تقييم المغزل الانتصافي في ماوس البويضات التي كتبها بوساطة سيرنا إسكات

Summary

هنا، نقدم بروتوكول معين استنزاف مرنا بوساطة سيرنا تليها التحليل المناعي لتقييم الجمعية المغزل الانتصافي والتنظيم في البويضات الماوس. هذا البروتوكول هو مناسبة لفي المختبر استنزاف النصوص والتقييم الوظيفي للمغزل مختلفة و / أو عوامل المرتبطة MTOC في البويضات.

Abstract

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down’s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Introduction

الانقسام الاختزالي هو عملية تقسيم الفريدة التي تحدث في الأمشاج (البويضات والحيوانات المنوية) وينطوي على قسمين متتالية دون التدخل تخليق DNA لفصل الكروموزومات المتماثلة والصبغيات الشقيقة خلال الانقسام الاختزالي-I والانقسام الاختزالي الثاني على التوالي ^1. أخطاء في كروموسوم العزل خلال الميتوزي في البويضات يمكن أن يؤدي إلى عدم توازن الصبغيات، وهي التي ورثها الجنين أثناء الإخصاب. ومن الجدير بالذكر أن حدوث عدم توازن الصبغيات في الأجنة النامية يزيد مع تقدم عمر الأم وسبب رئيسي من العيوب الخلقية، فضلا عن فقدان الحمل في النساء ^1،2، وبالتالي، مما يؤكد حاجة مهمة لفهم الأساس الجزيئي لعدم توازن الصبغيات أثناء الانقسام الانتصافي .

أثناء انقسام الخلية، الصبغي الفصل يعتمد بشكل حاسم على تجميع جهاز أنيبيب المغزل وإنشاء مستقرة التفاعلات كروموسوم أنيبيب لمرفق الصحيح لالمغزل المعاكسالقطبين. الأهم من ذلك، تشكيل المغزل الانتصافي في البويضات الثدييات يختلف من الانقسام في الخلايا الجسمية، وتنظمه مراكز تنظيم أنيبيب فريدة من نوعها (MTOCs) التي تفتقر centrioles ^3،4. البروتينات الضرورية اللازمة لالتنوي أنيبيب وتنظيم توطين لMTOCs البويضة، بما في ذلك γ تويولين أن يحفز التجمع أنيبيب. بالإضافة إلى ذلك، pericentrin الوظائف باعتبارها بروتين السقالات الضروري، الذي يربط والمراسي γ تويولين فضلا عن عوامل أخرى في MTOCs ^5. والجدير بالذكر أن تظهر دراستنا أن استنزاف من البروتينات الرئيسية MTOC المرتبطة يعطل منظمة المغزل الانتصافي ويؤدي إلى أخطاء كروموسوم الفصل في البويضات التي لم يتم حلها بشكل كامل من قبل حاجز الجمعية المغزل (SAC) ^6،7. ولذلك، عيوب في الاستقرار المغزل، التي لا تؤدي إلى اعتقال الانتصافي، تشكل خطرا كبيرا في المساهمة في عدم توازن الصبغيات. وعلى الرغم من دورها الأساسي في التجمع المغزل والتنظيم، بروت البويضة MTOCتكوين عين وظيفة تزال غير مفهومة تماما.

اختبار وظيفة البروتينات المستهدفة المحددة في البويضات الثدييات هي صعبة، إذ تصبح الخلايا هادئة transcriptionally قبل استئناف الانقسام الاختزالي ^8،9 قريبا. وبالتالي، البويضات ما قبل التبويض تعتمد على مخازن مرنا الأمهات لاستئناف الانقسام الاختزالي ودعم الميتوزي فضلا عن الانقسامات انشقاق الأولى بعد الإخصاب ^10،11. وراسخة فعالية تدخل الحمض النووي الريبي (رني) تدهور بوساطة من النصوص مرنا في البويضات الثدييات والرنا الأمهات تجنيدهم للترجمة خلال نضوج الانتصافي قابلة بشكل خاص لسيرنا استهداف ^12-14. ولذلك، Microinjection من الرنا التدخل قصيرة (الرناوات siRNAs) إلى البويضات يوفر نهجا قيما لتستنزف من mRNAs المستهدفة للاختبار وظيفي.

