אפיון רקמות לאחר שיטה חדשה חלוקה לעור מיקרו שתלי הדור

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה חדשה disaggregate ברקמות אדם ליצור-שתל מייקרו עצמי, וזה ביחד עם ספוגי קולגן, להצמיח-מתחמים ביו אדם מוכנים לשימוש בטיפול נגעים בעור. יתר על כן, מערכת זו שומרת כדאיות התא של שתלי מיקרו בזמנים שונים לאחר חלוקה מכני.

Abstract

כמה שיטות חדשות פותחו בתחום הביוטכנולוגיה להשיג השעיות הסלולר עצמיות במהלך ניתוח, על מנת לספק טיפולי צעד אחד עבור נגעי עור כרוניים וחמורים. יתר על כן, ההנהלה כרוני אלא גם פצעים חריפים כתוצאה מטראומה, סוכרת, זיהומים וכן גורמים נוספים, נותרת מאתגרת. במחקר זה אנו מתארים שיטה חדשה ליצירה-שתל מייקרו עצמי מרקמות עורית של חולה יחיד היישום הקליני שלהם. יתר על כן, במבחנה ביולוגית ואפיון של רקמות עורית נגזרו עור, הדרמיס-epidermized דה (Ded) ו הדרמיס של באיברים רבים ו / או תורמים רבות רקמות גם בוצע. כל הרקמות היו מפוצל על פי הפרוטוקול החדש, המאפשר לנו להשיג-שתלי מיקרו קיימא. בפרט, דיווחנו כי פרוטוקול חדשני זו הוא מסוגל ליצור ביו-מתחמים שהלחינו שתלי-מייקרו עצמי וקולגן ספוגים מוכן להיות מיושם על פצעים בעור. cliniיישום קאל של מתחמי ביו עצמיים על נגע ברגלו נמסר גם, מראה שיפור של שני תהליך מחדש epitalization ורכות של הנגע. בנוסף, המודל במבחנה שלנו הראה כי כדאיויות תא לאחר חלוקה מכאנית עם מערכת זו נשמרות לאורך זמן עד שבעה (7) ימים של התרבות. אנחנו גם ציינו, על ידי ניתוח תזרים cytometry, כי ברכת תאים המתקבלים חלוק מורכבת של תאים מסוגים שונים, כוללים בתאי גזע mesenchymal, כי להפעיל תפקיד מרכזי בתהליכי התחדשות ותיקון רקמות, עבור פוטנציאל ההתחדשות הגבוה שלהם. לבסוף, הראינו במבחנה כי נוהל זה שומר על סטריליות של שתלי מיקרו כאשר בתרבית במנות אגר. לסיכום, אנו מגיעים למסקנה כי גישת משובים חדשה זו יכולה להיות כלי מבטיח עבור קלינאים להשיג בצעד אחד קיימא, סטרילי ומוכנה לשימוש-שתל מייקרו שניתן ליישם לבד או בשילוב עם מרבית scaffo הביולוגי המשותףLDS.

Introduction

בשנים האחרונות, מספר שיטות חדשות פותחו בתחום הביוטכנולוגיה להשיג השעיות הסלולר עצמיות במהלך ניתוח על מנת לספק טיפולי צעד אחד עבור נגעי עור כרוניים וחמורים. יתר על כן, את הניהול של פצעים חריפים אבל בעיקר כרוניים כתוצאה מטראומה, סוכרת, זיהומים, וכן גורמים נוספים, נותר מאתגר. יש ראיות גוברות כי בפצעים כרוניים הפכו בעיה בריאותית עולמית רצינית, ועלולים ליצור ניטל כספי עצום על מערכות בריאות ברחבי עולם ^1.

