Ткань Характеристика после нового метода Дезагрегирование для кожи Micro-трансплантатов поколения

Резюме

Протокол описывает новый метод дезагрегации тканей человека и создать аутологичных микро-трансплантаты, которые, в сочетании с коллагеном губок, порождающие человека био-комплексов, готовых к использованию в лечении поражений кожи. Кроме того, эта система сохраняет жизнеспособность клеток микро-трансплантатов в разное время после механической дезагрегации.

Аннотация

Несколько новых методов были разработаны в области биотехнологии для получения аутологичных клеточных суспензий во время операции, с тем чтобы обеспечить еще один этап лечения острых и хронических кожных поражений. Кроме того, управление хронических, но и острых ран в результате травмы, диабета, инфекций и других причин, остается сложной. В этом исследовании мы описываем новый метод для создания аутологичных микро-трансплантаты из кожной ткани одного пациента и их клинического применения. Кроме того, в пробирке биологическая характеристика кожной ткани , полученной из кожи, де-epidermized дермы (DED) и дермы полиорганной и / или доноров нескольких тканей также была проведена. Все ткани были разбиты по этим новым протоколом, что позволяет нам получить жизнеспособные микро-трансплантатов. В частности, мы сообщали, что этот инновационный протокол способен создать био-комплексы, составленные аутологичных микро-трансплантатов и коллагеновых губок, готовых наносить на кожных поражений. Клиникал применение аутологичных биологических комплексов на поражения ног также сообщалось, показывая улучшение как процесса повторного epitalization и мягкости поражения. Кроме того, наша модель в пробирке показали , что жизнеспособность клеток после механического разукрупнения с этой системой поддерживается в течение долгого времени до семи (7) дней культуры. Мы также наблюдали, с помощью проточной цитометрии, что пул клеток, полученных из дезагрегации состоит из нескольких типов клеток, в том числе мезенхимальные стволовые клетки, которые оказывают ключевую роль в процессах регенерации и восстановления тканей, для их высокой регенеративного потенциала. Наконец, мы продемонстрировали в пробирке , что эта процедура сохраняет стерильность микро-трансплантатов при культивировании в чашки с агаром. Таким образом, мы приходим к выводу, что этот новый регенеративный подход может быть перспективным инструментом для врачей, чтобы получить в одну стадию жизнеспособного, стерильный и готов к использованию микро-трансплантаты, которые могут быть применены по отдельности или в сочетании с наиболее распространенным биологическим scaffoLDS.

Введение

В последние годы несколько новых методов были разработаны в области биотехнологии для получения аутологичных клеточных суспензий во время операции, с тем чтобы обеспечить один шаг лечения острых и хронических кожных поражений. Кроме того, управление острыми, но в основном хронических ран в результате травмы, диабета, инфекций и других причин, остается сложной. Существует свидетельств того, что хронические раны стали серьезной глобальной проблемой здравоохранения, в результате чего огромное финансовое бремя на системы здравоохранения во всем мире ^1.

Чтобы увеличить скорость успеха в лечении поражений кожи, отсутствие обширной манипуляции (в том числе сотовой усиления) и поддержание стерильных условий необходимы для того, чтобы создать клеточную суспензию, которую может быть выполнено немедленно на поврежденный участок пациентов, что позволит избежать более длительного обработки в чистых помещениях, таких как мобильные заводы. улицаarting из небольших биопсий кожи, шлифовка, центрифугирования и других методов разделения (например, ферментативным или механические), которые часто используются для получения суспензии клеток, которые могут быть выращены в среде для роста. Все эти методы обычно требуют длительного времени выполнения, подчеркивая клеточных структур, а также приводит к снижению жизнеспособности клеток. Другим важным аспектом является получение аутологичных клеточной суспензии готов к использованию клиницистами, например, для ремонта поврежденных участков. Кроме того, хорошо известно , что трансплантаты аутологичных ткани выживают процедуры передачи , чтобы в конечном итоге выжить в месте реципиента принципами индукции и проводимости ^{2, 3.} Идеальная трансплантат ткани должны быть легко доступны и имеют низкую антигенность и доноров сайта заболеваемости ^4.

На основании этих доказательств, первая цель данного исследования состояла в том, чтобы создать аутологичных био-комплексы, пригодные дляклиническое применение в восстановлении тканей. Для этой цели мы описываем новый метод для получения аутологичных микро-трансплантаты, начиная от кожных тканей, которые были с разбивкой по этому протоколу. Случай презентации также описано здесь в качестве клинического применения аутологичных микро-трансплантатов, полученных этим протоколом в сочетании с коллагеном губок. Такой подход уже сообщалось , чтобы быть эффективными в механической дезагрегации тканей человека ⁵ и он был использован в клинике для трансплантатов и регенерации тканей дермы ^6,7, а также для регенеративной терапии соединительной ткани в полости рта челюстно - лицевой хирургии ^8-10 ,

Кроме того, второй целью данного исследования было биологическая характеристика кожных тканей после того, как их дезагрегации по этому протоколу. С этой целью различные гомологичные образцы кожной ткани происходит от области ствола различных полиорганнойи / или доноры нескольких тканей были обработаны в соответствии с национальными правилами по заготовке, переработке и распределению тканей для трансплантации (НСТ 2013) на Эмилия-Романья Региональный Skin Bank.