هنا، نحن تصف طرق لعزل البويضات الماوس واستنزاف بوساطة سيرنا من transcri محددةنقطة لاختبار وظيفة البروتين الضروري MTOC المصاحب، pericentrin. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف الظروف التحليل المناعي لتقييم تكوين المغزل الانتصافي في البويضات.

Protocol

وقد وافق هذا البروتوكول من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة جورجيا.

1. الاستعدادات

1. للثقافة بويضة أو شراء أو طازجة إعداد الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) وتكملة مع 3 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) كما هو مبين في الجدول رقم 1 ضع زجاجة البوليسترين على التوازن تحميل (الفارغة إلى الصفر). إضافة كافة الكواشف، إلا BSA، في النظام وإظهار الحجم النهائي مع MQ-المياه وزنا إلى ما مجموعه 250 غرام. قم بإضافة BSA، تسمح بحل وتصفية تعقيم.
   ملاحظة: MEM المتوسطة وصفها يتطلب موازنة وحضانة خلية تحتوي على خليط الغازات الطبية من 5٪ CO _2، 5٪ O ₂ و 90٪ N _2. لكن وسائل إعلام أخرى (على سبيل المثال، CZB) يمكن استخدامها التي تسمح للحضانة خلية في 5٪ CO _{2 تحت} الظروف الجوية.
2. لالبويضة microinjection، شراء أو تحضير M2 المتوسطة.
3. تحضير صفرس النهج السائد في المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) إلى تركيز 5 وحدة دولية / 100 ميكرولتر.
4. شراء وإعادة الأسهم سيرنا إلى تركيز العمل من 1 ميكرومتر.

2. ماوس سيت مجموعة

1. DAY 1: لتحفيز التنمية جراب المبيض وزيادة عدد بصيلات ما قبل التبويض، وإدارة 5 وحدة دولية من PMSG البريتونى لإناث الفئران 48 ساعة قبل جمع البويضة.
2. DAY 3: لجمع البويضة والثقافة، وإعداد أطباق ثقافة 35 ملم مع 3 مل من MEM / BSA تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل ميلرينون. يحافظ هذا المانع phosphodiesterase البويضات في الطور الأول-I اعتقال ويمنع انهيار حويصلة جرثومي (GVBD). تتوازن أطباق الثقافة في خليط الغازات الطبية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
   مطلوب ميلرينون وسائل الإعلام في جميع أنحاء تستكمل جمع البويضة، وكذلك البويضة microinjection و24 ساعة الانتظار ثقافة فترة ما بعد سيرنا: مذكرة.
3. استرداد المبيضين من إناث الفئران باستخدام مختبر أنشئت يمارس ¹⁵ ونقل إلى صحن الثقافة الجديد مع قبل حرارة ومعايرتها MEM / BSA / ميلرينون.
4. مكان الطبق الثقافة في مرحلة من مراحل stereomicroscope لجمع البويضة. الإفراج الركامية-بويضة المجمعات (COC ل) من خلال ثقب الجريبات الغارية مع 27 الإبر G يدويا. إصلاح مبيض واحد إلى أسفل الطبق الثقافة، مع إبرة 27 G تعلق على حقنة 1 مل، واستخدام إبرة الثانية لثقب جميع المسام الكبيرة. كرر لكل المبيض.
5. باستخدام إجراءات الفم pipetting لالقياسية أو غيرها من وسائل تطلع البويضة، وجمع كل البويضات التي تحيط بها 2 أو أكثر من طبقات من الخلايا الركامية المدمجة. نقل وCOC إلى طبق جديد واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
6. بعناية إزالة الخلايا الركامية المحيطة المتكررة pipetting لطيف مع ماصة 1 مل تعيينها إلى حجم الطموح من 750 ميكرولتر. كرر الخطوة pipetting لحوالي 12 مرةوالسماح للبويضات لاسترداد لمدة 5 دقائق. تستمر بهذه الطريقة حتى كل أو قد أزيلت معظم الخلايا الركامية. نقل البويضات الجرداء إلى صحن ثقافة أخرى والسماح للتوازن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
7. تخصيص البويضات الجرداء إلى ثلاث مجموعات تجريبية لاستخدامها في: (ط) Microinjection من الرناوات siRNAs محددة مقابل هدف الفائدة، (ب) Microinjection من غير محددة (مراقبة) الرناوات siRNAs، و (ج) مجموعة غير حقن السيطرة لحساب شروط الثقافة.

