Caracterização do tecido depois de um novo método de desagregação para a pele Micro-enxertos Generation

Resumo

O protocolo descreve um novo método para desagregar os tecidos humanos e para criar micro-enxertos autólogos que, combinado com esponjas de colagénio, dá origem à bio-complexos humanos, prontos para utilização no tratamento de lesões da pele. Além disso, este sistema preserva a viabilidade das células de micro-enxertos em diferentes momentos após a desagregação mecânica.

Resumo

Vários novos métodos foram desenvolvidos no campo da biotecnologia para obter suspensões celulares autólogas durante a cirurgia, a fim de proporcionar tratamentos de uma etapa para lesões cutâneas agudas e crônicas. Além disso, o tratamento de feridas agudas crónicas mas também resultantes de trauma, diabetes, infecções e outras causas, permanece um desafio. Neste estudo, descrevemos um novo método para criar autólogas micro-enxertos de tecido cutâneo de um único paciente e sua aplicação clínica. Além disso, também foi realizada in vitro caracterização biológica do tecido cutâneo derivadas da pele, derme desepidermizada (DED) e derme de múltiplos órgãos e / ou doadores de multi-tecido. Todos os tecidos foram desagregados por este novo protocolo, o que nos permite obter micro-enxertos viáveis. Em particular, relatou que este protocolo inovador é capaz de criar bio-complexos compostos por micro-enxertos autólogos e esponjas de colagénio prontas para serem aplicadas sobre lesões cutâneas. o cliniaplicação de bio-CAL complexos autólogos de uma lesão da perna também foi relatado, mostrando uma melhoria de ambos processo de re-epitalization e suavidade da lesão. Para além disso, o nosso modelo in vitro mostrou que a viabilidade das células após a desagregação mecânica com este sistema é mantido ao longo do tempo durante até sete (7) dias de cultura. Também se observou, por análise de citometria de fluxo, que o conjunto de células obtidas a partir de desagregação é composta por vários tipos de células, incluindo células estaminais mesenquimais, que exercem um papel fundamental nos processos de regeneração e reparação de tecidos, para o seu elevado potencial de regeneração. Finalmente, foi demonstrado in vitro que este procedimento mantém a esterilidade das micro-enxertos, quando cultivadas em placas de agar. Em resumo, conclui-se que esta nova abordagem regenerativa pode ser uma ferramenta promissora para os clínicos para se obter num só passo viável, esterilizado e pronto a utilizar micro-enxertos que podem ser aplicados isoladamente ou em combinação com mais Scaffo biológica comumLDS.

Introdução

Nos últimos anos, vários novos métodos têm sido desenvolvidos no campo da biotecnologia para obter suspensões celulares autólogas durante a cirurgia, a fim de proporcionar tratamentos de um passo para lesões cutâneas agudas e crónicas. Além disso, o tratamento de feridas agudas, mas principalmente crónicas resultantes de trauma, diabetes, infecções, e outras causas, permanece um desafio. Há evidências crescentes de que feridas crônicas tornaram-se um grave problema de saúde global, causando um encargo financeiro enorme para os sistemas de saúde em todo o mundo ^1.

Para aumentar a taxa de sucesso no tratamento de lesões da pele, a ausência de manipulação extensiva (incluindo o reforço celular) e a manutenção de condições estéreis é essencial, a fim de criar uma suspensão celular que pode ser imediatamente aplicada sobre a área danificada da pacientes, evitando assim um maior processamento em salas limpas, como fábricas celulares. Starting a partir de pequenas biópsias de pele, moagem, centrifugação e outros métodos de separação (por exemplo, mecânica ou enzimática), são frequentemente utilizados para se obter uma suspensão celular, que podem ser cultivadas num meio de crescimento. Todos estes métodos requerem geralmente um longo período de tempo de execução, salientando as estruturas celulares, e que conduz a uma redução da viabilidade das células. Outro aspecto importante é a obtenção de uma suspensão celular autólogo preparado para ser utilizado por médicos, por exemplo, para reparar áreas danificadas. Além disso, está bem estabelecido que os enxertos de tecido autólogo sobreviver aos procedimentos de transferência de, eventualmente, sobreviver no local receptor pelos princípios da indução e condução ^{2, 3.} O tecido do enxerto ideal deveria ser prontamente disponíveis e têm baixa antigenicidade e dador local morbidade ^4.

Na base destas evidências, o primeiro objectivo deste estudo foi o de criar bio-complexos autólogos adequados paraaplicação clínica na reparação de tecidos. Para este fim, descrevemos um novo método para obter autólogas micro-enxertos a partir de tecidos cutâneos que foram desagregados por este protocolo. A apresentação do caso também é aqui descrito como uma aplicação clínica de micro-enxertos autólogos obtidos por este protocolo em combinação com esponjas de colágeno. Esta abordagem já foi relatada como sendo eficaz na desagregação mecânica dos tecidos humanos e ⁵ tem sido utilizado clinicamente para enxertos e a regeneração de tecidos dérmicos ^6,7, bem como para as terapias de regeneração de tecidos conjuntivos em cirurgia oral-maxilofacial ^8-10 .