История болезни:

A 35-летний пациентка показывает сложную травму из-за автомобильной аварии был принят в отделении интенсивной терапии больницы Анконы. Пациент показал инфекцию на ноге из-за открытой раны и сложный перелом, стабилизированный внешней фиксации. Два радикала санацию были выполнены и когда рана стала чистой после отрицательной Прессотерапия (VAC терапия) и надкостницы выглядели здоровыми, мы применили протокол по истечении двух месяцев с момента восстановления. После дезагрегации с этой системой, микро-трансплантаты, полученные были использованы для создания био-комплексы с коллагеновой губки, которые впоследствии были имплантированы для того, чтобы исследовать их эффективность по ремонту повреждений.

протокол

Заявление по этике: так как клиническое применение протокола требует использования кожным аутогенной ткани пациента, его характеристика в пробирке проводили до клинического применения на гомологичной кожной ткани в Эмилия - Романья Региональный банк кожи с соблюдением требований национальных правил по заготовке, переработке и распределение тканей для трансплантации (НСТ 2013).

1. Био-комплекс здания для клинического применения

Примечание: Этот протокол клинически основанный на использовании Rigeneracons (ткань дезинтегратор) и Rigenera Machine (тканевой системы дезинтегратор) (Рис . 1А) Дезинтегратор ткани представляет собой биологический медицинский разрушитель человеческих тканей, способных нарушить небольшие кусочки тканей с использованием сетки, представленную шестиугольными лезвиями и фильтрующих элементов и компонентов внеклеточного матрикса с отсечкой около 50 микрон.

1. Соберите skinsamples пациента через биopsy пуансон (Фиг.1В) и дезагрегации добавлением 1 мл физиологического раствора для каждой части , чтобы получить аутогенные трансплантаты ^{микро-6,7,9} (или см шаг 2.1).
2. Поместите 1 мл микро-трансплантатов на коллагеновых губок (Рисунок 1C) toform био-комплексы использовать для клинического применения.
3. Культура еще 1 мл микро-трансплантатов на коллагене губок в присутствии 6 мл DMEM среде , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ увлажненной атмосфере.
4. После 3-х дней культивирования фиксируют био-комплексы с 0,3% параформальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Налейте парафин с конкретным дозатором непосредственно на образце. Получают срезы с помощью микротома толщиной 5 мкм и поместить непосредственно в стеклянном салазкам.
5. Погружают парафиновые срезы 5 мкм в стакане для гистологического анализа, содержащий 15 - 20 мл ксилола (имеющийся в продаже - смесь м-ксилол (40 - 65%), п-ксилол (20%), о-ксилол (20% ) и ETHил бензола (6 - 20%) и следы толуола, триметилбензол, фенол, тиофен, пиридин и сероводород) в течение 3 минут каждый.
6. Погружают ломтики в убывающем сортов (100% до 70%) этанола (100% этаноле в течение 1 ч, 95% этанола в течение 1 ч, 80% этанола в течение 1 часа, 70% этанола в течение 1 ч), а затем деионизированной воды для де-paraffinizing и регидратации секции.
7. Пятно разделы с 1 - 2 мл 1 г / л Ematoxylin за 1 - 2 мин, а затем промыть в воде, чтобы удалить любые излишки Ematoxylin.
8. Пятно секции для 4 - 5 мин с спиртовым раствором эозин Y при 1% концентрации в смеси с этанолом 70% и разводят в воде.
9. Используйте 1 - 2 мл эозина Y для каждой секции слайдов и промыть под проточной водой.
10. Погрузитесь секции в увеличении сортов этанола (см шаг 1.6) и , наконец, после прохождения в ксилоле в течение 1 ч, покровное с основанным монтажа mediumand наблюдать под световым микроскопом при 100 - кратном увеличении (рис 1D).

