Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü

Özet

Burada tüm beyin veya telencephalic, tectal veya yetişkin zebrabalıkları beyin beyincik bölgelerinin türetilen bir neurosphere tahlili kullanılarak yetişkin nöron incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Ayrıca, zebrabalıkları neurospheres gen ifadesini işlemek için prosedürü açıklar.

Özet

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Giriş

Memeli nöral kök hücreler (NSC'lerde) Neurospheres ¹ olarak adlandırılan hücrelerin bölünmesi kümeleri gibi serbest bir kültürlerinde gelişme yetenekleri ile, in vitro olarak karakterize edilmiştir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) varlığında, NSC'lerde kendini yenileyen NSCs oluşturmak için ya da simetrik olarak bölmek veya asimetrik, iki farklı yavru hücrelere oluşturmak için, yani. Bir ayırıcı projenitör hücre ve yeni bir MGK. Neurosphere kültürler, bu nedenle nöral kök / progenitör hücrelerin ve daha fazla farklı sinir hücrelerinden ^2-4 bir karışımı olan NSC'lerde Ancak iki spesifik özellikleri ile, diğer neurosphere hücre tiplerinden ayırt edilebilir. Bunlar serbest uzun süreli kendini yenileme görüntüler kültürleri yüzen ve hücre dışı matriks substratlara büyüme faktörlerinin geri çekilmesi ve yapışma takiben tüm nöral hücre soyları (yani, nöronlar, astrositler ve oligodendrosit) içine ayırt edebilirsiniz. memeli konakçının içindeALS, neurosphere kültür sistemi, yetişkin beyinde NSC'lerde varlığını göstermek için kullanılan ilk tüp sistemi ve proliferasyonu, kendi kendini yenileme ve nöral kök ve projenitör hücrelerinin multipotency analiz etmek için en sık kullanılan araç. Bu nedenle, küre oluşturan deneyleri bazı dezavantajları ve sınırlamalar ⁴ muzdarip olsa da, bu kültür sistemi kendi in vivo niş ⁴ çıkarılır ve kilit düzenleyiciler belirlenmesinde etkili olmuştur zaman kök hücresi gibi davranmaya bir hücrenin potansiyelini değerlendirmek için değerlidir MGK kendini yenileme ve hücre kader tayini ^5-7.

yetişkin nörogenezi sınırlı memelilere aksine, Zebra balığı yapısal hayatları boyunca tüm beyin ekseni boyunca yeni nöronlar üretirler. Zebra balığı yetişkin beyin t anlamak için Zebra balığı güçlü bir model organizma yapma nöral kök / progenitör hücreler barındıran birden nörojenik nişler görüntülerHücrenin beyinde aktivitesi hem de merkezi sinir sistemi rejenerasyonu için gerekli olan moleküler programları kaynaklanıyor. Geçtiğimiz 17 yıl içinde, çeşitli araştırma grupları izole ve Zebra balığı sinir hücreleri ^8,9 kültürleme için yöntemler geliştirmiştir. Bu çalışmalar embriyonik nöronal ve in vitro glial hücreler üretmeyi amaçladığını, ancak NSCs korumak ve onların özelliklerini incelemeyi bulundu. Neurospheres yetişkin Apteronotus leptorhynchus (Brown hayalet Knifefish) ¹⁰ içinde olmasına rağmen, zebrabalıkları bir neurosphere oluşturucu deney kurulacak kalmıştır.

Burada zebrabalıkları nöron ¹¹ sırasında miR-107 rolünü göstermek için bir neurosphere oluşturan deneyi açıklar. protokol sağlar: 1) Zebra balığı bütün beyin ya da telencephalon, tektum ve beyincik gibi çeşitli disseke beyin bölgelerinden ya yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin toplanması; fl 2) nesiloating ve yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerden kendini sürekli yenileyen Neurospheres; 3) aşağı ve yukarı yönde regülasyonu kodlayan genlerin ya da küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar neurospheres ^11, ekspresyon için nöral kök / progenitör hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması rollerini araştırmak.