Além disso, o segundo objetivo deste estudo foi a caracterização biológica dos tecidos cutâneos após a sua desagregação por este protocolo. Para este efeito, diferentes amostras de tecido cutâneo homólogos derivados de área do tronco de diferentes múltiplos órgãose / ou doadores multi-tecido foram processadas seguindo as normas nacionais relativas colheita, processamento e distribuição de tecidos para transplante (CNT 2013) no Bank Emilia Romagna Regional da pele.

APRESENTAÇÃO DO CASO:

Uma paciente de 35 anos de idade, mostrando um trauma complexo devido ao acidente de carro foi admitido na Unidade de Terapia Intensiva do Hospital Ancona. O paciente mostrou uma infecção na perna devido a uma ferida aberta e uma fratura estabilizada com fixação externa. Dois desbridamento radical foram realizadas e quando a ferida se tornou limpa após a terapia de pressão negativa (terapia VAC) e do periósteo parecia saudável, foi aplicado o protocolo depois de dois meses de recuperação. Após a desagregação com este sistema, as micro-enxertos obtidos foram utilizados para criar bio-complexos com uma esponja de colagénio, que foram subsequentemente implantado, a fim de investigar a sua eficácia sobre a reparação da lesão.

Protocolo

Declaração de ética: uma vez que a aplicação clínica do protocolo requer o uso de tecido autólogo cutânea do paciente, a sua caracterização in vitro foi realizado antes do uso clínico sobre o tecido cutâneo homólogo do Bank pele Emilia Romagna Regional seguindo as orientações das normas nacionais de colheita, processamento e distribuição de tecidos para transplante (CNT 2013).

1. Edifício Bio-complexo para Aplicação Clínica

NOTA: Este protocolo é clinicamente com base na utilização de Rigeneracons (disruptor de tecido) e o Rigenera Máquina (sistema disruptor de tecido) (Figura 1A). O disruptor de tecido é um disruptor médica biológica de tecidos humanos capazes de perturbar pequenos pedaços de tecidos por meio de uma grade fornecida por lâminas hexagonais e células de filtragem e componentes de matriz extracelular com um cut-off de cerca de 50 microns.

1. Recolha skinsamples do paciente através de um bisoco opsy (Figura 1B) e desagregar a adição de 1 ml de solução salina por cada peça para obter autólogas micro-enxertos ^6,7,9 (ou veja o passo 2.1).
2. Colocar 1 ml de micro-enxertos sobre esponjas de colagénio (Figura 1C) toform bio-complexos de utilizar para aplicação clínica.
3. Cultura mais 1 ml de micro-enxertos sobre esponjas de colagénio na presença de 6 ml de meio DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino a 37 ° C em atmosfera de _CO2 a 5% humidificada.
4. Após 3 dias de cultura, fixar os bio-complexos com 0,3% de paraformaldeído durante 10 min à TA. Verter a parafina com um distribuidor específico directamente sobre a amostra. Obter fatias com um micrótomo com espessura de 5 mm e colocar diretamente em um copo-slide.
5. Imergir fatias de parafina de 5 pm em um copo para análises histológicas, contendo 15 - 20 ml de xileno (disponível comercialmente - uma mistura de m-xileno (40 - 65%), p-xileno (20%), o-xileno (20% ) e ethbenzeno il (6 - 20%) e traços de tolueno, trimetilbenzeno, fenol, tiofeno, piridina e sulfureto de hidrogénio), durante 3 minutos cada.
6. Mergulhar as fatias em graus decrescentes (100% a 70%) de etanol (100% de etanol durante 1 h, 95% de etanol durante 1 h, 80% de etanol durante 1 h, 70% de etanol durante 1 hora) e água, em seguida água desionizada para de-paraffinizing e re-hidratação das secções.
7. Manchar as seções com 1 - 2 ml de 1 g / L Ematoxylin para 1-2 min e posteriormente enxaguar em água para remover qualquer excesso de Ematoxylin.
8. Corar as secções de 4 - 5 min com solução alcoólica de eosina Y à concentração de 1% misturado com etanol a 70% e diluiu-se em água.
9. Use 1 - 2 ml de eosina Y para cada seção lâmina e lavar em água corrente da torneira.
10. Imergir secções em aumentar os graus de etanol (ver passo 1.6) e, por fim, depois de uma passagem em xileno durante 1h, a lamela com uma base de montagem mediumand observar sob um microscópio de luz, uma ampliação de 100X (Figura 1D).