כדי להגדיל את שיעור ההצלחה בטיפול נגעים בעור, בהיעדר המניפולציה נרחבת (כולל שיפור הסלולר) והשמירה על תנאים סטריליים חיוניים, כדי ליצור השעיה הסלולר שניתן ליישם באופן מיידי על האזור הפגוע של חולים, ובכך להימנע עיבוד יותר מן החדרים הנקיים כגון מפעלי סלולרי. רחובarting ביופסיות עור קטנים, טחינה, צנטריפוגה ושיטות הפרדה אחרות (למשל, אנזימטי או מכאני), משמשים לעתים קרובות כדי לקבל השעיה הסלולר, אשר יכול להיות מתורבתת במדיום גידול. כל השיטות האלה דורשים בדרך כלל זמן רב של ביצוע, והדגיש מבני התא, מה שמוביל לירידה של כדאיויות תא. היבט נוסף משמעותי הוא להשיג השעיה הסלולר עצמית מוכנה להיות בשימוש על ידי רופאים, למשל, כדי לתקן אזורים פגועים. יתר על כן, היא מבוססת היטב כי שתל רקמה עצמית לשרוד את נהלי ההעברה בסופו של דבר לשרוד האתר המקבל על פי העקרונות של אינדוקציה וחוטים ^{2, 3.} רקמת השתל האידיאלית צריכה להיות זמינה ויש antigenicity נמוך באתר תורם לתחלואה ^4.

על בסיס עדויות אלה, המטרה הראשונה של המחקר הנוכחי הייתה ליצור מתחמי ביו עצמיים מתאימיםיישום קליני בתיקון רקמות. לשם כך, אנו מתארים שיטה חדשה לקבלה-שתל מייקרו עצמי החל רקמות עורית שהיו מפוצלות על פי פרוטוקול זה. הצגה מקרה גם מתוארת במסמך זה כיישום קליני של שתלי מייקרו העצמיים מתקבלים על ידי פרוטוקול זה בשילוב עם ספוגי קולגן. גישה זו כבר דווחה להיות יעיל החלוקה המכאנית של רקמות אנושיות ⁵ וזה כבר בשימוש קליני עבור שתלים והתחדשות של רקמות עורי ^6,7 וכן עבור טיפולים רגנרטיבית של רקמות חיבור בכירורגיה אוראלית ולסת ^8-10 .

בנוסף, המטרה השנייה של המחקר היה ביולוגי והאפיון של הרקמות עורית לאחר החלוקה שלהם על ידי פרוטוקול זה. לשם כך, דגימות הומולוגיות שונות של רקמות עורית נגזרו באזור תא המטען של באיברים רבים שוניםו / או תורמים רבות רקמות עובד הבאים חוקים לאומיים קציר, עיבוד והפצה של רקמות להשתלה (CNT 2013) ב Skin אמיליה רומניה האזורית בנק.

הצגת מקרה:

מטופלת 35 בן מראה טראומה מורכבת בשל תאונת דרכים אושפז ביחידה לטיפול נמרץ של בית החולים אנקונה. החולה הראה זיהום על הרגל בשל פצע פתוח שבר מסובך התייצב עם קיבוע חיצוני. שנייה הטריה רדיקלית בוצעה וכאשר הפצע הפך נקי לאחר טיפול בלחץ שלילי (טיפול VAC) ואת קרום העצם ונראה בריא, אנחנו מוחלים הפרוטוקול לאחר חודשי התאוששות. לאחר חלוקה עם מערכת זו, מיקרו-שתלי השיג שימשו כדי ליצור ביו-קומפלקסים עם ספוג קולגן אשר הושתלו מכן על מנת לחקור את יעילותם על תיקון הנגע.

Protocol

הצהרת אתיקה: מאז היישום הקליני של הפרוטוקול מחייב שימוש רקמות עצמיות עורית של המטופל, האפיון שלה במבחנה בוצעה לפני שימוש קליני על רקמות עורית הומולוגיות בבנק עור האזורי אמיליה רומניה ביצוע ההנחיות של חוקי המדינה על קצירה, עיבוד והפצת רקמות להשתלה (CNT 2013).

1. בניין ביו-קומפלקס עבור יישומים קליניים

הערה: פרוטוקול זה מבוסס קליני על השימוש Rigeneracons (משבש רקמות) ואת מכונת Rigenera (מערכת משבש רקמות) (איור 1 א). משבש הרקמות הוא משבש רפואי ביולוגי של רקמות אדם מסוגלות לשבש חתיכות קטנות של רקמות באמצעות רשת שמספקת להבי משושה ותאי סינון מרכיבי תאי מטריקס עם ניתוק של כ -50 מיקרון.

