanol,% 95 etanol), etanol azalan sınıflarda dilimleri (% 100 ila% 70) daldırın ve bölümleri rehidrasyon.
7. 1 1 g / L Ematoxylin 2 ml - 1 - ile bölümleri Leke 2 dakika ve daha sonra herhangi bir Ematoxylin fazlası çıkarmak için su ile durulayın.
8. etanol% 70 ile karıştırılmış konsantrasyonunun% 1 Eosin Y alkolik çözelti, 5 dakika karıştırıldı ve su içinde seyreltildi - 4 bölümler Leke.
9. Her slayt bölümü için Eosin Y 2 ml ve akan musluk suyu altında durulayın - 1 kullanın.
10. Etanol sınıflarda artan bölümleri daldırın dayalı bir montaj mediumand 100X büyütme (Şekil 1D) bir ışık mikroskobu altında gözlemlemek bir 1 saat süreyle Ksilen içinde geçit, lamel sonra, nihayet ve (adım 1.6 bakınız).

2. Toplama, Ayrıştırma ve Doku Vitro Analizinde

1. Bir dermatom kullanarak, sırasıyla 0,6 mm, 1 mm ya da 4 farklı çoklu organ ve / veya çok bagaj alanından kalınlığı 2 mm bağımsız cilt dokusu, papiller de-epidermized dermis (Ded) ya da retiküler dermis (dermis) almak hasat, işleme ve nakli için doku dağıtımını Milli Kuralları (CNT 2013) takip eden 40 ile 55 yıl arasında değişen bir aralıkta doku bağış.
   1. Yavaşça 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde bir çanak koyarak% 0.9 NaCI çözeltisi tüm örnekleri yıkayın.
   2. 5 mm biyopsi yumruk kullanarak, deri dokusunun, Ded ve Dermisinde çapı muntazam ve ayrıştırma önce tüm doku örneklerinin tartmak örnekleri oluşturmak.
   3. ayrıştırma için tuzlu su çözeltisi, 1.5 ml ilave doku bozucu deri dokusu, DED sırasında veya dermiş sekiz, üç ya da dört tip numuneler, yerleştirin.
   4. farklı gerçekleştirinTüm doku örnekleri için ayrıştırma kat, Tablo 1 'de gösterilen.
   5. kontrol olarak bozulmamış doku örneklerinden elde edilen punch biyopsi bir muhabir numarasını kullanın.
   6. Mekanik ayrıştırma sonra ayrı ayrı 12 plaka tek bir kuyuda her numune mikro greft ve yeri ihtiva eden tuz çözeltisi aspire. bozulmamış kontrol punch biyopsi için aynı protokolü gerçekleştirin.
   7. Her bir örnek için,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotikler ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde 1 ml ekleyin.
   8. hemen hücre canlılığı değerlendirmek. her bir (sırasıyla deri dokusu, DED veya dermişi sekiz, üç ya da dört tek tip numuneler aynı anda ayrıştırma ile elde edilir), bir mikro-greft ihtiva eden 0.5 mg / MTT ml (3- [ihtiva eden ortam 1 ml ilave 4,5- dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolyum bromür) çözeltisi ve _CO2 / hava% 5 bir atmosferde 37 ° C de 3 saat inkübe edilir. sağlam kontrolü için aynı protokol gerçekleştirmebiyopsi yumruk.
   9. İnkübasyondan sonra, her MTT ihtiva eden ortam çıkarın ve 10 dakika süre ile, her bir numune, 1 ml dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
   10. bir küvet içinde her bir örnek ve DMSO aktarın ve bir spektrofotometre kullanılarak 570 nm'de optik yoğunluk (OD) okunmuştur. 570 nm'de absorbans oranı ve ayrıştırma daha önce kullanılan doku gram (gr) ağırlık hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması. bozulmamış kontrol punch biyopsi için aynı protokolü gerçekleştirin.
2. Mekanik ayrıştırma sonra, deri dokusu, tek bir vericinin aşınmıştır ve dermis örneklerinden türetilmiş mikro greft ihtiva eden tuzlu su çözeltisi aspire.
   1. 12 oyuklu bir plaka, tek bir oyuk ya da sırasıyla, hücre canlılığı testi ve morfolojik analiz için bir kültür şişesi içinde ayrı ayrı örnek yerleştirin.
   2. % 5 _CO2 / AI bir atmosferde 37 ° C 'de, 1 ml (12 çukurlu plaka) ya da 5 ml 1640 ortamında% 10 FCS ile takviye edilmiş RPMI (kültür şişesi) ile antibiyotik ilave kültür mikro greft24 saat ya da 7 gün süre ile R.
   3. 24 saat ya da 7 gün (tekrar 2.1.8-2.1.10 adımlar) sonra hücre canlılığı değerlendirmek.
   4. 24 saat ve şişe içindeki kültür 7 gün sonra ışık mikroskobu ile hücre süspansiyonu varlığını değerlendiren morfolojik analizi yapın.
   5. FACS analizi ⁶ ile CD146, CD34 ve CD45 antijenleri de dahil olmak üzere mezenşimal ve hematopoetik hücre belirteçleri, için pozitiflik için Dermisinde örneklerini analiz edin.
   6. Laminer akış kapağı tohum altında ve tamamen ayrıştırılmış olup, her doku numunesinde bir muhabir küçük bir parçası (deri dokusu sırasıyla Ded veya dermişi sekiz, üç ya da dört tek tip numuneler aynı anda ayrıştırma ile elde edilir), her mikro-grefti (> büyüklüğü 50 mikron % 5 koyun kanlı Broth 100 ul içeren Columbia agar plaka üzerine parçalanma sürecine sonra).
   7. Üç gün boyunca 37 ° C'de inkübe plakası ve kısırlık değerlendirmek için Columbia agar plakası üzerinde mikrobiyolojik analizler gerçekleştirmek ¹¹.

Sonuçlar

Bu ön çalışmada, ilk hedefimiz kullanıma hazır biyo-kompleksleri üretmek için kolajen gibi bir biyolojik destekle birlikte insan otolog mikro greftler, yeteneğini, araştırmaktır. Bu biyo-kompleksleri, bir hastada yerleştirildi Bir araba kazası (Şekil 2A) yol açtığı bir bacak lezyon ve 30 gün (Şekil 2B) sonra doku onarımı ile ilgili tam bir reepitelizasyon gözlenmiştir. Ayrıca, klinik takip, kl...

Tartışmalar

Bu ön çalışma. Zaten mikro greftler implantların ^{9 etkinliğini, 10} optimize etmek için, diğer klinik uygulamalarda bildirilen Bu protokol ile elde edilen mikro greftler, kollajen sünger ile kombine edilebilir olduğunu gösterdi Özellikle, bu çalışma bio kapasitesini bildirdi komplekslerdeki klinik uygulamadan 30 gün sonra, bir bacak lezyon yara iyileşmesi adjuvan, mikro-greft ve kolajen süngeri oluşmuştur. Ayrıca, in vitro sonuçlar hemen mekanik ayrıştırma sonra da 24 saat ve ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Human Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI medium	PBI International	733-2292
DMEM medium	PBI International	F 0415
Antibiotics	Biological Industries PBI	03-038-1
Antibodies for FACS Analysis	eBiosciences	code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		collagen sponge used for bio-complexes
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene	Carlo Erba