العزلة وثقافة Neurospheres المستمدة الدماغ الكبار الزرد

Summary

هنا نقدم طريقة استنساخه لدراسة الخلايا العصبية الكبار باستخدام الفحص neurosphere المستمدة من الدماغ كله أو إما من الدماغ الانتهائي، سقفي أو المناطق المخيخ من الكبار الدماغ الزرد. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف الإجراء لمعالجة التعبير الجيني في neurospheres الزرد.

Abstract

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Introduction

تم التعرف على الثدييات الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في المختبر عن طريق قدرتها على النمو في الثقافات التعويم الحر كعناقيد تقسيم خلايا تسمى neurospheres ^1. في وجود عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل)، NSCs تنقسم إما بشكل متناظر لتوليد NSCs تجديد الذات، أو غير متماثلة لتوليد خليتين ابنة مختلفة، مثلا، بسبب التمييز خلية سلفية ومجلس الأمن القومي الرواية. لذا الثقافات Neurosphere هي خليط من الخلايا الجذعية / السلف العصبية والخلايا العصبية أكثر متباينة ^2-4 NSCs يمكن، مع ذلك، يمكن تمييزها عن غيرها من neurosphere الخلايا أنواع من قبل اثنين من خصائص محددة: لأنها تكشف المدى الطويل التجديد الذاتي في احلرية العائمة الثقافات وأنها يمكن أن تفرق في كل الأنساب الخلية العصبية (أي الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes) بعد الانسحاب من عوامل النمو والانضمام إلى ركائز المصفوفة خارج الخلية. في mammاعتلال الأعصاب الحركية، وكان نظام الثقافة neurosphere أول نظام في المختبر تستخدم للتدليل على وجود NSCs في الدماغ الكبار ويبقى أداة الأكثر استخداما لتحليل الانتشار، والقدرة على التجديد الذاتي وmultipotency الخلايا الجذعية والسلف العصبية. لذلك، على الرغم من المقايسات تشكيل المجال تعاني من بعض العيوب والقصور ^4، وهذا النظام الثقافة هو قيمة لتقييم احتمال وجود خلية لتتصرف كما الخلايا الجذعية عند إزالتها من في الجسم الحي المتخصصة ⁽⁴⁾ وقامت بدور فعال في تحديد الجهات التنظيمية الرئيسية مجلس الأمن القومي التجديد الذاتي ومصير خلية تقرير ^5-7.

وعلى النقيض من الثدييات الذين تقتصر تكوين الخلايا العصبية الكبار، الزرد إنتاج خلايا عصبية جديدة بشكل جوهري على طول محور الدماغ كاملة طوال حياتهم. يعرض الدماغ الزرد الكبار متعددة المنافذ العصبية إيواء الجذعية العصبية خلية / السلف جعل الزرد قوية نموذج حي لفهم روقال انه وقف نشاط الخلايا في الدماغ وكذلك برامج الجزيئية المطلوبة لتجديد الجهاز العصبي المركزي. على مدى السنوات ال 17 الماضية، وضعت عدة مجموعات بحثية منهجيات لعزل وزراعة الخلايا العصبية الزرد ^8،9. وتهدف هذه الدراسات إلى إنتاج الخلايا العصبية الجنينية والخلايا الدبقية في المختبر، ولكن ليس على الحفاظ على NSCs والتحقيق ممتلكاتهم. على الرغم من neurospheres تم توليدها في Apteronotus leptorhynchus الكبار (براون شبح Knifefish) ^10، بقي مقايسة تشكيل neurosphere في الزرد التي سيتم إنشاؤها.

نحن هنا وصف مقايسة تشكيل neurosphere للتدليل على دور مير-107 خلال تكوين الخلايا العصبية الزرد ^11. يتيح البروتوكول: 1) مجموعة من الخلايا الجذعية / السلف العصبية الكبار إما من الدماغ كله الزرد أو من عدة مناطق الدماغ تشريح مثل الدماغ الانتهائي، والسقف، والمخيخ. 2) جيل من فلوريداoating وneurospheres تجديد الذات من الخلايا الجذعية / السلف العصبية الكبار. 3) لأسفل ويصل تنظيم التعبير عن الجينات الترميز أو الرنا غير الترميز الصغيرة ¹¹ في neurospheres، من أجل تحقيق دورهم في انتشار وتمايز الخلايا الجذعية / السلف العصبية.

