Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

Resumo

Aqui é proporcionado um método reprodutível para estudar a neurogénese adulto utilizando um ensaio neuroesfera derivado de todo o cérebro ou a partir de qualquer telencefálicos tectal ou regiões do cerebelo do cérebro adulto peixe-zebra. Além disso, descreve-se o procedimento para manipular a expressão de genes em neuroesferas de peixe-zebra.

Resumo

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Introdução

As células estaminais neurais de mamífero (NCCC) foram caracterizados in vitro pela sua capacidade para crescer em culturas de livre flutuação como aglomerados de células neuroesferas ¹ denominadas dividindo. Na presença de factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), NSC dividir quer simetricamente para gerar NSC auto-renovação, ou assimetricamente para gerar duas células filhas diferentes, ie., Uma célula progenitora de diferenciação e um romance NSC. Culturas de neuroesferas são, portanto, uma mistura de células estaminais / progenitoras neuronais e células neurais diferenciadas mais ^2-4 NSC pode, contudo, ser distinguido de outros tipos de células de neuroesferas por duas propriedades específicas:. Eles exibem a longo prazo de auto-renovação em LIVRE culturas flutuante e que podem se diferenciar em todas as linhagens de células neurais (isto é, neurónios, astrócitos, oligodendrócitos e seguintes) retirada de factores de crescimento e adesão a substratos de matriz extracelulares. em mammALS, o sistema de cultura de neuroesferas foi o primeiro sistema in vitro utilizado para demonstrar a presença de NSC no cérebro adulto e mantém-se o instrumento mais vulgarmente utilizado para analisar a proliferação, capacidade de auto-renovação e multipotência de células estaminais e progenitoras neurais. Portanto, embora os ensaios de formação de esfera sofrem de algumas desvantagens e limitações ^4, este sistema de cultura é valiosa para a avaliação do potencial de uma célula a comportar-se como uma célula estaminal quando removido do seu nicho in vivo ⁴ e tem contribuído para identificar reguladores chaves de NSC de auto-renovação e destino celular determinação ^5-7.

Em contraste com os mamíferos que a neurogênese adulta limitados, peixe-zebra constitutivamente produzir novos neurônios ao longo de todo o eixo cérebro durante toda a sua vida. O cérebro de peixe zebra adulto exibe vários nichos neurogênicos abrigar células estaminais neuronais / progenitoras que fazem zebrafish um modelo poderoso organismo para a compreensão tEle stem a actividade de células no cérebro, bem como os programas molecular necessários para a regeneração do sistema nervoso central. Ao longo dos últimos 17 anos, vários grupos de pesquisa desenvolvida metodologias para o isolamento e cultura de células neurais zebrafish ^8,9. Esses estudos tiveram como objetivo produzir neuronal embrionário e células gliais in vitro, mas não a manutenção NSCs e investigar suas propriedades. Embora neuroesferas foram gerados no adulto Apteronotus leptorhynchus (Brown fantasma knifefish) ^10, um ensaio de formação de neuroesfera no peixe-zebra manteve-se a ser estabelecida.

Descrevemos aqui um ensaio de formação de neuroesfera para demonstrar o papel de miR-107 durante ¹¹ neurogénese peixe-zebra. O protocolo permite que: 1) a coleta de células-tronco / progenitoras neurais adultas quer a partir do cérebro inteiro peixe-zebra ou de várias regiões cerebrais dissecados como o telencéfalo, a tectum, eo cerebelo; 2) a produção de FLflutuante e neurospheres auto-renovação das células-tronco / progenitoras neurais adultas; 3) a jusante e a sobre-regulação da expressão de genes que codificam ou pequenos RNAs não-codificantes nas neuroesferas ^11, a fim de investigar o seu papel na proliferação e diferenciação de células estaminais / progenitoras neurais.

Protocolo

Peixe-zebra da estirpe WT ^CF foram criados e mantidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê da Universidade Yale Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC número de protocolo 2012-11473). Todos os experimentos deve primeiro ser aprovado por todos ética governamentais e institucionais relevantes órgãos reguladores em relação ao uso de animais para fins de investigação.