Protokol

WT ^CF suşu Zebra balığı Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC protokol numarası 2012-11473) tarafından onaylanan protokollere göre kaldırdı ve muhafaza edildi. Tüm deneyler ilk araştırma amaçlı hayvanların kullanımı ile ilgili organları düzenleyen ilgili tüm devlet ve kurumsal etik tarafından onaylanmış olmalıdır.

1. hazırlıklar

1. Diseksiyon ortamı 10 ml hazırlamak 200 ul 100x Penisilin-Streptomisin DMEM / F12 9.8 ml.
2. , Doku kültürü için 10 ml su ile L-sistein 120 mg ekleyin: L-sistein solüsyonu hazırlayın. 2 haftaya kadar 4 ° C 'de, L-sistein solüsyonu saklayın veya 1 yıla kadar -20 ° C' de parçalar halinde.
3. DNase I çözelti hazırlayın: doku kültürü için 1 ml su için, DNase I deposu 2 aya kadar, 4 ° C 'de DNase I çözeltisi 10 mg ekleyin.
4. Papain çözelti hazırlayın: Papain solut hazırlamakiyonu, DMEM / F12 5 ml 100 ul papain (yaklaşık 140 adet), 100 ul DNase I (% 1) ve 200 ul L-sistein (12 mg / ml) ekleyin. Taze papain çözüme her zaman hazırlamak ve kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ile sterilize edin.
5. Yıkama çözeltisi hazırlayın: yıkama çözeltisi 100 ml hazırlanması 93,85 mi DPBS 1x glikoz% 45, 500 uL, 1 M HEPES ve 5 ml FBS 650 ul ekleyin. Kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre içinden filtre yıkama çözeltisi sterilize edin. en fazla 2 ay için 4 ° C'de yıkama solüsyonu saklayın.
6. insülin çözeltisi hazırlayın: insülin çözeltisinin 2 ml hazırlamak için, doku kültürü için 2 ml su içinde, 10 N NaOH ve 100 mg insülin 25 ul damla ekleyin.
7. EGF ve FGF çözümleri hazırlayın: 100 ug / ml konsantrasyonda DMEM / F12 iki mitojenler eritin. -20 ° C'de 10 ul alikotları olarak saklanmalıdır.
8. B-27 ve K-2 ortamı hazırlayın: KAYIT B-27 ve K-2 takviyesi 500 ul -20 ° C ve 1 ml alikotlar, respectiv deely.
9. Z farklılaşma durumu orta hazırlayın: Z-farklılaşma durumu ortamı 100 ml hazırlayın 40 ul insülin (50 mg / ml), 500 ul B-27, 1 mL N-2, 650 ul glükoz 45 ve% 1 ml eklemek 100 x penisilin-streptomisin DMEM / F12 97,81 ml. Kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ile Z-farklılaşma durum orta sterilize edin. 1 hafta kadar 4 ° C 'de Z-farklılaşma durumu orta saklayın.
10. Z durumu orta hazırlayın: Z-durumu ortamı 50 ml hazırlayın EGF 10 ul steril Z farklılaşma durumu ortamı (20 ng / ml), 50 ml FGF 10 ul ekleyin. 1 hafta kadar 4 ° C 'de Z-ortamla saklayın.
11. Farklılaşma kültürü için kaplama çözeltisi hazırlayın: 5 ml dışı kaplama çözümü için, hücre dışı matriks solüsyonu 100 ul ekleyin DMEM / F12 4.9 ml (örneğin, Matrigel.). buz üzerinde 4 ° C'de çözülme hücre dışı matris çözeltisi. Bir kez çözüldü, U, 4 ° C 'de devam2 hafta s.