Protocol

وأثيرت الزرد من سلالة WT ^CF والمحافظة وفقا لبروتوكولات التي وافق عليها المؤسسي جنة رعاية واستخدام الحيوان جامعة ييل (IACUC البروتوكول رقم 2012-11473). ينبغي أولا الموافقة على جميع التجارب التي كتبها كل الأخلاق الحكومية والمؤسسية ذات الصلة التي تنظم الهيئات بشأن استخدام الحيوانات لأغراض البحث.

1. التحضيرات

1. إعداد 10 مل من المتوسط ​​تشريح، إضافة 200 ميكرولتر من 100X البنسلين، الستربتوميسين إلى 9.8 مل من DMEM / F12.
2. يعد حل-L السيستين: 10 مل من الماء لزراعة الأنسجة، وإضافة 120 ملغ من L-السيستين. تخزين حل L السيستين في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع، أو في aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
3. إعداد الدناز أنا الحل: 1 مل من الماء لزراعة الأنسجة، وإضافة 10 ملغ من الدناز أولا مخزن الدناز أنا الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
4. يعد حل غراء: لإعداد غراء solutأيون، إضافة 100 ميكرولتر غراء (ما يقرب من 140 وحدة)، و 100 ميكرولتر الدناز الأول (1٪) و 200 ميكرولتر L-السيستين (12 ملغ / مل) في 5 مل من DMEM / F12. حديثا تحضير محلول غراء في كل مرة وتعقيم مع 0.22 ميكرون حجم المسام مرشح قبل الاستخدام.
5. يعد حل الغسيل: لتحضير 100 مل من محلول الغسيل، إضافة 650 ميكرولتر الجلوكوز 45٪، 500 ميكرولتر HEPES 1 م و 5 مل FBS إلى 93.85 مل DPBS 1X. تعقيم الحل غسل 0.22 ميكرون حجم المسام مرشح قبل الاستخدام. تخزين حل غسل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
6. يعد حل الأنسولين: لإعداد 2 مل من محلول الأنسولين، إضافة قطرة 25 ميكرولتر من 10 N هيدروكسيد الصوديوم و 100 الأنسولين ملغ في 2 مل من الماء لزراعة الأنسجة.
7. إعداد الحلول EGF وجمعية جيل المستقبل: حل كلا mitogens في DMEM / F12 على 100 ميكروغرام تركيز / مل. تخزين تصل إلى 10 مكل في -20 درجة مئوية.
8. إعداد وسائل الاعلام B-27 و N-2: متجر B-27 و N-2 المكملات الغذائية في -20 درجة مئوية إلى 500 ميكرولتر و 1 مل قسامات، respectivاعل.
9. إعداد Z-التمايز حالة متوسطة: لتحضير 100 مل من Z-التمايز حالة متوسطة، إضافة 40 ميكرولتر الأنسولين (50 ملغ / مل)، 500 ميكرولتر B-27، 1 مل N-2، 650 ميكرولتر الجلوكوز 45٪ و 1 مل من 100 × البنسلين، الستربتوميسين إلى 97.81 مل من DMEM / F12. تعقيم حالة متوسطة Z-التمايز مع 0.22 ميكرون حجم المسام مرشح قبل الاستخدام. تخزين المتوسطة حالة Z-التمايز في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
10. إعداد Z-حالة متوسطة: لإعداد 50 مل من وسائل الاعلام Z-حالة، إضافة 10 ميكرولتر من EGF و 10 ميكرولتر من جمعية جيل المستقبل إلى 50 مل من معقم المتوسطة حالة Z-التمايز (20 نانوغرام / مل). تخزين متوسطة Z-حالة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
11. يعد حل طلاء للثقافة التمايز: لمدة 5 مل خارج الخلية حل طلاء، إضافة 100 ميكرولتر من حل المصفوفة خارج الخلية إلى 4.9 مل من DMEM / F12 (على سبيل المثال، Matrigel). ذوبان حل المصفوفة خارج الخلية في 4 درجات مئوية على الجليد. مرة واحدة تفقد تجميدها، والحفاظ على 4 درجات مئوية لمدة شص إلى 2 أسابيع.

