Выделение и культура взрослых данио мозга, полученных из нейросферах

Резюме

Здесь мы предлагаем воспроизводимый метод для изучения нейрогенез с использованием анализа нейросфера, полученную из целого мозга или от или конечного мозга, tectal или мозжечка областей взрослых данио мозга. Кроме того, мы опишем процедуру манипулировать экспрессии генов в данио нейросферах.

Аннотация

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Введение

Млекопитающие нервные стволовые клетки (NSC , ) были охарактеризованы в пробирке их способности расти в свободно плавающих культур как кластеры делящиеся клетки называются нейросферы ^1. В присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF), NSC , делят либо симметрично , чтобы генерировать самообновлению NSCs, или асимметрично , чтобы генерировать два разных дочерних клеток, то есть., Дифференцирующим клеток - предшественников и новый НСК. Поэтому нейросфера культуры представляют собой смесь нервных стволовых клеток / клеток- предшественников и более дифференцированных нервных клеток ^2-4 NSC , может, тем не менее, следует отличать от других типов клеток нейросфера двумя специфическими свойствами:. Они показывают долгосрочное самообновление в FREE- плавающей культур , и они могут дифференцироваться во все нейронных клеточных клонов (то есть, нейроны, астроциты и олигодендроциты) после снятия факторов роста и адгезии к внеклеточного матрикса подложках. В MAMMALS, система нейросфера культура была первая система в пробирке используется для демонстрации присутствия NSCs во взрослом мозге и остается наиболее часто используемым инструментом для анализа пролиферации, способность самообновления и мультипотентность нервных стволовых клеток и клеток - предшественников. Поэтому, несмотря на то, сфера формирования анализы страдают от некоторых недостатков и ограничений ^4, эта система культуры является ценным для оценки потенциала клетки , чтобы вести себя как стволовые клетки при извлечении его из своей ниши в естественных условиях ⁴ и играет важную роль в определении ключевых регуляторов НСК самообновлению и клеточной судьбы определения ^5-7.

В отличие от млекопитающих, которые имеют ограниченный нейрогенез, данио конститутивно производят новые нейроны вдоль всей оси мозга на протяжении всей их жизни. Данио мозг взрослого человека показывает множественные нейрогенные нишах укрывательство нервных стволовых / клеток-предшественников делает Zebrafish мощную модель организма для понимания тон стволовых активность клеток в головном мозге, а также молекулярные программы, необходимые для регенерации центральной нервной системы. За последние 17 лет, несколько исследовательских групп разработаны методики выделения и культивирования данио нервных клеток ^8,9. Эти исследования были направлены на получение эмбриональных нейронов и глиальных клеток в пробирке, но не при поддержании NSCs и исследовать их свойства. Хотя нейросферы были сформированы во взрослом Apteronotus leptorhynchus (Brown Дух Knifefish) ^10, A нейросфера формирования анализа в данио осталось установить.

Здесь мы опишем нейросфера формирования анализа , чтобы продемонстрировать роль микроРНК-107 во время данио нейрогенез ^11. Протокол позволяет: 1) совокупность взрослых нервных стволовых клеток / клеток-предшественников либо из данио всего мозга или из нескольких вскрытых областей мозга, таких как телэнцефалона, тектуме и мозжечка; 2) генерация фли с плавающей самообновляющихся нейросферы из взрослых клеток нервных стволовых / прогениторных; 3) понижающего и повышающей регуляции экспрессии генов , кодирующих или малых некодирующих РНК ¹¹ в нейросферах, для того , чтобы исследовать их роль в пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток / клеток - предшественников.

протокол

Данио штамма WT ^CF были подняты и поддерживается в соответствии с протоколами , утвержденными Institutional Animal Care и использование комитета Йельского университета (IACUC номер протокола 2012-11473) путем. Все эксперименты должны быть сначала одобрены всеми соответствующими правительственными и институциональными этики регулирующих органов в отношении использования животных в исследовательских целях.