1. Preparações

1. Preparar 10 ml de meio de dissecção, adicionar 200 ul de 100x penicilina-estreptomicina em 9,8 ml de DMEM / F12.
2. Preparar solução de L-cisteína: a 10 ml de água para cultura de tecidos, adicionar 120 mg de L-cisteína. Guardar a solução de L-cisteína a 4 ° C durante até 2 semanas, ou em alíquotas a -20 ° C durante até 1 ano.
3. Preparar solução de ADNase I: a 1 ml de água para cultura de tecidos, adicionam-se 10 mg de ADNase I. loja a solução de ADNase I a 4 ° C durante até 2 meses.
4. Preparar solução de papaína: a preparar papaína solutião, adiciona-se 100 ul de papaina (cerca de 140 unidades), 100 ul de DNase I (1%) e 200 ul de L-cisteina (12 mg / ml) em 5 ml de DMEM / F12. Recentemente preparar a solução de papaína de cada vez e esterilizar com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um antes da utilização.
5. Preparar a solução de lavagem: para preparar 100 ml de solução de lavagem, adicionar 650 ul de glucose 45%, 500 mL de HEPES 1 M e 5 ml de FBS em 93,85 ml de DPBS 1x. Esterilizar a solução de lavagem com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um antes da utilização. Guardar a solução de lavagem a 4 ° C durante até 2 meses.
6. Preparar a solução de insulina: para preparar a 2 ml de solução de insulina, adicionar uma gota de 25 ul de NaOH 10 N e 100 mg de insulina em 2 ml de água para cultura de tecidos.
7. Preparar soluções de EGF e FGF: Dissolve-se ambos os agentes mitogénicos em meio DMEM / F12 a 100 ug / ml de concentração. Loja como alíquotas de 10 uL a -20 ° C.
8. Prepare meios B-27 e N-2: B-27 e N-2 suplementos armazenar a -20 ° C, tal como 500 ul de aliquotas de 1 mL e, respectivEly.
9. Prepare forma condição de Z-diferenciação: para preparar 100 ml de meio condicionado Z-diferenciação, adicionar 40 uL de insulina (50 mg / ml), 500 ul de B-27, 1 ml de N-2, 650 ul de glucose 45% e 1 ml de 100 x penicilina-estreptomicina em 97,81 ml de DMEM / F12. Esteriliza-se o meio condicionado Z-diferenciação com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um antes da utilização. Armazenar a forma condição de Z-diferenciação a 4 ° C durante até 1 semana.
10. Prepare a forma de Z-condição: para preparar 50 ml de meio de Z-condição, adicionar 10 ul de EGF e 10 ul de FGF-se em 50 ml de meio condicionado-Z diferenciação estéril (20 ng / ml). Armazenar a forma de Z-condição a 4 ° C durante até 1 semana.
11. Preparar a solução de revestimento para a cultura de diferenciação: por 5 ml de solução de revestimento extracelular, adicionar 100 ul da solução de matriz extracelular em 4,9 ml de DMEM / F12 (por exemplo, Matrigel.). solução de matriz extracelular Descongelar a 4 ° C em gelo. Uma vez descongelado, manter a 4 ° C para up a 2 semanas.

2. Dissecção do cérebro adulto Zebrafish

1. Prepare uma dissecção cama, preenchendo um 100 milímetros x 15 mm placa de Petri com pacotes de gelo gel. Em seguida, colocar a tampa no prato de petri e incubar à temperatura de -20 ° C até o congelamento de gel. No topo do lugar da tampa de um quadrado de papel de filtro limpo e envolva tanto o papel de filtro e placa de Petri com filme plástico.
2. Limpar e esterilizar todos os instrumentos de microdissecção por 70% de etanol ou de calor antes de cada utilização. Coloque todos os instrumentos de dissecção esterilizados perto do microscópio de dissecação e, logo antes da eutanásia, colocar a cama dissecção sob o microscópio com iluminação de fibra óptica.
3. Recolha 2 peixe-zebra adulto para uma preparação neurosphere cérebro inteiro; e 3 a 4 para gerar peixes-zebra a partir de neuroesferas regiões cerebrais dissecados.
4. Eutanásia peixe-zebra adulto (8-12 meses de idade) usando um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal. Em seguida, mergulhe o peixe em 75% de etanol durante 5-10 segundos e rapidamente colocar na cama dissecção seguido por decapitação ao nível das brânquias utilizando uma lâmina cirúrgica.
   1. A eutanásia animais, administrar uma dose excessiva (300 mg / L) de metano-sulfonato tricaina até do animal batida de coração desacelera gradualmente para baixo e a circulação pára, em seguida, mergulhar em água gelada.
5. Vire o lado da cabeça dorsal para baixo, e usando a tesoura fazer um corte longitudinal do lado do corte na boca. Usando fórceps expor a base do crânio e remover todo o tecido adjacente. Corte as paredes laterais do crânio a partir do início da medula espinal para o tectum.
6. Usando a tesoura, cortar e remover os nervos ópticos e, em seguida, remover ambos os lados da parte mais lateral do crânio no nível do tectum. Vire a cabeça ventral para cima. Utilizando uma pinça, retire o resto da parte mais apical do crânio.
7. Transferir o cérebro, juntamente com a parte restante do crânio para um novo prato with o meio dissecção (1,1). Limpar o tecido cerebral, a médio dissecção usando cabo de plástico no micro da faca, mantendo todas as estruturas do cérebro intacto.
8. A partir deste ponto, continuar o protocolo utilizando todo o cérebro de peixe zebra.
   1. Alternativamente adaptar este protocolo para regiões específicas do cérebro para gerar neurospheres de toda cérebro de peixe zebra ou do telencéfalo, tectum / diencephalon ou cerebelo dissecados com um bisturi fresco. Use uma linha fluorescente específica neural peixe-zebra transgénicos neural para dissecar a região do cérebro de interesse de acordo com a Figura 3 e referência ^11.