1. אסוף skinsamples של המטופל באמצעות דואגרוף opsy (איור 1B) ו disaggregate הוספת 1 ​​מ"ל של תמיסת מלח בעד כל יחידה להשיג ^6,7,9 מיקרו שתלי עצמיים (או ראה שלב 2.1).
2. מקום 1 מ"ל של שתלי מיקרו על ספוגים קולגן (איור 1 ג) מתחמי ביו toform להשתמש עבור יישומים קליניים.
3. תרבות 1 מ"ל נוסף של שתלי מיקרו על ספוגים קולגן בנוכחות 6 מ"ל של מדיום DMEM בתוספת 10% עוברית שור סרום על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified 5% CO _2.
4. בעקבות 3 ימים של תרבות, לתקן את מתחמי ביו עם Paraformaldehyde 0.3% במשך 10 דקות ב RT. יוצק את פרפין עם מתקן ספציפי ישירות על המדגם. השג פרוסות עם microtome עם עובי של 5 מיקרומטר ולשים ישירות א-שקף זכוכית.
5. לטבול פרוסות פרפין 5 מיקרומטר בכוס עבור ניתוחים היסטולוגית, המכיל 15 - 20 מ"ל קסילן (זמינים מסחרית - שילוב של-קסילן מ (40 - 65%), p-קסילן (20%), o-קסילן (20% ) ו ת 'בנזן י.ל. (6 - 20%) ואת עקבות של טולואן, בנזן trimethyl, פנול, thiophene, פירידין ומימן גופרי) עבור 3 דקות כל אחד.
6. לטבול את פרוסות בכיתות ירידה (100% עד 70%) של אתנול (אתנול 100% עבור 1 שעות, אתנול 95% במשך שעה 1, 80% אתנול עבור 1 שעות, 70% אתנול עבור שעה 1) ולאחר מכן מים deionized עבור דה-paraffinizing ו rehydrating הסעיפים.
7. הכתם בסעיפים עם 1 - 2 מ"ל של 1g / L Ematoxylin 1 - 2 דקות ולאחר מכן לשטוף במים כדי להסיר כל עודף Ematoxylin.
8. כתם בסעיפים 4 - 5 דקות עם פתרון אלכוהוליים Eosin Y ב 1% של הריכוז מהול% אתנול 70 ו מדולל במים.
9. השתמש 1 - 2 מ"ל של Eosin Y עבור כל מקטע השקופית ולשטוף תחת מי ברז זורמים.
10. לטבול סעיפים בהגדלת ציונים של אתנול (ראה שלב 1.6) ולבסוף, אחרי מעבר קסילן עבור 1h, coverslip עם הרכבה מבוססת mediumand להתבונן במיקרוסקופ אור בהגדלת 100x (1D איור).

