성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

요약

여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.

초록

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

서문

포유류 신경줄 기세포 (NSCs의)는 neurosphere를 ^1이라 세포의 클러스터로 분할 부동성 배양에서 성장하는 능력에 의해 시험 관내에서 특성화되었다. 표피 성장 인자 (EGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 존재하에 NSCs의 자기 갱신 NSCs을 생성하기 위해 하나 대칭 분할 또는 비대칭 적으로 서로 다른 두 딸 세포를 생성하는 예., 미분 전구 세포 및 신규 NSC. Neurosphere 문화 따라서 신경 줄기 / 전구 세포보다 분화 된 신경 세포 ^2-4의 혼합물이다 NSCs을하지만,이 특정 속성에 의해 다른 neurosphere 세포 유형을 구별 할 수 있습니다. 그들은 자유에 장기 자기 갱신을 표시 문화 부동 그들은 세포 외 매트릭스 기판에 성장 인자의 철수 및 부착 다음 모든 신경 세포 계통 (즉, 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포)로 분화 할 수 있습니다. mamm에서ALS, neurosphere 배양 시스템은 성인 뇌 NSCs의 존재를 입증하는 데 사용되는 제 관내 시스템이고 증식자가 재생 능력과 신경 줄기 세포 및 선조 세포의 다 능성을 분석하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 도구가 남아있다. 따라서, 구 형성 분석법 단점과 한계 ⁴ 고통에도이 배양 시스템은 생체 내 틈새 ^(4)로부터 제거되어 키 레귤레이터 식별 쓸모 때 줄기 세포처럼 행동하는 세포의 잠재력을 평가하는데 유용 NSC 자기 갱신과 세포 운명 결정 ^5-7의.

성인 신경 제한된 포유류 달리 지브라 피쉬는 구조적 그들의 수명 동안 뇌 전체 축을 따라 새로운 뉴런을 생성한다. 제브라 피쉬 성인의 뇌는 t을 이해하기위한 제브라 피쉬에게 강력한 모델 생물을 신경 줄기 / 전구 세포를 품고 여러 신경 인성 틈새를 표시그 세포는 뇌 활동뿐만 아니라 중추 신경계 재생을위한 필요한 분자 프로그램 줄기. 지난 십칠년 동안 여러 연구 그룹은 분리하고 제브라 피쉬의 신경 세포 ^{8,9 배양을위한} 방법론을 개발했다. 이 연구는 배아 신경 세포 및 생체 외에서 아교 세포를 생산을 목표로,하지만 NSCs을 유지하고 그들의 특성을 조사하고 있었다. neurosphere를가 성인 Apteronotus의 leptorhynchus (브라운 유령 Knifefish) ^(10)에서 생성되었지만, 제브라 피쉬의 neurosphere 형성 분석은 설정 될 남아 있었다.

여기에서 우리는 제브라 피쉬의 신경 ⁽¹¹⁾ 동안은 miR-107의 역할을 설명하기 neurosphere 형성 분석을 설명합니다. 프로토콜은 수 1) 지브라 피쉬 뇌 전체에서 또는 telencephalon, tectum 및 소뇌 여러 해부 뇌 영역에서 어느 성인 신경 줄기 / 선조 세포의 수집; FL 2) 생성oating 성인 신경 줄기 / 전구 세포의 자기 갱신 neurosphere를; 3) 하향과 상향 조정 코딩하는 유전자 또는 작은 비 코딩 RNA를 neurosphere를 ^11의 표현의 순서는 신경 줄기 / 전구 세포의 증식 및 분화에서의 역할을 조사합니다.

프로토콜

WT ^{CF 균주의} 제브라 피쉬는 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC 프로토콜 번호 2012-11473)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 제기 및 유지 하였다. 모든 실험은 첫 번째 연구 목적으로 동물의 사용과 관련 기관을 규제하는 모든 관련 정부 및 기관 윤리의 승인을 받아야한다.