1. Подготовка

1. Приготовьте 10 мл рассечение среды, добавляют 200 мкл 100x пенициллина-стрептомицина в 9,8 мл DMEM / F12.
2. Готовят L-цистеин раствора: 10 мл воды для культуры ткани, добавляют 120 мг L-цистеина. Хранить L-цистеин раствор при температуре 4 ° С в течение до 2-х недель, или в аликвотах при -20 ° С в течение до 1 года.
3. Приготовьте раствор ДНКазы I: к 1 мл воды для культуры ткани, добавляют 10 мг ДНКазы I. Храните I раствор ДНКазы при 4 ° С в течение до 2-х месяцев.
4. Приготовьте папаин решение: подготовить папаин Solutиона, добавьте 100 мкл папаина (примерно 140 единиц), 100 мкл ДНКазы I (1%) и 200 мкл L-цистеин (12 мг / мл) в 5 мл DMEM / F12. Свеже подготовить папаин Solution каждый раз, когда и стерилизовать с фильтром с размером пор 0,22 мкм перед использованием.
5. Приготовьте моющий раствор: для приготовления 100 мл промывочного раствора, добавляют 650 мкл 45% глюкозы, 500 мкл HEPES 1 М и 5 мл FBS в 93.85 мл DPBS 1x. Стерилизация моющего раствора с фильтром с размером пор 0,22 мкм перед использованием. Храните моющий раствор при 4 ° С в течение до 2-х месяцев.
6. Готовят раствор инсулина: подготовить 2 мл раствора инсулина, добавить каплю 25 мкл 10 N NaOH и 100 мг инсулина в 2 мл воды для культуры тканей.
7. Готовят EGF и FGF решения: Растворить как митогены в DMEM / F12 при 100 мкг / мл концентрацию. Хранить в 10 мкл аликвоты при -20 ° С.
8. Подготовка B-27 и N-2 СМИ: магазин B-27 и N-2 добавки при -20 ° С до 500 мкл и 1 мл аликвоты, respectivEly.
9. Приготовьте Z-дифференцирование состояние среды: подготовить 100 мл Z-дифференциации условий среды, добавляют 40 мкл инсулина (50 мг / мл), 500 мкл B-27, 1 мл N-2, 650 мкл глюкозы на 45% и 1 мл 100 х пенициллин-стрептомицина в 97,81 мл DMEM / F12. Стерилизовать Z-дифференциацию состояние среды с фильтром с размером пор 0,22 мкм перед использованием. Храните Z-дифференциацию состояние среды при 4 ° С в течение до 1 недели.
10. Приготовьте Z-состояние среды: подготовить 50 мл Z-состояния носителя, добавляют 10 мкл EGF и 10 мкл FGF в 50 мл стерильной Z-дифференциации условий среды (20 нг / мл). Храните Z-состояние среды при 4 ° С в течение до 1 недели.
11. Приготовьте раствор для покрытия для дифференциации культуры: по 5 мл внеклеточного раствора для покрытия, добавляют 100 мкл раствора внеклеточной матрицы в 4,9 мл DMEM / F12 (например, Матригель.). Оттепели внеклеточный раствор матрицы при температуре 4 ° С на льду. После того, как размораживать, хранить при температуре 4 ° С для ир 2-х недель.

2. Препарирование мозга взрослых данио

1. Подготовка рассечение постели, заполнив 100 мм х 15 мм чашки Петри с помощью гель-пакеты со льдом. Затем поместите крышку на чашку Петри и не инкубировать при температуре -20 ° С до замерзает геля. На верхней части крышки места квадрат чистой фильтровальной бумаги и обернуть как фильтровальную бумагу и чашки Петри с помощью пластиковой пленки.
2. Чистый и стерилизовать все инструменты микродиссекции от 70% этанола или тепла перед каждым использованием. Поместите все простерилизованные инструменты рассечение рядом с рассекает микроскопом и, прямо перед эвтаназии, поместите рассечение кровать под микроскопом с оптической подсветкой волокна.
3. Соберите 2 взрослых данио для всего препарата мозга нейросфера; и от 3 до 4 данио для генерации нейросферы из вскрытых областей головного мозга.
4. Эвтаназии взрослых данио (8-12 месяцев) с использованием протокола, одобренного по уходу и использованию комитета Institutional животных путем. Затем погрузить рыбу в 75% этилового спирта в течение 5-10 с и быстро разместить в секционном слое с последующей декапитации на уровне жабры с использованием хирургическим скальпелем.
   1. Для эвтаназии животных, управлять передозировку (300 мг / л) Tricaine метансульфоната до сердца бить животного постепенно замедляется и циркуляция прекращается, а затем погружают в воду со льдом.
5. Поверните голову спинной стороной вниз, и с помощью ножниц делают продольный разрез со стороны разреза до устья. С помощью щипцов обнажить основание черепа и удалить все прилегающие ткани. Обрежьте боковые стенки черепа с начала спинного мозга к тектуме.
6. Используя ножницы, вырезать и удалить зрительные нервы, а затем удалить обе стороны самой боковой части черепа на уровне тектуме. Поверните голову вентральной стороной вверх. Использование щипцов, шелушится остальную часть самой верхушечной части черепа.
7. Перенести мозг вместе с остальной частью черепа в новое блюдо Wiго рассечение среды (1.1). Очистите мозговую ткань в рассечение среде с использованием пластиковой ручкой микро ножа, сохраняя все структуры мозга нетронутыми.
8. С этой точки зрения, по-прежнему протокол, используя весь мозг данио.
   1. В качестве альтернативы адаптировать этот протокол для конкретных областей мозга, чтобы генерировать нейросферы от всего данио мозга или из телэнцефалоне, тектум / диэнцефалона или мозжечка расчлененным со свежим скальпелем. Используйте нейронную специфический флуоресцентный данио нейронную трансгенной линии рассекать область мозга проценты в соответствии с фиг.3 и ссылки ^11.