Yetişkin Zebra balığı Beyin 2. Diseksiyon

1. Jel buz paketleri ile 100 mm x 15 mm Petri kabı doldurarak yatağı bir diseksiyon hazırlayın. Daha sonra Petri kabı kapağı yerleştirmek ve jel donar kadar -20 ° C de inkübe edilir. Kapak yerin üstüne temiz filtre kağıdı kare filtre kağıdı ve plastik film ile petri hem sarın ve.
2. Temiz ve her kullanımdan önce% 70 etanol ya da ısı ile tüm mikrodiseksiyon aletleri sterilize. mikroskop yakınındaki bütün sterilize diseksiyon aletleri yerleştirin ve sağ ötenazi önce, fiber optik aydınlatma ile mikroskop altında diseksiyon yatak yerleştirin.
3. Bir tüm beyin neurosphere hazırlanması için 2 yetişkin zebrafish toplamak; ve 3 ila 4 zebra balığı parçalara beyin bölgelerinde Neurospheres oluşturmak için.
4. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol kullanılarak yetişkin zebrafish (8-12 aylık) euthanize. Sonraki 7, balık batırmak% 5, 5-10 saniye boyunca, etanol ve hızlı bir şekilde cerrahi bıçak kullanılarak solungaçları düzeyinde dekapitasyon diseksiyon yatakta yer.
   1. Hayvanın kalp atışı yavaş yavaş yavaşlatır ve dolaşımı durana kadar aşırı dozda tricaine metansülfonat (300 mg / L) yönetmek, hayvanlar euthanize, ardından buzlu suya batırın.
5. aşağı kafa dorsal yüzü çevirin, ve makas kullanılarak ağzına kesim tarafında uzunlamasına kesim yapmak. Forseps kullanarak kafatasının taban açığa ve tüm komşu doku kaldırmak. tektum yönelik omurilik başından kafatası yanal duvarların kesin.
6. makas kullanılarak, kesme ve optik sinirler kaldırmak ve daha sonra tektum seviyesinde kafatası en dış kısımda, her iki tarafı da çıkarın. Baş ventral yüzü yukarı çevirin. Kafatasının en üst kısmı geri kalanını soyulabilir, forseps kullanma.
7. Yeni bir tabak wi içine kafatası kalan kısmı ile beyin birlikte aktarındiseksiyon orta (1.1) th. bozulmamış tüm beyin yapılarını tutarak, mikro bıçağın plastik tutacağı kullanarak diseksiyon orta beyin dokusunu temizleyin.
8. Bu açıdan bakıldığında, bütün zebrabalıkları beyni kullanarak protokolü devam ediyor.
   1. Alternatif bütün zebrabalıkları beyin ya da taze neşter ile disseke telencephalon, tektum / diensefalon veya beyincik gelen neurospheres oluşturmak için spesifik beyin bölgelerinde için bu protokolü adapte. Şekil 3 ve ¹¹ referans faiz göre tanımlanan beyin bölgesini incelemek için bir nöral özel floresan Zebra balığı nöral transgenik satırını kullanın.

Yetişkin Beyin 3. Tek Hücre Ayrılma

1. Bir biyolojik güvenlik kabini sonraki tüm işlemlerini gerçekleştiriyoruz. diseksiyon orta 800 ul içeren bir 1.5 ml tüp içine beyin doku transferi (adım 1.1 hazırlanmış). Beyin dokusu dokunmadan, pipetleme diseksiyon orta çıkarın.
2. papain çözeltisi (adım 1.4) 500 ul ilave edin ve 10 dakika için 37 ° C 'de beyin dokusu sindirimi. hücre canlılığı azaltabilir olarak daha uzun 15 dakika inkübe etmeyin.
3. inkübasyondan sonra, alttan ~ 0.25 inç 1000 ul pipetlemeyin ucu kesilmiş kullanarak 15 ml konik tüp içine papain çözüm 500 ul ile beyin dokusuna aktarın. Yavaşça yavaşça aynı ucu ile yukarı ve aşağı 10 kez pipetleme beyin doku ayırmak. pipetlemeyin yukarı ve 15'den fazla kez aşağı ve hücre canlılığı değiştirebilir olarak, bu adımı sırasında hava kabarcıkları üretemeyen yok.
4. Bir kesilmemiş 1.000 ul düzenli ucunu kullanarak 10 yukarı pipetleme tarafından takip dakika ve aşağı 10-13 kez 37 ° C'de tekrar beyin dokusu kuluçkaya yatmaktadır. pipetlemeyin yukarı etmeyin ve en fazla 15 kat aşağı, hücre ölümünü önlemek için.
5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (RT) 800 xg yıkama çözeltisi (adım 1.5), ve santrifüj 2 ml hücre süspansiyonu eklenerek enzimatik sindirim durdurun. Dikkatle s decantupernatant ve 1000 ul düzenli ucu ile pipetleme ve aşağı şiddetle bir parmak ve sonra tüp dokunarak kalan çözelti içinde pelletini. Daha sonra, yıkama çözeltisi 2 ml ekleyin.
6. Bu aşamada, tek bir hücre süspansiyonu elde edilmiştir mikroskop altında bakın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g hızında tekrar hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatantı ve taze Z-ortamla (adım 1.10) 1 ml kullanarak pelet yeniden askıya.
7. Tripan mavisi ¹² ve kullanarak leke hücreler mavi ölü hücreleri hariç tutarak hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak. Hücre süspansiyonunun 200 ul ve her bir kuyu taze Z ortamla 300 ul, 24 oyuklu bir plaka hazırlanması. ~ 500 hücre / ml bir yoğunlukta tohum hücreleri. Zebra balığı, beyin-türevi Neurospheres 37 ° C'de iyi bir büyüme olmadığı,% 5 _CO2 içinde 30 ° C'de bir inkübatör içinde kültürlendi hücreleri korumak.