3. A dissociação de células individuais de cérebro adulto

1. Executar todo o trabalho subsequente em uma cabine de segurança biológica. Transferir o tecido cerebral em um tubo de 1,5 mL contendo 800 uL de meio de dissecção (preparado no passo 1.1). Remover o meio de dissecção por pipetagem, sem tocar no tecido cerebral.
2. Adicionar 500 ul de solução de papaína (passo 1.4) e digerir o tecido do cérebro a 37 ° C durante 10 min. Não incubar mais de 15 min, uma vez que pode diminuir a viabilidade celular.
3. Após a incubação, a transferência do tecido cerebral com 500 ul da solução de papaína em um tubo de 15 ml usando um 1000 ul corte na ponta da pipeta ~ 0,25 polegadas a partir do fundo. Gentilmente dissociar o tecido cerebral lentamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes com a mesma ponta. Não pipetar para cima e para baixo mais de 15 vezes e não gerar bolhas de ar durante esta etapa, uma vez que poderia alterar a viabilidade celular.
4. Incubar o tecido cerebral de novo a 37 ° C durante 10 min, seguido por pipetagem para cima e para baixo 10-13 vezes utilizando um sem cortes 1.000 ul ponta regular. Não pipetar cima e para baixo mais de 15 vezes, para evitar a morte celular.
5. Parar a digestão enzimática por adição de 2 ml de solução de lavagem (passo 1.5), e centrifuga-se a suspensão de células a 800 xg durante 5 min à temperatura ambiente (TA). Decantar cuidadosamente as supernatant e ressuspender o sedimento na solução remanescente batendo o tubo vigorosamente com um dedo e, em seguida, pipetando para cima e para baixo com um 1.000 ul ponta regular. Em seguida, adicionar 2 ml de solução de lavagem.
6. Nesta fase, verificar ao microscópio, que foi obtida uma suspensão de células individuais. Centrifugar novamente a suspensão de células a 800 xg durante 5 min à TA. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet utilizando 1 mL de meio de Z-condição fresca (passo 1.10).
7. Células mancha usando azul de tripano ¹² e contar as células vivas usando um hemocitômetro por exclusão de células mortas azuis. Prepara-se uma placa de 24 poços com 200 ul de suspensão de células e 300 ul de meio-Z condição fresca em cada poço. Semear as células a uma densidade de ~ 500 células / mL. Manter as células em cultura numa incubadora a 30 ° C em 5% de CO _2, uma vez que neuroesferas derivadas do cérebro de peixe-zebra não crescem bem a 37 ° C.

4. Geração de Primary neuroesferas

1. Após 1 dia in vitro (Div1), observar a suspensão de células individuais obtidas a partir de todo o cérebro adulto sob o microscópio e observar se os detritos se acumulou no centro do poço. Cuidadosamente remover quaisquer detritos por pipetagem de aproximadamente 100 ul de meio (menos, se possível). Em seguida, adicione 100 ml de meio de Z-condição fresco. As suspensões de células individuais deve ser observado neste momento (Figura 2A Div1).
2. Após 2 dias in vitro (Div2), expandir-se as células em cultura. Usando uma pipeta de 1000 uL com o corte da ponta, recolher e transferir 250 ul de suspensão de células de cada poço para um poço novo. Adicionar 250 mL de meio Z-condição fresco em todos os poços. Antes de expandir as células cultivadas, homogeneizar a suspensão muito suavemente pipetando cima e para baixo durante todo o bem.
3. Repita os passos 4.1 e 4.2 para os seguintes 4 dias in vitro (DiV4). Um aumento progressivo do tamanho do neurospheres deve ser visível no centro e nas extremidades do poço a Div3 e DiV4 (Figura 2B e C).
   Nota: neurospheres primárias podem ser processados ​​para a passagem ou diferenciação para avaliar multipotency. Alternativamente, eles podem ser processados ​​para nucleofection ou lipo-transfecção ^{de 11} a caracterizar o papel de genes específicos durante o processo de diferenciação.

