Aislamiento y cultivo de neuroesferas derivada de cerebro de adultos de pez cebra

Resumen

Aquí se proporciona un método reproducible para examinar la neurogénesis adulta usando un ensayo de neurosphere derivado de todo el cerebro o ya sea del telencephalic, tectal o regiones del cerebelo del cerebro adulto de pez cebra. Además, se describe el procedimiento para manipular la expresión génica en neuroesferas de pez cebra.

Resumen

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Introducción

Las células madre neuronales de mamíferos (NSC) se han caracterizado in vitro por su capacidad para crecer en cultivos de libre flotación como grupos de células que se dividen neuroesferas ¹ denominados. En presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), NSCs dividen, ya sea de forma simétrica para generar NSCs auto-renovación, o asimétrica para generar dos células hijas diferentes, es decir., Una célula progenitora la diferenciación y una novela NSC. Por lo tanto, los cultivos de neuroesferas son una mezcla de células madre / progenitoras neurales y células neuronales más diferenciados ^2-4 NSC pueden, sin embargo, se distinguen de otros tipos de células de neuroesferas por dos propiedades específicas:. Que muestran a largo plazo auto-renovación en tad culturas flotante y pueden diferenciarse en todos los linajes de células neuronales (es decir, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos) tras la retirada de factores de crecimiento y adhesión a los sustratos de la matriz extracelular. en mammALS, el sistema de cultivo neurosphere fue el primer sistema in vitro utilizado para demostrar la presencia de células madre neurales en el cerebro adulto y sigue siendo la herramienta más utilizada para analizar la proliferación, la capacidad de auto-renovación múltiple y capacidad de las células madre y progenitoras neuronales. Por lo tanto, a pesar de que los ensayos de formación de esferas sufren de algunas desventajas y limitaciones ^4, este sistema de cultivo es valiosa para evaluar el potencial de una célula a comportarse como una célula madre cuando se extraen de su nicho en vivo ⁴ y ha sido decisivo en la identificación de los principales reguladores NSC de auto-renovación y la determinación del destino celular ^5-7.

En contraste con los mamíferos que han limitado la neurogénesis adulta, el pez cebra producen constitutivamente nuevas neuronas a lo largo de todo el eje del cerebro a lo largo de su vida. El cerebro del pez cebra adulto muestra varios nichos neurogénicos que alberga las células madre neurales progenitoras / pez cebra haciendo un poderoso organismo modelo para la comprensión de tél vástago actividad de las células en el cerebro, así como los programas moleculares necesarios para la regeneración del sistema nervioso central. Durante los últimos 17 años, varios grupos de investigación desarrollado metodologías para aislar y cultivar células neuronales de pez cebra ^8,9. Estos estudios fueron dirigidos a la producción de neuronas embrionarias y células gliales in vitro, pero no en el mantenimiento de células madre neurales y la investigación de sus propiedades. Aunque neuroesferas se han generado en el adulto Apteronotus leptorhynchus (Brown Santo knifefish) ^10, un ensayo de formación de neuroesferas en el pez cebra se mantuvo por establecer.

Aquí se describe un ensayo de formación de neuroesferas-para demostrar el papel de miR-107 durante la neurogénesis pez cebra ^11. El protocolo permite: 1) la recogida de las células madre / progenitoras neurales adultas, ya sea de toda pez cebra cerebro o de varias regiones del cerebro diseccionadas como el telencéfalo, el tectum, y el cerebelo; 2) la generación de flflotante y neuroesferas auto-renovación de células madre / progenitoras neurales adultas; 3) el abajo y sobre regulación de la expresión de genes que codifican o pequeños ARN no codificantes en neuroesferas ^11, con el fin de investigar su papel en la proliferación y diferenciación de células madre / progenitoras neurales.

Protocolo

El pez cebra de la cepa WT ^CF fueron criados y mantenidos de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité Institucional de la Universidad de Yale y Uso Animal Care (IACUC protocolo número 2.012 hasta 11.473). Todos los experimentos primero deben ser aprobados por todas las éticas gubernamentales e institucionales que regulan los órganos pertinentes en relación con el uso de animales para fines de investigación.