2. تشريح الدماغ الكبار الزرد

1. إعداد تشريح سرير عن طريق ملء 100 ملم × 15 ملم طبق بيتري مع حزم هلام الجليد. ثم وضع غطاء على طبق بتري واحتضان عند -20 درجة مئوية حتى تجميد هلام. على أعلى من مكان غطاء مربع من ورق الترشيح نظيفة والتفاف على حد سواء ورقة الترشيح وطبق بتري مع فيلم من البلاستيك.
2. نظيفة وتعقيم جميع الأدوات تسليخ مجهري بنسبة 70٪ من الإيثانول أو الحرارة قبل كل استعمال. وضع جميع الأدوات تشريح تعقيمها قرب المجهر تشريح، والحق قبل القتل الرحيم، وضع السرير تشريح تحت المجهر مع إضاءة الألياف البصرية.
3. جمع 2 الزرد الكبار لإعداد neurosphere الدماغ كله. و3-4 الزرد لتوليد neurospheres من مناطق الدماغ تشريح.
4. الموت ببطء الزرد الكبار (8-12 شهرا) باستخدام بروتوكول افقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي. بعد ذلك، تزج الأسماك في 75٪ من الإيثانول لمدة 5-10 ثانية وبسرعة وضع في السرير تشريح تليها قطع الرأس على مستوى الخياشيم باستخدام شفرة جراحية.
   1. إلى الموت ببطء الحيوانات، إدارة جرعة زائدة (300 ملغم / لتر) من methanesulfonate تريكين حتى يبطئ ضربات القلب الحيوان تدريجيا وتوقف الدورة الدموية، ثم تزج في الماء المثلج.
5. تحويل رئيس الجانب الظهري أسفل، وباستخدام مقص جعل قطع طولية من الجانب قطع في الفم. باستخدام ملقط فضح قاعدة الجمجمة، وإزالة جميع الأنسجة المجاورة. قطع الجدران الجانبية من الجمجمة من بداية الحبل الشوكي نحو السقف.
6. باستخدام مقص، وقطع وإزالة الأعصاب البصرية ثم قم بإزالة جانبي الجزء الأكثر الوحشي من الجمجمة في مستوى السقف. بدوره رئيس بطني حتى الجانب. باستخدام الملقط، تقشر بقية الجزء الأكبر قمية من الجمجمة.
7. نقل الدماغ جنبا إلى جنب مع الجزء المتبقي من الجمجمة إلى واي طبق جديدث المتوسطة تشريح (1.1). تنظيف أنسجة المخ في المتوسط ​​تشريح باستخدام مقبض من البلاستيك السكين الصغير، والحفاظ على جميع الهياكل الدماغ سليمة.
8. من هذه النقطة، مواصلة بروتوكول استخدام الدماغ الزرد كله.
   1. بدلا من التكيف مع هذا البروتوكول إلى مناطق محددة في الدماغ لتوليد neurospheres من الدماغ الزرد كله أو من الدماغ الانتهائي، السقف / الدماغ البيني أو المخيخ تشريح مع مشرط جديد. استخدام خط الفلورسنت معين العصبي الزرد العصبي المعدلة وراثيا لتشريح المنطقة الدماغ فيها وفقا تهم الشكل 3 ومرجع ^11.