2. אוסף, חלוקה ו בניתוח חוץ גופית של רקמות

1. באמצעות dermatome, לקחת רקמת העור עצמאית, הדרמיס papillary-epidermized דה (Ded) או הדרמיס רשתי (הדרמיס) בהתאמה של 0.6 מ"מ, 1 מ"מ או 2 מ"מ עובי מאזור תא המטען של 4-איבר רב שונים ו / או רב תורם רקמה נעימה בין 40 עד 55 שנים, לפי החוקים הלאומיים קציר, עיבוד והפצה של רקמות להשתלה (CNT 2013).
   1. בעדינות ולשטוף את כל הדגימות בתמיסת 0.9% NaCl לשים אותם בצלחת על שייקר מסלולית במשך 5 דקות.
   2. באמצעות ביופסיה של 5 מ"מ, ליצור דוגמאות אשר הם אחידים בקוטר מרקמת העור, Ded ו הדרמיס ולשקול כל דגימות רקמה לפני חלוקה.
   3. כנס שמונה, שלוש או ארבע דגימות אחידות של רקמת עור, Ded או הדרמיס בהתאמה, המשבש הרקמות, הוספת 1.5 מיליליטר של תמיסת מלח על החלוקה.
   4. בצע שונהבעתות חלוקות לכל דגימות הרקמה הצביעו כפי בטבלה 1.
   5. השתמש במספר כתב של ביופסיות אגרוף נגזרות דגימות רקמת שלמים כקבוצת ביקורת.
   6. לאחר חלוקה מכני, לשאוב את תמיסת מלח המכיל מיקרו-שתלי ומקום בנפרד כל דגימה בתוך באר אחת של צלחת 12-היטב. בצע את הפרוטוקול זהה עבור ביופסיות אגרוף שליטה ללא פגע.
   7. הוסף 1ml של מדיום 1640 RPMI בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ואנטיביוטיקת מדגם זה.
   8. להעריך את כדאיות התא מיד. זה טוב המכיל-שתל מיקרו (והושג ע"י חלוקה סימולטני של שמונה, שלושה או ארבעה דגימות אחיד של רקמת העור, Ded או הדרמיס בהתאמה) להוסיף 1ml של המדיום המכיל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​של MTT (3- [4,5- dimethylthiazol-2-י.ל.) פתרון ברומיד] -2,5 diphenyltetrazolium דגירה במשך 3 שעות ב 37 ° C באווירה של 5% ₂ / אוויר CO. בצע את הפרוטוקול אותה לשליטה ללא פגעאגרוף ביופסיות.
   9. לאחר דגירה, להסיר את כל MTT בינוני המכיל ולהוסיף לכל sulfoxide דימתיל מדגם 1 מ"ל (DMSO) במשך 10 דקות.
   10. העבר לדגום כל DMSO ב קובט ולקרוא בו צפיפות אופטית (OD) ב 570 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. חישוב כדאיויות תא כיחס בין הספיגה ב 570 ננומטר ואת המשקל בגרמים (גר ') של רקמה בשימוש לפני החלוקה. בצע את הפרוטוקול זהה עבור ביופסיות אגרוף שליטה ללא פגע.
2. לאחר חלוקה מכני, לשאוב את תמיסת מלח המכיל מיקרו-שתל נגזר רקמות העור, Ded ו הדרמיס דגימות של מתורם יחיד.
   1. מניחים בנפרד כל דגימה בתוך באר אחת של צלחת 12-היטב או בבקבוק תרבות עבור מבחן כדאיות התא ניתוח מורפולוגי בהתאמה.
   2. מיקרו-שתלי תרבות הוספת 1 ​​מ"ל (צלחת 12-היטב) או 5 מ"ל (בקבוק תרבות) של RPMI 1640 בתוספת בינוני עם 10% FBS ואנטיביוטיקה ב 37 ° C באווירה של 5% CO ₂ / AIr למשך 24 שעות או 7 ימים.
   3. להעריך את כדאיות התא לאחר 24 שעות או 7 ימים (חזור על שלבים 2.1.8-2.1.10).
   4. ביצוע ניתוח מורפולוגי הערכת הנוכחות של תרחיף תאים על ידי מיקרוסקופ אור לאחר 24 שעות ו -7 ימים של תרבות בקבוק.
   5. ניתוח דגימות של הדרמיס עבור חיוביות אל mesenchymal וסמנים תאים hematopoietic, כולל CD146, אנטיגנים CD34 ו CD45 על ידי FACS ניתוח ^6.
   6. תחת זרע תזרים ברדס למינרית כל-שתל מייקרו (והושג ע"י החלוקה סימולטני של שמונה, שלוש או ארבע דגימות אחידות של רקמת עור, Ded או הדרמיס בהתאמה) ושבר כתב קטן של כל דגימת רקמה לא מפוצל לגמרי (> 50 מיקרון גודל לאחר תהליך חלוק) על צלחת אגר קולומביה המכילה מרק דם כבשים 5% 100 μl.
   7. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים ולבצע ניתוח מיקרוביולוגית על צלחת אגרה קולומביה כדי להעריך את העקרות ¹¹.

תוצאות

במחקר ראשוני זה, המטרה הראשונה הייתה לבדוק את היכולת של שתלי מייקרו עצמיים אדם בשילוב עם תמיכה ביולוגית, כגון קולגן, לייצר ביו-מתחמים מוכנים לשימוש. ביו-מתחמים אלה הושתלו בחולה עם פצע ברגל נגרם על ידי (איור 2 א) בתאונת דרכי...

Discussion

מחקר ראשוני מראה כי שתלי מיקרו-מתקבל על ידי פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם ספוגים קולגן, כפי שכבר דווח ביישומים קליניים אחרים, כדי לייעל את היעילות של שתלים מיקרו שתלי ^{9, 10.} בפרט, מחקר זה דיווח על קיבולת של ביו -complexes, היווה ידי שתלים-מייקרו וספוגי קולגן, כדי adjuvant ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Human Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI medium	PBI International	733-2292
DMEM medium	PBI International	F 0415
Antibiotics	Biological Industries PBI	03-038-1
Antibodies for FACS Analysis	eBiosciences	code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		collagen sponge used for bio-complexes
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene	Carlo Erba