1. Preparativos

1. Preparar 10 ml de medio de disección, añadir 200 l de 100x penicilina-estreptomicina en 9,8 ml de DMEM / F12.
2. Preparar la solución de L-cisteína: a 10 ml de agua para el cultivo de tejidos, añadir 120 mg de L-cisteína. Almacenar la solución de L-cisteína a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas, o en alícuotas a -20 ° C hasta por 1 año.
3. Preparar solución de DNasa I: a 1 ml de agua para el cultivo de tejidos, añadir 10 mg de DNasa I. Almacenar la solución de DNasa I a 4 ° C durante un máximo de 2 meses.
4. Preparar la solución de papaína: preparar solut papaínaion, añadir 100 l de papaína (aproximadamente 140 unidades), 100 l de DNasa I (1%) y 200 l de L-cisteína (12 mg / ml) en 5 ml de DMEM / F12. Recién preparar la solución de papaína cada vez y esterilizar con un filtro de tamaño de poro 0,22 micras antes de su uso.
5. Preparar la solución de lavado: para preparar 100 ml de solución de lavado, añadir 650 l de glucosa 45%, 500 l de HEPES 1 M y 5 ml de FBS en 93,85 ml DPBS 1x. Esterilizar la solución de lavado con un filtro de tamaño de poro 0,22 micras antes de su uso. Almacenar la solución de lavado a 4 ° C durante un máximo de 2 meses.
6. Preparar la solución de insulina: preparar 2 ml de solución de insulina, añadir una gota 25 l de NaOH N 10 y 100 mg de insulina en 2 ml de agua para el cultivo de tejidos.
7. Preparar soluciones de EGF y FGF: Disolver ambos mitógenos en DMEM / F12 a 100 mg de concentración / ml. Almacenar como 10 ml de alícuotas a -20 ° C.
8. Preparar los medios de comunicación B-27 y N-2: Guarde los suplementos B-27 y N-2 a -20 ° C hasta 500 l y alícuotas de 1 ml, respectivEly.
9. Preparar medio condición Z-diferenciación: para preparar 100 ml de medio condición Z-diferenciación, añadir 40 l de insulina (50 mg / ml), 500 l B-27, 1 ml de N-2, 650 l de glucosa 45% y 1 ml de 100 x penicilina-estreptomicina en 97,81 ml de DMEM / F12. Esterilizar el medio condición Z-diferenciación con un filtro de tamaño de poro 0,22 micras antes de su uso. Almacenar el medio condición Z-diferenciación a 4 ° C hasta por 1 semana.
10. Preparar medio Z-condición: para preparar 50 ml de Z-condición medios de comunicación, añadir 10 l de EGF y 10 l de FGF en 50 ml de medio de condición Z-diferenciación estéril (20 ng / ml). Almacenar el medio Z-condición a 4 ° C hasta por 1 semana.
11. Preparar la solución de recubrimiento para la cultura diferenciación: para 5 ml solución de revestimiento extracelular, añadir 100 l de la solución de matriz extracelular en 4,9 ml de DMEM / F12 (por ejemplo, Matrigel.). solución de descongelación de la matriz extracelular a 4 ° C en hielo. Una vez descongelado, mantener a 4 ° C para up a 2 semanas.

2. La disección del cerebro de adultos de pez cebra

1. Preparar una disección lecho de relleno de 100 mm x 15 mm placa de Petri con bolsas de hielo en gel. A continuación, coloque la tapa en la placa de Petri y se incuba a -20 ° C hasta que se congela el gel. En la parte superior de la tapa a cabo un cuadrado de papel de filtro limpio y envolver tanto el papel de filtro y placa de Petri con una película de plástico.
2. Limpiar y esterilizar todos los instrumentos de microdisección por etanol al 70% o al calor antes de cada uso. Coloque todos los instrumentos de disección esterilizados cerca del microscopio de disección y, justo antes de la eutanasia, colocar la cama de disección en el microscopio con iluminación de fibra óptica.
3. Suma 2 adultos de pez cebra para una preparación neurosphere de todo el cerebro; y de 3 a 4 pez cebra para generar neuroesferas de regiones cerebrales disecadas.
4. La eutanasia de adultos de pez cebra (8-12 meses de edad) usando un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional. A continuación, sumergir el pescado en 75% de etanol durante 5-10 segundos y rápidamente lugar en la cama disección seguido por decapitación en el nivel de las branquias utilizando una cuchilla quirúrgica.
   1. Para practicar la eutanasia a los animales, administrar una sobredosis (300 mg / L) de metanosulfonato de tricaína hasta el latido del corazón del animal se reduce gradualmente y se detiene la circulación, a continuación, sumergir en agua helada.
5. Girar la parte dorsal de la cabeza hacia abajo, y el uso de las tijeras hacer un corte longitudinal desde el lado del corte de la boca. Usando las pinzas exponer la base del cráneo y quitar todo el tejido adyacente. Cortar las paredes laterales del cráneo desde el principio de la médula espinal hacia el tectum.
6. El uso de la tijera, cortar y quitar los nervios ópticos y luego retire ambos lados de la parte más lateral del cráneo a nivel de la tectum. Girar la cabeza ventral hacia arriba. Con unas pinzas, retire el resto de la parte más apical del cráneo.
7. Transferir el cerebro junto con la parte restante del cráneo en una nueva wi platoth el medio de disección (1.1). Limpiar el tejido cerebral en el medio de disección usando mango de plástico de la cuchilla de micro, manteniendo intactas todas las estructuras cerebrales.
8. A partir de este punto, seguir el protocolo utilizando todo el cerebro del pez cebra.
   1. Alternativamente adaptar este protocolo para regiones específicas del cerebro para generar neuroesferas de todo el cerebro del pez cebra o desde el telencéfalo, tectum / diencéfalo o el cerebelo diseccionado con un bisturí fresco. Utilice una línea de pez cebra fluorescente específica neuronal neuronal transgénico para diseccionar la región del cerebro de interés de acuerdo a la Figura 3 y ¹¹ de referencia.