1. 준비

1. , 해부 매체 10 ml의 준비의 200 μl를 추가 100X 페니실린 - 스트렙토 마이신 DMEM / F12의 9.8 ml의에.
2. , 조직 배양 물 10 ㎖에 L 시스테인 120 mg의 추가 : L 시스테인 솔루션을 준비합니다. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 L 시스테인 솔루션을 저장, 또는 최대 1 년 -20 ° C에서 분취한다.
3. DNase의에게 내가 솔루션을 준비 : 조직 배양 물 1 ㎖에, DNase의 I. 스토어 최대 2 개월 동안 4 ° C에서의 DNase I 용액 10 mg을 추가합니다.
4. 파파인 솔루션을 준비 : 파파인 오디오 솔루션을 준비이온은 DMEM / F12의 5 ㎖로 100 ㎕를 파파인 (약 140 대), 100 μL의 DNase의 I (1 %) 200 μL의 L 시스테인 (12 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 갓 파파인 용액마다 준비하고 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터로 멸균.
5. 세척 용액을 제조 :, 세척 용액 100 ㎖를 제조 93.85 ml의 DPBS 1 배에 포도당 45 %, 500 μL HEPES 1 M, 5 ML의 FBS를 650 μl를 추가 할 수 있습니다. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 세척 소독 용액. 최대 2 개월 동안 4 ° C에서 세정액을 저장합니다.
6. 인슐린 솔루션을 준비 : 인슐린 용액 2 ㎖를 준비, 조직 배양 물 2 ㎖로 10 N 수산화 나트륨 100 mg의 인슐린의 25 μl의 드롭을 추가합니다.
7. EGF와 FGF 솔루션을 준비 : 100 μg의 / ml의 농도로 DMEM / F12 모두 분열 촉진 물질을 용해. -20 ° C에서 10 μL 씩과 같은 보관하십시오.
8. B-27, N-2 미디어를 준비합니다 저장 B-27 및 N-2 보충제를 500 μL로 -20 ° C 1 ml의 분취, respectiv에서엘리.
9. Z 분화 조건 배지를 준비 : Z 분화 조건 배지 100㎖를 준비 40 μL 인슐린 (50 ㎎ / ㎖) 500 ㎕를 B-27 1 ㎖의 N-2, 650 μL의 포도당 45 % 및 1 ㎖를 추가 할 100 × 페니실린 - 스트렙토 마이신 DMEM / F12의 97.81 ml의에. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터 Z 분화 조건 배지를 멸균. 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 Z-분화 조건 매체를 저장합니다.
10. Z 조건 배지를 제조 : Z-조건 배지 50 ㎖를 준비 EGF 10 ㎕의 멸균 Z 분화 조건 배지 (20 NG / ㎖) 50 ㎖에 FGF의 10 μL를 추가. 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 Z-조건 매체를 저장합니다.
11. 분화 배양 코팅액을 제조 5 ml의 세포 외 도포 액에 대해, 세포 외 기질 용액 100 ㎕를 추가 DMEM / F12 4.9 ㎖ 중에 (예, 마트 리겔.). 얼음에 4 ℃에서 해동 세포 외 매트릭스 솔루션입니다. 일단 해동, 유 4 ℃에서 보관이주에 페이지.