2. Сбор, Разбивка и экстракорпоральное Анализ тканей

1. С помощью дерматома, принимать независимые ткани кожи, папиллярной де-epidermized дермы (DED) или ретикулярной дермы (дермы), соответственно, на 0,6 мм, 1 мм или 2 мм толщиной от области ствола 4-х различных полиорганной и / или многоканальные доноров тканей в диапазоне от 40 до 55 лет, в соответствии с национальными правилами по заготовке, переработке и распространении тканей для трансплантации (CNT 2013).
   1. Аккуратно промойте все образцы в 0,9% растворе NaCl положить их в блюдо на орбитальном шейкере в течение 5 мин.
   2. Используя трепанобиопсия 5-мм, создавать образцы, которые являются однородными в диаметре от кожной ткани, DED и дермы и взвесьте все образцы тканей перед дезагрегации.
   3. Вставка, восемь трех или четырех однородных образцов ткани кожи, DED или дермы соответственно, в дезинтегратор ткани, добавлением 1,5 мл физиологического раствора для дезагрегации.
   4. Выполните разныевремена дезагрегации для всех образцов ткани , как указано в таблице 1.
   5. Используйте соотвествующее число перфорационных биопсий, полученных из образцов неповрежденной ткани в качестве контрольных.
   6. После механической дезагрегации, аспирация солевой раствор, содержащий микро-трансплантатов и поместить отдельно каждый образец в отдельную лунку 12-луночного планшета. Выполните тот же протокол для управления неповрежденными пробивных биопсий.
   7. Добавить 1 мл RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотики для каждого образца.
   8. Оценка жизнеспособности клеток немедленно. В каждую лунку, содержащую микро-трансплантат (полученный путем одновременного дезагрегации, восьми трех или четырех однородных образцах ткани кожи, DED или дермы соответственно) добавляют 1 мл среды, содержащей 0,5 мг / мл МТТ (3- [4,5- диметилтиазол-2-ил]) раствор бромида -2,5 дифенилтетразолийбромид и инкубировать в течение 3 ч при 37 ° с в атмосфере 5% СО ₂ / воздух. Выполните тот же протокол для интактного контроляпробивать биопсию.
   9. После инкубации, удалить всю среду, содержащую МТТ, и добавляют к каждому образцу 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 10 мин.
   10. Передача каждого образца и ДМСО в кювете и считывали при оптической плотности (OD) при 570 нм с использованием спектрофотометра. Рассчитать жизнеспособность клеток как отношение оптической плотности при длине волны 570 нм и вес в граммах (гр) ткани, использованными перед дезагрегации. Выполните тот же протокол для управления неповрежденными пробивных биопсий.
2. После механической дезагрегации, аспирация солевой раствор, содержащий микро-трансплантат, полученный из тканей кожи, DED и дермы образцы одного донора.
   1. Поместите отдельно каждую пробу в отдельную лунку 12-луночного планшета или в культуральной колбе для испытания жизнеспособности клеток и морфологического анализа соответственно.
   2. Культура микро-трансплантаты прибавлением 1 мл (12-луночный планшет) и 5 мл (культуральный флакон) в среде RPMI 1640 , дополненной 10% FBS и антибиотиков при 37 ° С в атмосфере 5% CO ₂ / AIг в течение 24 часов или 7 дней.
   3. Оценка жизнеспособности клеток через 24 часа или 7 дней (повторите шаги 2.1.8-2.1.10).
   4. Выполните морфологический анализ оценки присутствия суспензии клеток с помощью световой микроскопии после 24 часов и 7 дней культивирования в колбе.
   5. Анализируют образцы дермы для позитивности к мезенхимальных и маркеры гемопоэтических клеток, в том числе CD146, CD34 и CD45 антигенов с помощью анализа FACS ^6.
   6. Под ламинарного потока семян капот каждый микро-трансплантат (полученный путем одновременного дезагрегации, восьми трех или четырех однородных образцах ткани кожи, Дедом или дермы соответственно) и корреспондентскому небольшой фрагмент каждого образца ткани не полностью детализированном (> 50 мкм по размеру после того, как процесс дезагрегирования) на колумбийского агара, пластину, содержащую 5% овечьей крови отвар по 100 мкл.
   7. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение трех дней , а также выполнять микробиологического анализа на колумбийского агара пластины с целью оценки стерильности ¹¹,

Результаты

В этом предварительном исследовании, первая цель состояла в том, чтобы исследовать способность человека аутологичных микро-трансплантатов в сочетании с биологической поддержки, таких как коллаген, для производства био-комплексов, готовых к использованию. Эти био-ко?...

Обсуждение

Это предварительное исследование показало , что микро-трансплантаты , полученные с помощью этого протокола можно комбинировать с коллагеновыми губками, как уже сообщалось в других клинических применениях, для оптимизации эффективности микро-трансплантаты имплантатов ^{9, 10.} В час...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Human Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI medium	PBI International	733-2292
DMEM medium	PBI International	F 0415
Antibiotics	Biological Industries PBI	03-038-1
Antibodies for FACS Analysis	eBiosciences	code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		collagen sponge used for bio-complexes
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene	Carlo Erba