3. La disociación célula de cerebro adulto

1. Realizar todos los trabajos posteriores en una cabina de seguridad biológica. Transferir el tejido cerebral en un tubo de 1,5 ml que contiene 800 l de medio de disección (preparado en el paso 1.1). Retire el medio de disección con la pipeta, sin tocar el tejido cerebral.
2. Añadir 500 l de solución de papaína (paso 1.4) y digerir el tejido cerebral a 37 ° C durante 10 min. No incubar más de 15 min, ya que podría disminuir la viabilidad celular.
3. Después de la incubación, transferir el tejido cerebral con 500 l de la solución de papaína en un tubo cónico de 15 ml usando un 1,000 l punta de pipeta corte en ~ 0,25 pulgadas de la parte inferior. disociar suavemente el tejido cerebral con la pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con la misma punta. No pipetear arriba y abajo más de 15 veces y no generan burbujas de aire durante este paso, ya que podría alterar la viabilidad celular.
4. Incubar el tejido cerebral de nuevo a 37 ° C durante 10 min seguido de la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10-13 veces usando una punta sin cortar 1.000 l regular. No pipetear arriba y abajo más de 15 veces, para evitar la muerte celular.
5. Detener la digestión enzimática mediante la adición de 2 ml de solución de lavado (paso 1.5), y se centrifuga la suspensión de células a 800 xg durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Cuidadosamente decantar los supernatant y volver a suspender el sedimento en la solución remanente invirtiendo el tubo vigorosamente con un dedo y luego con la pipeta hacia arriba y abajo con una punta de 1.000 l regular. A continuación, añadir 2 ml de solución de lavado.
6. En esta etapa, comprobar en el microscopio que una única suspensión de células se ha obtenido. Centrifugar la suspensión celular de nuevo a 800 xg durante 5 min a TA. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento usando 1 ml de frescas Z-estado medio (paso 1.10).
7. Células de manchas mediante el uso de azul de tripano y ¹² cuentan las células vivas utilizando un hemocitómetro al excluir las células muertas de color azul. Preparar una placa de 24 pocillos con 200 l de suspensión de células y 300 l de fresco Z-condición medio en cada pocillo. Se siembran las células a una densidad de ~ 500 células / mL. Mantener las células cultivadas en una incubadora a 30 ° C en 5% de CO _2, ya _que neuroesferas derivadas del cerebro de pez cebra no crecen bien a 37 ° C.

4. Generación de neuroesferas primaria

1. Después de 1 día in vitro (DIV1), observar la suspensión de células individuales obtenidos a partir de la totalidad del cerebro adulto bajo el microscopio y tenga en cuenta si los desechos se ha acumulado en el centro del pozo. Retirar con cuidado cualquier residuo con la pipeta aproximadamente 100 l de medio (menos si es posible). A continuación se añaden 100 l de Z-fresca condiciones. Suspensiones de células individuales deben ser observadas en este momento (Figura 2A div1).
2. Después de 2 días in vitro (Div2), expandir las células cultivadas. Con una pipeta de 1.000 l con el corte de la punta, recoger y transferir 250 l de suspensión de células de cada pocillo en un nuevo pozo. Añadir 250 l de Z-fresca condición medio en todos los pocillos. Antes de la expansión de las células cultivadas, homogeneizar la suspensión muy suavemente pipeteando arriba y abajo a lo largo del pozo.
3. Repita los pasos 4.1 y 4.2 para los siguientes 4 días in vitro (DIV4). Un aumento progresivo en el tamaño de neuroesferas debe ser vible en el centro y los bordes del bien en div3 y DIV4 (Figura 2B y C).
   Nota: neuroesferas primarias pueden ser procesados ​​para el paso o la diferenciación de evaluar multipotencia. Alternativamente, pueden ser procesados ​​para nucleofection o lipo-transfección ¹¹ para caracterizar el papel de los genes específicos durante el proceso de diferenciación.