3. التفكك خلية واحدة من الدماغ الكبار

1. أداء جميع الأعمال اللاحقة في خزانة السلامة البيولوجية. نقل أنسجة المخ في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 800 ميكرولتر من المتوسطة تشريح (المعد في الخطوة 1.1). إزالة المتوسطة تشريح من قبل pipetting، دون لمس أنسجة المخ.
2. إضافة 500 ميكرولتر من محلول غراء (الخطوة 1.4) وهضم أنسجة المخ عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. لا احتضان أطول من 15 دقيقة لأنها يمكن أن تقلل بقاء الخلية.
3. بعد مرور فترة الحضانة، ونقل أنسجة المخ مع 500 ميكرولتر من محلول غراء في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل باستخدام 1000 ميكرولتر قطع طرف الماصة في ~ 0.25 بوصة من أسفل. فصل بلطف أنسجة المخ من قبل pipetting ببطء صعودا وهبوطا 10 مرات مع نفس الطرف. لا الماصة صعودا وهبوطا أكثر من 15 مرة ولا تولد فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة، لأنه يمكن أن يغير بقاء الخلية.
4. احتضان أنسجة المخ مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تليها pipetting صعودا وهبوطا 10-13 مرة باستخدام 1000 ميكرولتر طرف المنتظم تقطيعه. لا الماصة صعودا وهبوطا أكثر من 15 مرة، لتجنب موت الخلايا.
5. وقف عملية الهضم الأنزيمي بإضافة 2 مل من غسل الحل (الخطوة 1.5)، وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 800 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). صب بعناية لياليupernatant و resuspend بيليه في حل ما تبقى من خلال الاستفادة من أنبوب بقوة مع إصبع ومن ثم من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع 1000 ميكرولتر طرف منتظم. المقبل، إضافة 2 مل من محلول الغسيل.
6. في هذه المرحلة، والتحقق من تحت المجهر الذي تم الحصول على تعليق خلية واحدة. الطرد المركزي تعليق الخلية مرة أخرى في 800 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه باستخدام 1 مل من جديد متوسطة Z-حالة (الخطوة 1.10).
7. خلايا صمة عار باستخدام التريبان الأزرق ¹² و عد الخلايا الحية باستخدام عدادة الكريات من خلال استبعاد الخلايا الميتة الزرقاء. إعداد 24 لوحة جيدا مع 200 ميكرولتر من تعليق خلية و 300 ميكرولتر من Z-حالة جديدة المتوسطة في كل بئر. خلايا البذور في مناطق ذات كثافة من ~ 500 خلية / ميكروليتر. الحفاظ على الخلايا المستزرعة في حاضنة عند 30 درجة مئوية في 5٪ CO _2، منذ neurospheres الزرد المستمدة من الدماغ لا تنمو جيدا عند 37 درجة مئوية.

4. توليد الابتدائية Neurospheres

1. بعد 1 يوم في المختبر (DiV1)، ومراقبة تعليق خلية واحدة تم الحصول عليها من الكبار الدماغ كله تحت المجهر ونلاحظ ما إذا كان قد تراكم الحطام في وسط البئر. بعناية إزالة أي حطام من قبل pipetting ما يقرب من 100 ميكرولتر من المتوسطة (أقل إن أمكن). التالي إضافة 100 ميكرولتر من Z-حالة جديدة المتوسطة. ينبغي مراعاة تعليق خلية واحدة في هذا الوقت (الشكل 2A DiV1).
2. بعد 2 أيام في المختبر (DIV2)، وتوسيع الخلايا المستزرعة. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع خفض الحافة، جمع ونقل 250 ميكرولتر من تعليق خلية من كل بئر إلى بئر جديدة. إضافة 250 ميكرولتر من Z-حالة جديدة المتوسطة في جميع الآبار. قبل توسيع الخلايا المستزرعة، التجانس تعليق بلطف شديد من قبل pipetting صعودا وهبوطا في جميع أنحاء البئر.
3. كرر الخطوات من 4.1 و 4.2 لمدة 4 أيام التالية في المختبر (DiV4). وينبغي أن تكون الزيادة التدريجية في حجم neurospheres السادسsible في المركز وحواف البئر في DiV3 وDiV4 (الشكل 2B و C).
   ملاحظة: neurospheres الأولية يمكن معالجة للمرور أو التمايز لتقييم multipotency. بدلا من ذلك، فإنها يمكن أن تتم معالجتها لnucleofection أو ليبو-ترنسفكأيشن ¹¹ لتوصيف دور جينات معينة خلال عملية التمايز.

5. الركض الابتدائية Neurospheres

1. إزالة 250 ميكرولتر من زراعة الأنسجة من كل بئر وميكانيكيا فصل neurospheres DiV4 مع ماصة 1 مل. لا الماصة صعودا وهبوطا بسرعة كبيرة كما تشكيل فقاعة الهواء قد زاد موت الخلايا.
2. عدد الخلايا مع عدادة الكريات وتوزيع 800 خلية / ميكرولتر في 250 ميكرولتر من طاف الثقافة الأساسي في كل بئر من 24 لوحة جيدا.
3. إضافة 250 ميكرولتر من Z-حالة المتوسطة إلى كل بئر.
4. بعد 2 أيام في المختبر (DIV2)، وتوسيع الخلايا المستزرعة كما ذكرت في الخطوة 4.2 لد 4.3.