성인 Zebrafish의 두뇌 2. 해부

1. 젤 아이스 팩 100mm X 15mm 페트리 접시를 작성하여 침대 절개를 준비합니다. 그런 다음 페트리 접시에 뚜껑을 배치하고 젤이 정지 할 때까지 -20 ° C에서 품어. 뚜껑 장소의 위에 깨끗한 종이 필터의 사각형 필터 종이와 플라스틱 필름 배양 접시를 모두 마무리합니다.
2. 깨끗하고 각 사용하기 전에 70 % 에탄올 또는 열에 의해 모든 미세 절제 장비를 소독. 해부 현미경 근처에 모든 멸균 해부 악기를 배치하고, 오른쪽 안락사 전에, 광섬유 조명 현미경 해부 침대를 배치합니다.
3. 전체 뇌 neurosphere 준비를위한 2 성인 제브라 피쉬를 수집; 및 3-4 제브라 해부 뇌 영역에서 neurosphere를 생성한다.
4. 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 성인 제브라 피쉬 (8~12개월 세)를 안락사. 다음으로, 7 물고기를 담그지5 % ~ 10 초 동안 에탄올 빠르게는 수술 블레이드를 사용하여 아가미의 수준에서 잘린 다음 해부 침대에 배치합니다.
   1. 동물의 심장 박동이 점차 둔화 및 순환이 멈출 때까지 과다 복용 tricaine의 메탄 (300 ㎎ / ℓ)를 관리, 동물을 안락사하려면 다음 아이스 물에 담그지.
5. 아래로 머리 등의 측면을 돌려 가위를 사용하여 입 컷 측면에서 길이 절단을합니다. 집게를 사용하여 두개골의 기반을 노출하고 모든 인접 조직을 제거합니다. tectum으로 척수의 시작 부분에서 두개골의 측면 벽을 잘라.
6. 위 사용 절단 시신경을 제거하고 tectum 수준에서 두개골의 가장 외측 부분의 양측을 제거한다. 머리 복부 쪽을 돌립니다. 두개골의 가장 꼭대기 부분의 나머지 부분을 떼어, 집게를 사용.
7. 새로운 요리 위스콘신에 두개골의 나머지 부분과 뇌를 따라 이동해부 매체 (1.1) 토륨. 본래 모든 뇌 구조를 유지 마이크로 칼의 플라스틱 손잡이를 사용하여 해부 배지에서 뇌 조직을 청소한다.
8. 이 시점에서, 전체 제브라 피쉬의 뇌를 사용하여 프로토콜을 계속합니다.
   1. 또는 전체 제브라 피쉬의 뇌에서 또는 신선한 메스로 해부 telencephalon, tectum / 간뇌 나 소뇌에서 neurosphere를 생성하는 특정 뇌 영역이 프로토콜을 적용. 3도 ^11를 참조 관심있어서의 뇌 영역을 해부 신경 특정 형광 제브라 피쉬의 신경 형질 전환 라인을 사용합니다.

성인 뇌의 3 단일 세포 해리

1. 생물 안전 캐비닛에 모든 후속 작업을 수행합니다. 해부 배지 800 μl를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 뇌 조직을 전송한다 (단계 1.1에서 제조). 뇌 조직을 건드리지 않고, 피펫 팅에 의해 해부 매체를 제거합니다.
2. 파파인 용액 (단계 1.4) 500 μL를 첨가하고 10 분 동안 37 ° C에서 뇌 조직 다이제스트. 이 세포 생존 능력을 감소 수 있으므로 15 분 이상을 품어하지 마십시오.
3. 배양 후, 바닥으로부터 ~ 0.25 인치 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 절삭 15ml의 원뿔형 튜브에 파파인 용액 500 μL와 뇌 조직 옮긴다. 조심스럽게 천천히 동일한 팁 상하 10 회 피펫 팅하여 뇌 조직을 해리. 최대 피펫 이상 15 배 아래로는 세포 생존을 변경할 수 있기 때문에,이 단계에서 공기 방울을 생성하지 마십시오.
4. 미가공 1000 μL 정규 팁을 사용하여 10로 pipetting 분 뒤에 아래 10-13 시간 동안 37 ℃에서 다시 뇌 조직을 인큐베이션. 최대 피펫하지 않는 이상 15 배 아래로, 세포 사멸을 방지 할 수 있습니다.
5. 실온 (RT)에서 5 분 800 XG에 세정액 (단계 1.5), 원심 분리 2 ㎖의 세포 현탁액을 첨가하여 효소 분해를 중지. 조심스럽게들 가만히 따르다upernatant 및 1,000 μL 일반 팁와 피펫 팅에 의해 아래로 격렬하게 손가락으로 다음 튜브를 눌러 남아있는 용액에 펠렛을 재현 탁. 이어서, 세척 용액 2 ㎖를 추가한다.
6. 이 단계에서, 단일 세포 현탁액을 수득 한 현미경으로 확인한다. RT에서 5 분 동안 800 × g으로 다시 세포 현탁액을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 신선한 Z-조건 매체 (단계 1.10) 1 ㎖를 사용하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
7. 트립 판 블루 ^(12)를 사용하여 세포를 염색 블루 사균을 제외하여 혈구를 사용하여 살아있는 세포 수를 계산. 세포 현탁액 200 ㎕를 각 웰에 신선한 Z-조건 매체의 300 μL와 24 웰 플레이트를 준비합니다. ~ 500 세포 / μL의 밀도에 씨앗 세포. 제브라 뇌 유래 neurosphere를 37 ℃에서 잘 성장하지 않기 때문에, 5 % CO _2에서 30 ° C에서 항온 배양 된 세포를 유지한다.