5. Passaging da Primária neuroesferas

1. Retirar 250 ul de cultura de tecidos de cada poço e mecanicamente dissociar DiV4 neuroesferas com uma pipeta de 1 ml. Não pipetar cima e para baixo muito rapidamente como a formação de bolhas de ar podem aumento da morte celular.
2. Contar as células com um hemocitómetro e distribuir 800 células / uL em 250 uL de sobrenadante de cultura primária em cada poço de uma placa de 24 poços.
3. Adicionar 250 ul de meio de Z-condição para cada poço.
4. Após 2 dias in vitro (Div2), expandir-se as células em cultura como relatado no passo 4.2 umad 4.3.

6. Diferenciação de neuroesferas primária

1. Esterilizar vidros de cobertura por imersão em etanol a 70% durante 10 min, vidros de cobertura, em seguida, seco à temperatura ambiente, colocando-os em cada poço de uma placa de 12 poços.
2. Adicionar 300 ul de solução de revestimento extracelular (passo 1.11) no centro da tampa de vidro, de tal maneira que possa expandir amplamente e abrange todo o vidro de cobertura. Em seguida, incuba-se a 37 ° C durante 1 h (utilizando a cultura de células incubadora humidi ficada).
3. Remover a solução de revestimento extracelular após a incubação, e seca-se a tampa de vidro durante 2 horas a 37 ° C.
4. Retirar 250 ul de cultura de tecido a partir de cada poço. Mecanicamente dissociar todos os DiV4 neurospheres primários por poço com uma pipeta de 1 ml (com ponta mais larga-end) por pipetagem cima e para baixo.
5. Semente dissociado suspensões de células de neuroesferas com uma densidade celular de 4 x 10 células / ³ mL em esfregaços revestidos de matriz extracelulares previamente preparados (passo 6,1-6.3) e manter durante pelo menos 30 min, a 30 ° C em 5% de _CO2, até ligada ao substrato. Em seguida, remover o meio de cultura e adiciona-se rapidamente 1 ml de meio fresco condição de Z-diferenciação de pré-aquecido (passo 1.9), antes da cultura das células durante 24 h a 30 ° C em 5% de CO _2.
6. De dois em dois dias, substituir metade do meio condição de Z-diferenciação durante o tempo de diferenciação celular.

7. Gene Manipulação de Primary neuroesferas

1. Recolhe DiV3-4 neuroesferas primárias (Passo 4.3) por centrifugação durante 8 min a 80 x g a 4 ° C. Prepare-se para transfecção de lipossomas de oligonucleoatides comerciais como previouly descrito ¹¹ ou nucleo-transfecção de vectores de plasmídeo de DNA.
2. Ressuspender o granulado neuroesfera a uma densidade celular de 4 x 10 ³ células / uL em 100 uL de uma mistura reaccional (solução nucleofactor 82 ul e 18 ul de complemento).
3. Misture a suspensi neuroesferacom 5 ul de plasmídeo de ADN dos vectores de escolha (stocks de plasmídeo a 1 ug / uL). Transferir a mistura neuroesfera / ADN numa cuvete para Nucleofector nucleotransfection e seleccionar Nucleofector programa de acordo com as instruções do fabricante fornecidas pelo kit Nucleofector.
4. Imediatamente após nucleofection, adicionar um volume de 500 ml de meio de Z-condição pré-aquecido (1,10) às células e as neuroesferas placa transfectadas para estudar a sua renovação celular e / ou propriedades de diferenciação, tal como descrito acima.

Resultados

Esquema geral da Neurosphere Cultura Zebrafish Adulto

Descrevemos aqui todos os passos do protocolo de um ensaio de formação de neuroesfera realizada a partir do cérebro de peixe zebra adultos. Primeiro, as células estaminais / progenitoras neuronais adultas foram recolhidos quer a partir de cérebro inteiro de peixe-zebra ou a partir de várias regiões do cérebro tais como o dissecados telencéfalo, tectum e o cerebelo ...

Discussão

O principal objectivo deste protocolo é o de isolar e cultivar peixe-zebra adulto neurospheres derivado do cérebro para estudar as características celulares e moleculares de células estaminais / progenitoras neurais. Aqui, nós relatamos como selecionar células neurais multipotentes e gerar os três tipos de células neurais, ou seja, astrócitos, neurônios e oligodendrócitos, a partir do cérebro de peixe zebra adulta. O protocolo é altamente significativo uma vez que um ensaio de formação de neurosp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS 1x	Life Technologies	14190-144
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C6852-25g
B-27	Life Technologies	17504-044
N-2	Life Technologies	17502-048	N-2 supplement (100x) liquid
HEPES	Life Technologies	15630	1 M
D-(+)-Glucose 45%	Sigma	G8769
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Insulin	Sigma	I5500-50 mg
DNAse	Sigma	DN25-10mg
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Matrigel	Becton Dickinson	356234
PFA	TCI	P0018
PBS	AmericanBio	AB11072-04000
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml.
Trycold gel	Sigma	TGP8	gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit	Lonza	VPI-1004
Trypan blue stain	Life Technologies	15250061