6. تمايز الابتدائية Neurospheres

1. تعقيم النظارات غطاء عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، ثم غطاء الجافة النظارات في RT عن طريق وضعها في كل بئر من لوحة ال 12 أيضا.
2. إضافة 300 ميكرولتر من محلول طلاء خارج الخلية (الخطوة 1.11) في وسط غطاء زجاجي في مثل هذه الطريقة أنه يمكن توسيع نطاق واسع وتغطية الزجاج غطاء كامل. ثم، في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (باستخدام الخلايا ترطيب الثقافة الحاضنة).
3. إزالة حل طلاء خارج الخلية بعد الحضانة، وتجفيف الزجاج غطاء لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
4. إزالة 250 ميكرولتر من زراعة الأنسجة من كل جانب. ميكانيكيا فصل كل neurospheres الأساسي DiV4 لكل بئر مع ماصة 1 مل (مع تلميح نهاية أوسع) من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
5. فصل البذور تعليق خلية neurosphere في مناطق ذات كثافة خلية من 4 × 10 ³ خلية / مل على coverglasses المغلفة المصفوفة خارج الخلية معدة مسبقا (خطوة 6،1-6.3) والاحتفاظ لمدة 30 دقيقة على الأقل، عند 30 درجة مئوية في 5٪ CO _2، حتى تعلق على الركيزة. ثم، وإزالة مستنبت وإضافة بسرعة 1 مل من قبل حرارة جديدة Z-التمايز حالة المتوسطة (الخطوة 1.9) قبل زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة على 30 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
6. كل يومين، محل نصف حالة متوسطة Z-التمايز في زمن differentation الخلية.

7. التلاعب الجيني الابتدائية Neurospheres

1. جمع DiV3-4 neurospheres الأساسي (الخطوة 4.3) بواسطة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق عند 80 ز س في 4 درجات مئوية. الاستعداد لترنسفكأيشن الحويصلية من oligonucleoatides التجارية وصفها بأنها previouly ¹¹ أو نواة ترنسفكأيشن ناقلات البلازميد.
2. بيليه resuspend neurosphere في مناطق ذات كثافة خلية من 4 × 10 ³ خلية / ميكرولتر في 100 ميكرولتر من خليط التفاعل (82 ميكرولتر حل nucleofactor و 18 ميكرولتر من الملحق).
3. مزيج من أنظمة التعليق neurosphereعلى مع 5 ميكرولتر من ناقلات البلازميد من خيار (الأسهم البلازميد في 1 ميكروغرام / ميكرولتر). نقل الخليط neurosphere / الحمض النووي في كفيت nucleofector لnucleotransfection وحدد nucleofector البرنامج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة التي قدمتها عدة nucleofector.
4. مباشرة بعد nucleofection، إضافة حجم 500 مل من قبل تحسنت وسائل الإعلام Z-حالة (1.10) إلى الخلايا ولوحة للneurospheres transfected لدراسة تجديد الخلايا و / أو خصائص التمايز، كما هو موضح أعلاه.

النتائج

مخطط العام للاسماك الزرد الكبار Neurosphere الثقافة

نحن هنا وصف جميع الخطوات من بروتوكول مقايسة تشكيل neurosphere تنفيذها من الكبار الدماغ الزرد. أولا، تم جمع الخلايا الجذعية / السلف العصبية الكبار إ?...

Discussion

الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو عزل وثقافة الكبار neurospheres الزرد المستمدة من الدماغ لدراسة الخصائص الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية / السلف العصبية. هنا، ونحن التقرير كيفية اختيار الخلايا العصبية متعددة القدرات وتوليد أنواع الخلايا العصبية ثلاثة، أي الخلاي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS 1x	Life Technologies	14190-144
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C6852-25g
B-27	Life Technologies	17504-044
N-2	Life Technologies	17502-048	N-2 supplement (100x) liquid
HEPES	Life Technologies	15630	1 M
D-(+)-Glucose 45%	Sigma	G8769
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Insulin	Sigma	I5500-50 mg
DNAse	Sigma	DN25-10mg
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Matrigel	Becton Dickinson	356234
PFA	TCI	P0018
PBS	AmericanBio	AB11072-04000
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml.
Trycold gel	Sigma	TGP8	gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit	Lonza	VPI-1004
Trypan blue stain	Life Technologies	15250061