3. سيت Microinjection

1. إعداد أطباق الثقافة مع 3 مل سائل الاعلام M2 تستكمل مع ميلرينون (1 ميكروغرام / مل) للبويضة microinjection. إعداد أطباق الثقافة التي تحتوي على MEM / BSA / ميلرينون لغسل والثقافة لاحقة من البويضات حقن.
   ملاحظة: M2 المتوسطة يحتوي HEPES العازلة ويتطلب قبل الاحترار عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تحت الظروف الجوية. يتطلب MEM ما قبل ارتفاع درجات الحرارة وموازنة باستخدام الغازات الطبية وصفهد أعلاه.
2. إعداد نظام microinjection. تحميل إبرة الحقن مع 5 ميكرولتر من 1 ميكرومتر حل سيرنا محددة. تأمين ماصة عقد وحقن إبرة لmicromanipulators النظام microinjection وانشاء وحدة حقن مع حجم والضغط معايرة.
3. وضع 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من M2 وسائل الإعلام في الداخل غطاء صحن الثقافة 3 سم وإضافة بويضة لإعداد والمواءمة بين نظام microinjection.
4. باستخدام بويضة كدليل، وضبط مواقف القابضة وحقن الإبر. تطبيق الضغط السلبي على ماصة عقد لتأمين بلطف البويضة وضبط الموقف من إبرة الحقن على أوسع قطر للخلية. ضبط الإعدادات لتسمح Microinjection من حوالي 10 رر من الحل سيرنا في أي مكان في سيتوبلازم البويضة.
   
   تعيين الرقم 1. البويضة microinjection تصل. ( أ) صورة الممثل من 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من M2 وسائل الاعلام وضعت على غطاء من صحن الثقافة 3 سم، مع ماصة عقد وحقن الإبرة وضعه على اليسار واليمين، على التوالي. (B) مجموعة من الطور الأول-I اعتقال البويضات (GV-المرحلة) قبل microinjection. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
   
5. العودة غطاء لمرحلة stereomicroscope وإضافة 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من وسائل الاعلام M2 الطازجة. إضافة مجموعة من البويضات (~ 10) إلى الانخفاض الجزئي من قبل pipetting الفم، أو الطرق البديلة، ثم يعود الغطاء مع انخفاض الصغير إلى مرحلة microinjection.
   1. انتقل إلى microinject البويضات الفردية. تأمين بويضة واحدة مع ماصة عقد، تضاف ببطء غيض من إبرة الحقن في السيتوبلازم وطرد حجم الحقن من حل سيرنا. سحب بعناية إبرة الحقن ومولقد البويضة المحقونة إلى موضع في الجزء السفلي من الهبوط الجزئي. نقل البويضات حقن دون جدوى لوضع في الجزء العلوي من الانخفاض الجزئي.
   2. كرر الإجراء microinjection مع كل بويضة. للحفاظ على أفضل قابلية البويضة، microinject سوى عدد قليل من البويضات في كل مرة. تأكد من أن هذه العملية لا تستغرق أكثر من بضع دقائق لمنع درجة الحرارة ودرجة الحموضة التغييرات في الانخفاض الجزئي.
6. نضح حقن بنجاح البويضات أو نقل بعناية غطاء مع انخفاض الصغير من البويضات حقن لstereomicroscope. نقل البويضات القابلة للحياة حقن من قبل pipetting الفم أو طرق بديلة، إلى ذاكرة / BSA / ميلرينون المتوسطة لغسل وتتوازن عند 37 درجة مئوية.
7. باستخدام مجموعة أخرى من البويضات، كرر العملية microinjection مع إبرة حقن جديدة محملة الرناوات siRNAs غير محددة لمجموعة المراقبة. غسل البويضات في MEM / BSA / ميلرينون ونقل إلى صحن الثقافة منفصل.
8. ثقافة جميع فئاتالبويضات لمدة 24 ساعة في MEM / BSA / ميلرينون عند 37 درجة مئوية تحت جو من الغاز الطبي.
   ملاحظة: مطلوب "كتلة ميلرينون" فترة ثقافة للهدف كفاءة نضوب مرنا / البروتين.