İlköğretim Neurospheres 4. Nesil

1. Nitro (div1) 'de 1 gün sonra, mikroskop altında yetişkin tüm beyin elde edilen tek bir hücre süspansiyonu gözlemlemek ve moloz de merkezinde biriken olup olmadığını not edin. Dikkatle orta yaklaşık 100 ul pipetleme herhangi bir enkaz kaldırmak (mümkünse daha az). Sonraki taze Z-ortamla 100 ul ekleyin. Tek hücre süspansiyonları, bu süre (Şekil 2A div1) de dikkat edilmelidir.
2. In vitro olarak 2 gün sonra (DIV2) sonra, kültürlenmiş hücreleri genişletmek. ucu kesilmiş 1.000 ul pipet kullanarak, toplamak ve iyi bir yeni her bir kuyudan hücre süspansiyonu 250 ul aktarın. Tüm kuyulara taze Z-ortamla 250 ul ekleyin. kültür hücreleri genişleyen önce, iyi boyunca yukarı pipetleme ve aşağı çok yavaşça süspansiyon homojenize.
3. Yineleyin in vitro aşağıdaki 4 gün (DiV4) için 4.1 ve 4.2 adımları tekrarlayın. neurospheres büyüklüğünde bir progresif artış vi olmalıdırDIV3 ve DiV4 (Şekil 2B ve C) merkezi ve iyi kenarlarında kişidir.
   Not: Primer Neurospheres geçit veya multipotency değerlendirmek farklılaşması için işlenebilir. Alternatif olarak, farklılaşma sürecinde belirli genlerin rolünü tanımlamak için nucleofection ya lipo transfeksiyon ¹¹ işlenebilir.

İlköğretim Neurospheres 5. Pasajlanması

1. Her kuyudan doku kültürü 250 ul çıkarın ve mekanik olarak 1 ml pipet DiV4 Neurospheres ayrıştırmaları. çok hızlı hava kabarcığı oluşumu hücre ölümünü artmış olabilir aşağı yukarı pipetlemeyin ve vermeyin.
2. Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve 24 oyuklu plakanın her oyuğuna primer kültür yüzey 250 ul 800 hücre / ul dağıtın.
3. her bir kuyunun Z-ortamla 250 ul ekleyin.
4. Aşama 4.2 belirtildiği gibi, in vitro olarak 2 gün sonra (DIV2) sonra, kültürlenmiş hücreleri genişletmekd 4.3.