5. pases de neuroesferas Primaria

1. Eliminar 250 l de cultivo de tejidos de cada pocillo y se disocian mecánicamente neuroesferas DIV4 con una pipeta de 1 ml. No pipetear arriba y abajo con demasiada rapidez como la formación de burbujas de aire puede aumento de la muerte celular.
2. Contar las células con un hemocitómetro y distribuir 800 células / l en 250 l de sobrenadante de cultivo primario en cada pocillo de una placa de 24 pocillos.
3. Añadir 250 l de medio de Z-condición a cada pocillo.
4. Después de 2 días in vitro (Div2), expandir las células cultivadas como se informó en el paso 4.2 unad 4,3.

6. Diferenciación de neuroesferas primaria

1. Esterilizar cubiertas de vidrio por inmersión en etanol al 70% durante 10 minutos, a continuación, cubiertas de vidrio secos a temperatura ambiente, colocándolos en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
2. Añadir 300 l de solución de revestimiento extracelular (etapa 1.11) en el centro de la cubierta de vidrio de tal manera que puede expandirse ampliamente y cubrir toda la cubierta de vidrio. A continuación, se incuba a 37 ° C durante 1 h (utilizando el cultivo celular incubadora humidificada).
3. Retire la solución de revestimiento extracelular después de la incubación, y se seca la cubierta de vidrio durante 2 horas a 37 ° C.
4. Eliminar 250 l de cultivo de tejidos de cada pocillo. Mecánicamente disociar todas las neuroesferas primarias DIV4 por pocillo con una pipeta de 1 ml (con la punta de gama más amplia) por la pipeta hacia arriba y hacia abajo.
5. Seed disociado suspensiones de células de neuroesferas a una densidad celular de 4 x 10 ³ células / ml en cubreobjetos de matriz recubierto extracelulares preparadas previamente (paso 6,1-6.3) y mantener durante al menos 30 min, a 30 ° C en 5% de CO _2, hasta que unido al sustrato. A continuación, retire el medio de cultivo y rápidamente agregar 1 ml de medio fresco condición Z-diferenciación de pre-calentado (paso 1.9) antes de cultivar las células durante 24 horas a 30 ° C en 5% de CO _2.
6. Cada dos días, sustituyen a la mitad del medio condición Z-diferenciación durante el tiempo de la diferenciación celular.

7. La manipulación de genes neuroesferas Primaria

1. Recoger DiV3-4 neuroesferas primarias (paso 4,3) por centrifugación durante 8 minutos a 80 x g a 4 ° C. Preparar para la transfección de liposomas de oligonucleoatides comerciales como previouly describen ¹¹ o núcleo-transfección de vectores de plásmidos de ADN.
2. Resuspender neurosphere pellet a una densidad celular de 4 x 10 ³ células / l en 100 l de una mezcla de reacción (solución nucleofactor 82 l y 18 l de complemento).
3. Mezclar la Suspensiòn neurospherecon 5 l de los vectores de plásmidos de ADN de plásmido elección (stocks en 1 mg / l). Transferir la mezcla neurosphere / ADN en una cubeta nucleofector para nucleotransfection y seleccione nucleofector programa de acuerdo con las instrucciones del fabricante proporcionadas por el kit nucleofector.
4. Inmediatamente después de nucleofection, añadir un volumen de 500 ml de Z-estado del soporte de pre-calentado (1,10) a las células y la placa de las neuroesferas transfectadas para el estudio de su renovación celular y / o las propiedades de diferenciación, como se describe anteriormente.

Resultados

Esquema general del pez cebra adulto Neurosphere Cultura

Aquí se describen todos los pasos del protocolo de un ensayo de formación de neuroesferas-realizada a través del cerebro adulto de pez cebra. En primer lugar, las células madre / progenitoras neurales de adultos han sido recogidos ya sea de toda pez cebra cerebro o de varias regiones del cerebro diseccionadas como el telencéfalo, el tectum y el cerebelo (Fig...

Discusión

El objetivo principal de este protocolo es aislar y cultivar adultos de pez cebra neuroesferas derivadas del cerebro para el estudio de las características celulares y moleculares de las células madre / progenitoras neurales. Aquí, se presenta la forma de seleccionar las células neuronales multipotentes y generar los tres tipos de células neuronales, es decir, los astrocitos, neuronas y oligodendrocitos, desde el cerebro adulto de pez cebra. El protocolo es muy significativo ya que un ensayo de formación ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS 1x	Life Technologies	14190-144
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C6852-25g
B-27	Life Technologies	17504-044
N-2	Life Technologies	17502-048	N-2 supplement (100x) liquid
HEPES	Life Technologies	15630	1 M
D-(+)-Glucose 45%	Sigma	G8769
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Insulin	Sigma	I5500-50 mg
DNAse	Sigma	DN25-10mg
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Matrigel	Becton Dickinson	356234
PFA	TCI	P0018
PBS	AmericanBio	AB11072-04000
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml.
Trycold gel	Sigma	TGP8	gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit	Lonza	VPI-1004
Trypan blue stain	Life Technologies	15250061