4. سيت الثقافة للنضوج الانتصافي

1. DAY 4: لكل المجموعة التجريبية البويضات انشاء 4 أطباق الثقافة (35 ملم) مع 3 مل MEM / BSA. تكملة طبق وسائل الإعلام واحد لكل مجموعة مع 10٪ (جودة عالية) مصل بقري جنيني (FBS) لاستخدامه في نضوج البويضة. السماح لجميع الأطباق الثقافة لكي تتوازن عند 37 درجة مئوية مع خليط الغازات الطبية.
2. إطلاق سراح البويضات من "كتلة ميلرينون، بالتتابع غسل البويضات ثلاث مرات في الأطباق التي تحتوي على MEM / BSA ومن ثم نقل البويضات إلى الطبق النضج تحتوي على وسائل الإعلام مع 10٪ FBS. ثقافة جميع الفئات البويضة لمدة 17 ساعة على 37 درجة مئوية، لتمكين استئناف وتطور الانقسام الاختزالي.
3. DAY 5: إعداد الحلول لبويضة fixaنشوئها، بما في ذلك: (ط) بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في المخزن بيم (100 أنابيب ملي [الرقم الهيدروجيني 6،9]، 1 ملم MgCl _2، 1 ملم EGTA) مع 0.5٪ تريتون-X 100، و (ثانيا) تستكمل برنامج تلفزيوني مع 5 FBS٪ التي سيتم استخدامها لغسل ومنع البويضات.
   ملاحظة: تتطلب هذه الحلول الاحترار مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل البويضة التثبيت.
4. لتثبيت البويضة (بعد ثقافة 17 ساعة)، بسرعة نقل كل مجموعة التجريبية من البويضات قبل pipetting الفم أو الأساليب البديلة في الآبار الفردية (طبق 4 جيدا) التي تحتوي على 750 ميكرولتر من قبل حرارة 4٪ PFA حل واحتضان عند 37 ° C لمدة 1 ساعة. بعد ذلك يغسل كل مجموعة من البويضات 3 مرات (15 دقيقة لكل منهما) في 750 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل تحسنت تحتوي على 5٪ FBS.
5. البويضات كتلة في 200 ميكرولتر PBS / 5٪ FBS O / N عند 4 درجات مئوية للحد من الأجسام المضادة غير محددة ملزمة.

5. تحليل المناعي

1. DAY 6:
   يتم المناعية في لوحة متعددة جيدا وشركة النفط العمانية: مذكرةيتم نقل ytes متسلسل إلى الآبار متتابعة، التي تحتوي على حلول الأجسام المضادة وغسل منها. إما 48 أو 96-جيدا لوحات يمكن استخدامها، ببساطة ضبط حجم حل يقوم على حجم جيد. لوحات 96-جيدا استخدام 200 ميكرولتر لكل بئر. يتم نقل البويضات إلى حلول مختلفة في الترتيب التالي: حل الأجسام المضادة الأولية - 3 آبار غسل - حل الضد الثانوية - 3 آبار غسل. للحد من التعرض للضوء لوحة يمكن تغطيتها بورق.
   إعداد الطازجة PBS / 5٪ FBS واستخدام هذا الحل لإعداد التخفيفات الأجسام المضادة (مثل أرنب المضادة للpericentrin (1/1000)، والماوس مكافحة تويولين (1/1000)).
2. نقل البويضات ثابتة من كل مجموعة التجريبية لالآبار الفردية التي تحتوي على 200 ميكرولتر (أو 100 ميكرولتر، إذا كانت هناك رغبة أقل حدة التخزين) من حل الأجسام المضادة الأولية وتغطية البئر مع parafilm. احتضان وفقا لشروط محددة الضد الأمثل (على سبيل المثال، 37 ° C لمدة 1 ساعة أو 4 درجات CO / N).
   ملاحظة: dilutio الأجسام المضادة الأوليةن وكذلك فترة حضانة معينة ودرجة الحرارة يتطلب اختبار لتحديد الظروف المثلى لالأجسام المضادة المختلفة المستخدمة.
3. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، وغسل البويضات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني / 5٪ FBS (10-15 دقيقة لكل منهما).
4. نقل البويضات في محلول يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية fluorescently مترافق (على سبيل المثال، 1/1000 تخفيف المضادة للأرنب ومكافحة فأر الأجسام المضادة مترافق مع fluorochromes من أطوال موجية مختلفة). احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
5. غسل البويضات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني / 5٪ FBS (10-15 دقيقة لكل منهما).
6. بعد الخطوة غسل النهائي، ونقل البويضات على شريحة زجاجية نظيفة بلطف ونضح أي حل غسل الزائد. وهذا لشل حركة البويضات على سطح الزجاج. إضافة 8 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام (التي تحتوي على دابي) وتراكب بعناية وسائل الإعلام المتصاعدة مع 22 مم × 22 مم زلة تغطية. خفض ساترة ببطء لتجنب احتباس فقاعات الهواء و / أو إتلاف البويضات.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، للحفاظ على الممتلكات 3-dimentional من بويضة للتحليل المجهري متحد البؤر، إضافة كمية صغيرة من 100 الخرز الزجاجي ميكرون (مختلطة مع الفازلين) إلى زوايا من انزلاق الغطاء قبل تصاعد على الشريحة.
7. متجر الشرائح في 4 درجات مئوية، أو الشروع في تقييم التقدم الانتصافي وكذلك تحليل مستويات التعبير والتحت خلوية البروتين توطين باستخدام المجهر مضان مجهزة مرشحات اللازمة لتتناسب مع الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة.