İlköğretim Neurospheres 6. Farklılaşma

1. 10 dakika süre ile,% 70 etanol içine daldırma ile kaplama gözlük sterilize, 12 oyuklu plakanın her oyuğuna yerleştirerek oda sıcaklığında daha sonra kuru örtücü camlar.
2. yaygın genişletmek ve tüm cam kapak kapsayabilir şekilde kapak camın merkezde hücre dışı kaplama çözeltisi (aşama 1.11) 300 ul ekle. Daha sonra, (nemlendirilmiş hücre kültür inkübatörü kullanılarak), 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. İnkübasyondan sonra, hücre dışı Kaplama çözeltisini çıkarın ve 37 ° C'de 2 saat boyunca cam kapak kurutun.
4. Her kuyudan doku kültürü 250 ul çıkarın. Mekanik yukarı ve aşağı pipetleme tarafından (geniş uç ucu ile) 1 ml pipet ile kuyu başına tüm DiV4 birincil neurospheres ayırmak.
5. Tohum daha önce hazırlanmış hücre dışı matris ile kaplanmış coverglasses 4 x 10 ³ hücre / ml'lik bir hücre yoğunluğunda (6.1-6 adımında neurosphere hücre süspansiyonları ayrıştırılır.3) ve alt-tabakaya bağlı _kadar% 5 _CO2 içinde 30 ° C'de, en az 30 dakika boyunca devam edin. Daha sonra, kültür ortamı çıkarın ve hızlı bir _şekilde,% 5 _CO2 içinde 30 ° C'de 24 saat boyunca hücrelerin kültürlenmesi önce ön-ısıtılmış taze Z farklılaşma durumu ortamı (aşama 1.9) içinde 1 ml.
6. Her iki gün, hücre farklılaşmasının zamanında Z-farklılaşma koşulu orta yarısı değiştirin.

İlköğretim Neurospheres 7. Gen Manipülasyonu

1. 4 ° C'de 80 x g'de 8 dakika boyunca santrifüjlenerek DiV3-4 primer Neurospheres (adım 4.3) toplayın. Ticari oligonucleoatides lipozom transfeksiyon için hazırlanırken previouly ¹¹ veya DNA plazmid vektörlerinin Nucleo-transfeksiyon nitelendirdi.
2. Reaksiyon karışımı, 100 ul (82 ul nucleofactor çözeltisi ve ek 18 ul), 4 x 10 ³ hücre / ul hücre yoğunluğunda yeniden süspanse neurosphere pelet.
3. neurosphere asıltı Mix(1 ug / ml olarak plazmid stoklarının) seçim DNA plazmid vektörü 5 ul üzerinde. nucleotransfection bir Nucleofector küvet içine neurosphere / DNA karışımı, transferi ve Nucleofector kiti ile, imalatçının talimatlarına uygun olarak bir program Nucleofector seçin.
4. Hemen nucleofection sonra hücrelere önceden ısıtılmış Z durumu ortam (1.10), 500 ml bir hacim kazandırmak ve yukarıda tarif edildiği gibi, hücre yenileme ve / veya farklılaşma özelliklerini incelemek için, transfekte Neurospheres plaka.

Sonuçlar

Yetişkin Zebra balığı Neurosphere Kültür Genel Şeması

Burada yetişkin zebrabalıkları beyninden yapılan bir neurosphere oluşturucu deneyinin protokolünün tüm adımları açıklamaktadır. İlk olarak, yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin zebra balığı tüm beyin veya bu telencephalon, tektum ve serebellum (Şekil 1A-C) gibi çeşitli parçalara beyin bölgelerinde, ya toplanmıştı...

Tartışmalar

Bu protokolün amacı nöral kök / progenitör hücrelerin hücresel ve moleküler özellikleri incelemek için izole etmek ve kültür yetişkin zebrafish beyin kaynaklı Neurospheres etmektir. Burada, yetişkin zebrafish beyin, multipotent nöral hücreleri seçmek ve üç sinir hücre tipleri, yani astrositler, nöronlar ve oligodendrositleri oluşturmak için nasıl rapor. tekrarlanabilir neurosphere oluşturan deneyi şimdiye kadar zebrabalıkları kurulmuş olmasaydı bu yana protokol son derece önemlid...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS 1x	Life Technologies	14190-144
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C6852-25g
B-27	Life Technologies	17504-044
N-2	Life Technologies	17502-048	N-2 supplement (100x) liquid
HEPES	Life Technologies	15630	1 M
D-(+)-Glucose 45%	Sigma	G8769
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Insulin	Sigma	I5500-50 mg
DNAse	Sigma	DN25-10mg
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Matrigel	Becton Dickinson	356234
PFA	TCI	P0018
PBS	AmericanBio	AB11072-04000
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml.
Trycold gel	Sigma	TGP8	gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit	Lonza	VPI-1004
Trypan blue stain	Life Technologies	15250061