기본 neurosphere를의 4 세대

1. 시험 관내 (DiV1)에서 일일 후 현미경 성인 뇌 전체에서 얻은 단일 세포 현탁액을 관찰 파편이 웰의 중심에 축적 여부 참고. 조심스럽게 매체의 약 100 μl를 피펫 팅하여 이물질을 제거 (가능한 경우 이하). 다음 신선한 Z-조건 매체의 100 μl를 추가합니다. 단일 세포 현탁액이 시간 (그림 2A DiV1)에서 관찰해야한다.
2. 체외에서 이일 (DIV2) 한 후, 배양 된 세포를 확장합니다. 팁 잘라 1,000 μL 피펫을 사용하여 수집하고 잘 새에 각 우물에서 세포 현탁액 250 μl를 전송합니다. 모든 우물에 신선한 Z-조건 매체의 250 μl를 추가합니다. 배양 된 세포를 확장하기 전에 잘 전반에 걸쳐 최대 피펫 팅에 의해 아래로 아주 부드럽게 정지를 균질화.
3. 반복 시험 관내에서 다음 사일 (DiV4) 4.1 및 4.2 단계를 반복합니다. neurosphere를의 크기가 점진적 증가는 VI해야한다DiV3 및 DiV4 (도 2B와 C)의 중심과 가장자리에서 잘 sible.
   주 : 기본 neurosphere를이 통로 또는 다 능성 분화를 평가하기 위해 처리 될 수있다. 대안 적으로, 이들은 분화 과정 중 특정 유전자의 역할을 특징 nucleofection 또는 리포 형질 ¹¹ 처리 될 수있다.

기본 neurosphere를 5.과 Passaging

1. 각 우물에서 조직 배양 250 μl를 제거하고 기계적으로 1 ml를 피펫으로 DiV4의 neurosphere를을 떼어 놓다. 너무 빨리 기포 형성이 세포 사멸을 증가 수 있으므로 아래 피펫하지 마십시오.
2. 혈구 세포 수를 계산하고, 24 웰 플레이트의 각 웰에 일차 배양 상등액 250 ㎕의 800 세포 / μL를 배포한다.
3. 각 웰에 Z-조건 매체의 250 μl를 추가합니다.
4. 단계 4.2에보고 된 체외에서 이일 (DIV2) 한 후, 배양 된 세포를 확장D 4.3.