النتائج

يوفر Microinjection من الرناوات siRNAs نهج فعال لتدهور مرنا واستنزاف البروتين لاحق في البويضات، والتي تمكن الاختبارات الوظيفية بكفاءة ومحددة للغاية من العوامل المستهدفة المختلفة في المختبر. بعد ذلك، يتم استخدام المناعي للتحليل النمط الظاهري محدد وكذلك للتحقق من صحة اس?...

Discussion

في حين أن هناك أساليب متعددة لنقل خارجي حامض النووي في الخلايا الجسدية، مثل Electroporation للوترنسفكأيشن، microinjection هو الأسلوب الأمثل للتسليم من جزيئات الحمض النووي الريبي في البويضات الماوس هادئة transcriptionally. وينص البروتوكول الحالي نهج فعال لفي المختبر استنزاف من mRNAs م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG)	EMD Biosciences	367222
Minimal Essential Medium (MEM)			*Recipe outlined in Table 1
Earle's Balanced Salt Solution (10x)	Sigma	E-7510
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761
Pyruvic Acid, sodium salt	Sigma	P-5280
Penicillin G, potassium salt	Sigma	P-7794
Streptomycin Sulfate	Sigma	S-9137
L-Glutamine	Sigma	G-8540
EDTA, disodium salt dihydrate	Sigma	E-4884
Essential Amino Acids (50x)	Gibco	11130-051
MEM Vitamin Mixture (100x)	Sigma	M-6895
Phenol Red solution	Sigma	P-0290
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
Milrinone	Sigma	M4659
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.01
EmbryoMax M2 Media with Hepes	EMD Millipore	MR-015-D
siRNAs targeting Pericentrin	Qiagen	GS18541
Negative control siRNAs	Qiagen	SI03650318
Paraformaldehyde (16% solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton-X	Sigma	T-8787
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Hyclone	SH30028.02
Anti-Pericentrin (rabbit)	Covance	PRB-432C
Anti-acetylated a-tubulin (mouse)	Sigma	T-6793
Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21430
Goat anti -mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-11017
Major Equipment
Stereomicroscope (SMZ 800)	Nikon
Upright Fluorescent Microscope	Leica Microsystems
Inverted Microscope	Nikon
Femtojet Micro-injections System	Eppenforf
Micro manipulators	Eppendorf
Micro-injection needles (femtotips)	Eppendorf	930000035
Holding pipettes (VacuTip)	Eppendorf	930001015
Plasticware
35 mm culture dishes	Corning Life Sciences	351008
4-well plates	Thermo Scientific	176740
96 well plates	Corning Life Sciences	3367
0.45 mm CA Filter System	Corning Life Sciences	430768