2. Recolha, desagregação e Análise in vitro dos tecidos

1. Usando um dermátomo, pegue o tecido independente da pele, papilares derme desepidermizada (DED) ou derme reticular (derme), respectivamente, de 0,6 mm, 1 mm ou 2 mm de espessura da área de tronco de 4 de múltiplos órgãos e / ou multi- diferente doadores de tecidos em um intervalo de 40 a 55 anos, seguindo as normas nacionais relativas colheita, processamento e distribuição de tecidos para transplante (CNT 2013).
   1. Lave todas as amostras em solução de NaCl 0,9% colocando-os em um prato em um agitador orbital por 5 min.
   2. Usando o soco biópsia de 5 mm, criar amostras que são uniformes de diâmetro a partir do tecido da pele, Ded e derme e pesar todas as amostras de tecido antes da desagregação.
   3. Inserir oito, três ou quatro amostras uniformes de tecido da pele, Ded ou derme, respectivamente, no disruptor de tecido, adicionando 1,5 ml de solução salina por a desagregação.
   4. execute diferentetempos de desagregação para todas as amostras de tecido, tal como indicado na Tabela 1.
   5. Usar um número correspondente de biópsias derivados a partir de amostras de tecidos intactos como controlos.
   6. Após a desagregação mecânica, aspirar a solução salina contendo micro-enxertos e lugar separadamente cada uma das amostras num único poço de uma placa de 12 poços. Execute o mesmo protocolo para biópsias de controle intacto.
   7. Adicionar 1 ml de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e antibióticos para cada amostra.
   8. Avaliar a viabilidade celular imediatamente. A cada poço contendo um micro-enxerto (obtido pela desagregação simultânea de oito, três ou quatro amostras uniformes de tecido da pele, Ded ou derme, respectivamente) adicionar 1 ml de meio contendo 0,5 mg / ml de MTT (brometo de 3- [4,5- dimetiltiazol-2-il] brometo) -2,5 difeniltetrazólio solução e incubar durante 3 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO ₂ / ar. Execute o mesmo protocolo para controle intactasoco biópsias.
   9. Após a incubação, MTT remover todo o meio contendo e adicionar a cada amostra de 1 ml de dimetil sulfóxido (DMSO) durante 10 min.
   10. Transferir cada amostra e DMSO numa cuvete e lida a densidade óptica (DO) a 570 nm utilizando um espectrofotómetro. Calcular a viabilidade celular como a razão entre a absorvância a 570 nm e o peso em gramas (gr) de tecido utilizados antes desagregação. Execute o mesmo protocolo para biópsias de controle intacto.
2. Após a desagregação mecânica, aspirar a solução salina contendo micro-enxerto derivadas de tecido da pele, as amostras Ded e derme de um único doador.
   1. Coloque separadamente cada amostra num único poço de uma placa de 12 poços ou em um frasco de cultura para o ensaio de viabilidade celular e análise morfológica respectivamente.
   2. Cultura micro-enxertos adição de 1 ml (placa de 12 poços) ou 5 ml (frasco de cultura) de meio RPMI 1640 suplementado com FBS 10% e antibióticos, a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO ₂ / air durante 24 horas ou 7 dias.
   3. Avaliar a viabilidade celular após 24 horas ou 7 dias (repita os passos 2.1.8-2.1.10).
   4. Realizar a análise morfológica avaliar a presença de suspensão de células por microscopia de luz depois de 24 h e 7 dias de cultura em frasco.
   5. Analisar as amostras de Derme para a positividade ao mesenquimais e marcadores de células hematopoiéticas, incluindo CD146, CD34 e CD45 antígenos por análise FACS ^6.
   6. Sob fluxo laminar semente capa cada micro-enxerto (obtido pela desagregação simultânea de oito, três ou quatro amostras uniformes de tecido da pele, Ded ou derme, respectivamente) e um pequeno fragmento correspondente de cada amostra de tecido não totalmente desagregado (> 50 mícron em tamanho após o processo de desagregação) na placa de agar de Columbia contendo 5% de caldo de sangue de carneiro a 100 ul.
   7. Incubar a placa a 37 ° C durante três dias e executar análise microbiológica em placa de agar Columbia, a fim de avaliar a esterilidade ¹¹.

Resultados

Neste estudo preliminar, o primeiro objetivo foi investigar a capacidade de micro-enxertos autólogos humanos, combinado com um suporte biológico, como o colágeno, para produzir bio-complexos prontos para usar. Estes bio-complexos foram implantadas num doente com uma perna lesão causada por um acidente de carro (Figura 2A) e uma re-epitelização completa associado com a reparação de tecidos após 30 dias (Figura 2B)

Discussão

Este estudo preliminar demonstrou que as micro-enxertos obtidos por este protocolo pode ser combinada com as esponjas de colagénio, como já foi relatado em outras aplicações clínicas, para optimizar a eficácia de micro-implantes de enxertos ^{9, 10.} Em particular, este estudo relatou a capacidade de bio em complexos, constituído por micro-enxertos e esponjas de colágeno, para adjuvante da cicatrização de uma lesão na perna após 30 dias de aplicação clínica. Além disso, in vitro resultad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Human Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI medium	PBI International	733-2292
DMEM medium	PBI International	F 0415
Antibiotics	Biological Industries PBI	03-038-1
Antibodies for FACS Analysis	eBiosciences	code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		collagen sponge used for bio-complexes
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene	Carlo Erba