기본 neurosphere를 6. 차별화

1. 10 분 동안 70 % 에탄올에 침지하여 커버 유리를 소독, 12 웰 플레이트의 각 웰에 그들을 배치하여 실온에서 건조 후 커버 유리.
2. 그것은 넓게 확장하여 전체 커버 유리를 커버 할 수있는 방식으로, 커버 유리의 중앙에 세포 외 코팅액 (단계 1.11) 300 μL를 추가한다. 이어서, (습한 세포 배양기를 사용하여)을 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
3. 배양 후 세포 코팅액을 제거하고 37 ℃에서 2 시간 동안 커버 유리를 건조.
4. 각 우물에서 조직 배양 250 μl를 제거합니다. 기계적로 pipetting 아래로 (넓은 엔드 팁) 1 ml를 피펫으로 잘 따라 모든 DiV4 차 neurosphere를을 떼어 놓다.
5. 종자는 미리 제조 외 기질 코팅 coverglasses 4 × ¹⁰³ 세포 / ml의 세포 밀도 (6.1-6 단계에서 neurosphere 세포 현탁액 해리.3) 기판에 부착 될 _때까지, 5 % CO _2, 30 ℃에서 적어도 30 분 동안 유지한다. 이어서, 배지를 제거하고 빠르게 5 % CO _2에서 30 ° C에서 24 시간 동안 세포를 배양하기 전에 예열 신선한 Z 분화 조건 배지 (단계 1.9) 1 ㎖를 추가한다.
6. 모든 이틀, 세포 분화의 시간 동안 Z-분화 조건 매체의 절반을 교체합니다.

기본 neurosphere를 7. 유전자 조작

1. 4 ° C에서 80 x g에서 8 분 동안 원심 분리하여 DiV3-4 차 neurosphere를 (단계 4.3)를 수집합니다. 상업 oligonucleoatides의 리포좀 형질 전환 준비는 previouly ¹¹ DNA 플라스미드 벡터의 nucleo - 형질을 설명했다.
2. 반응 혼합물의 100 μL (82 μL의 nucleofactor 용액 보충 18 μL)에 4 × ¹⁰³ 세포 / μL의 세포 밀도로 재현 탁의 neurosphere 펠릿.
3. neurosphere의 suspensi 믹스(1 μg의 / μL에서 플라스미드 주식) 선택의 DNA 플라스미드 벡터의 5 μL와 함께합니다. nucleotransfection에 대한 nucleofector 큐벳에 neurosphere / DNA 혼합물을 전송하고 nucleofector 키트에서 제공하는 제조업체의 지침에 따라 프로그램을 nucleofector 선택합니다.
4. 즉시 nucleofection 후, 균체를 예열 Z 조건 배지 (1.10) 500 ㎖를 추가하고 전술 한 바와 같이, 이들 세포 재생 및 / 또는 분화 특성을 연구 형질 neurosphere를 플레이트.

결과

성인 Zebrafish의 Neurosphere 문화 일반 계획

여기에서 우리는 성인 zebrafish의 뇌에서 수행 neurosphere 형성 분석의 프로토콜의 모든 단계를 설명합니다. 첫째, 성인 신경 줄기 / 전구 세포는 제브라 피쉬의 뇌 전체에서 또는 telencephalon, tectum 및 소뇌 (도 1A-C) 등 여러 가지 해부하는 뇌 영역에서 하나 수집하고 있습니다. 성...

토론

이 프로토콜의 주요 목표는 신​​경 줄기 / 전구 세포의 세포 및 분자 기능 연구를위한 분리 및 배양 성인 zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를하는 것입니다. 여기, 우리는 성인 zebrafish의 뇌에서, 다 능성 신경 세포를 선택하고 세 개의 신경 세포 유형, 즉, 성상 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포를 생성하는 방법을보고합니다. 재현성 neurosphere 형성 분석은 지금까지 제브라 피쉬 년에 설립?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS 1x	Life Technologies	14190-144
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C6852-25g
B-27	Life Technologies	17504-044
N-2	Life Technologies	17502-048	N-2 supplement (100x) liquid
HEPES	Life Technologies	15630	1 M
D-(+)-Glucose 45%	Sigma	G8769
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Insulin	Sigma	I5500-50 mg
DNAse	Sigma	DN25-10mg
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Matrigel	Becton Dickinson	356234
PFA	TCI	P0018
PBS	AmericanBio	AB11072-04000
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml.
Trycold gel	Sigma	TGP8	gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit	Lonza	VPI-1004
Trypan blue stain	Life Technologies	15250061