3. Single Cell диссоциация мозг взрослого человека

1. Выполните всю последующую работу в кабинете биологической безопасности. Передача ткани головного мозга в 1,5 мл пробирку, содержащую 800 мкл среды рассечение (полученного на стадии 1.1). Удалите рассечение среду пипеткой, не касаясь ткани мозга.
2. Добавьте 500 мкл раствора папаина (этап 1.4), и переваривают ткани мозга при 37 ° С в течение 10 мин. Не инкубировать дольше, чем 15 мин, поскольку это может привести к снижению жизнеспособности клеток.
3. После инкубации перенести мозговой ткани с 500 мкл раствора папаина в 15 мл коническую трубку с помощью 1000 мкл сократить пипеткой наконечник на ~ 0,25 дюйма от дна. Осторожно диссоциировать мозговую ткань, медленно пипетированием вверх и вниз 10 раз, с тем же самым кончиком. Не пипеткой вверх и вниз более чем в 15 раз и не генерируют пузырьки воздуха во время этого этапа, поскольку это может изменить жизнеспособность клеток.
4. Выдержите ткани мозга снова при 37 ° С в течение 10 мин с последующим пипетированием вверх и вниз 10-13 раз с использованием режиссерский 1000 мкл регулярного наконечника. Не пипеткой вверх и вниз более чем в 15 раз, чтобы избежать гибели клеток.
5. Остановить ферментную пищеварение путем добавления 2 мл промывочного раствора (шаг 1,5), и центрифуга клеточной суспензии при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Аккуратно перелейте Supernatant и ресуспендируют осадок в оставшемся растворе, нажав на трубку энергично с пальцем, а затем с помощью пипетки вверх и вниз с 1000 мкл регулярного наконечника. Затем добавляют 2 мл промывочного раствора.
6. На данном этапе проверки под микроскопом, который был получен суспензии отдельных клеток. Центрифуга клеточной суспензии снова при 800 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок с помощью 1 мл свежей Z-состояния среды (шаг 1.10).
7. Пятно клетки с помощью трипанового синего ¹² и подсчета живых клеток с помощью гемоцитометра путем исключения синих мертвых клеток. Готовят 24-луночный планшет с 200 мкл суспензии клеток и 300 мкл свежей Z-состояния среды в каждой лунке. Семенной клеток при плотности ~ 500 клеток / мкл. Поддерживать культивируемые клетки в инкубаторе при температуре 30 ° C в 5% CO _2, так как данио полученный из головного мозга нейросферы не очень хорошо растут при 37 ° С.

4. Генерация первичного нейросферах

1. Через 1 день в пробирке (Div1), наблюдать за клеточную суспензию , полученную от взрослого всего мозга под микроскопом и отметить ли мусор накапливается в центре колодца. Осторожно удалите мусор с помощью пипетки приблизительно 100 мкл среды (меньше, если это возможно). Затем добавьте 100 мкл свежей Z-состояния среды. Одноклеточных суспензий должны наблюдаться в это время (рис 2А див1).
2. Через 2 дня в пробирке (div2), расширить культивируемые клетки. С помощью 1000 мкл пипетки с разрезом наконечник, собирать и передавать 250 мкл клеточной суспензии из каждой лунки в новую скважину. Добавьте 250 мкл свежей Z-состояния среды во все лунки. Перед тем как расширение культивируемых клеток, гомогенизируют суспензию очень осторожно пипеткой вверх и вниз по всей скважине.
3. Повторите шаги 4.1 и 4.2 для следующих 4 дней в пробирке (div4). Прогрессивное увеличение размера нейросферах должно быть VIможные в центре и по краям колодца на div3 и div4 (рис 2B и C).
   Примечание: Первичные нейросферы могут быть обработаны для прохождения или дифференцировки для оценки мультипотентность. В качестве альтернативы, они могут быть обработаны для nucleofection или липо-трансфекцией ¹¹ , чтобы охарактеризовать роль специфических генов в процессе дифференцировки.

5. Пассирование первичного нейросферах

1. Удалить 250 мкл тканевой культуры из каждой лунки и механически диссоциируют div4 нейросферы с 1 мл пипетки. Не пипеткой вверх и вниз слишком быстро, как формирование воздушного пузыря может увеличена гибель клеток.
2. Граф клеток с помощью гемоцитометра и распределить ниже 800 клеток / мкл в 250 мкл первичного супернатанта культуры в каждую лунку 24-луночного планшета.
3. Добавьте 250 мкл Z-состояния среды в каждую лунку.
4. Через 2 дня в пробирке (div2), расширить культивируемые клетки , как сообщается в шаге 4.2d 4.3.

6. Дифференциация первичного нейросферах

1. Стерилизовать покровные стекла путем погружения в 70% этаноле в течение 10 мин, а затем сухие покровные стекла при комнатной температуре, поместив их в каждую лунку 12-луночного планшета.
2. Добавьте 300 мкл раствора для покрытия внеклеточной (этап 1.11) в центре покровного стекла таким образом, что он может расширить широко и охватывать весь покровного стекла. Затем инкубируют при 37 ° С в течение 1 ч (с использованием увлажненного для культивирования клеток-инкубатор).
3. Удалить внеклеточный раствор для покрытия, после инкубации, и высушить покровного стекла в течение 2 ч при 37 ° С.
4. Удалить 250 мкл тканевой культуры из каждой лунки. Механически диссоциируют все первичные нейросферы div4 на лунку с 1 мл пипетки (с более широкого конца наконечника) с помощью пипетки вверх и вниз.
5. Семенной диссоциированы нейросфера клеточных суспензий при плотности клеток 4 х 10 ³ клеток / мл на предварительно подготовленной внеклеточного матрикса coverglasses покрытием (шаг 6.1-6.3) и удерживать в течение не менее 30 мин, при 30 ° С в 5% CO _2, до тех пор , пока прикреплен к подложке. Затем удалите питательную среду и быстро прибавляют 1 мл подогретого свежего Z-дифференциации состояния среды (этап 1.9) перед культивированием клеток в течение 24 ч при 30 ° С в 5% CO _2.
6. Каждые два дня, заменить половину состояния среды Z-дифференцировки в течение времени клеточной дифференциации.

7. Gene Manipulation первичного нейросферах

1. Сбор DiV3-4 первичных нейросферы (этап 4.3) при центрифугировании в течение 8 мин при 80 х г при 4 ° С. Подготовка к липосомной трансфекции коммерческих oligonucleoatides , как описано Previouly ¹¹ или Núcleo трансфекции плазмидной ДНК векторов.
2. Ресуспендируют осадок нейросфера при плотности клеток 4 х 10 ³ клеток / мкл в 100 мкл реакционной смеси (82 мкл раствора nucleofactor и 18 мкл дополнения).
3. Смешайте нейросфера suspensiпо 5 мкл плазмидной ДНК векторов выбора (плазмидных запасов в количестве от 1 мкг / мкл). Перенести смесь нейросфера / ДНК в кювете для Nucleofector nucleotransfection и выберите Nucleofector программу в соответствии с инструкциями изготовителя, предоставляемые комплектом Nucleofector.
4. Сразу же после того, как nucleofection, добавьте объем 500 мл подогретого Z-состояния носителя (1.10) к клеткам и пластинчатые трансфектированных нейросферы для изучения их обновление клеток и / или свойства дифференциации, как было описано выше.

Результаты

Генеральная схема взрослых данио нейросфера культуры

Здесь мы опишем все этапы протокола в нейросфера формирования анализа выполненных из взрослых данио мозга. Во- первых, взрослые нервные клетки стволовые / предшественники, были со?...

Обсуждение

Основной целью этого протокола является, чтобы изолировать и культуры взрослых данио мозга, полученных нейросферы для изучения клеточных и молекулярных особенностей нервных стволовых клеток / клеток-предшественников. Здесь мы сообщаем о том , как выбрать мультипотентных нервных клет...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS 1x	Life Technologies	14190-144
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C6852-25g
B-27	Life Technologies	17504-044
N-2	Life Technologies	17502-048	N-2 supplement (100x) liquid
HEPES	Life Technologies	15630	1 M
D-(+)-Glucose 45%	Sigma	G8769
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Insulin	Sigma	I5500-50 mg
DNAse	Sigma	DN25-10mg
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Matrigel	Becton Dickinson	356234
PFA	TCI	P0018
PBS	AmericanBio	AB11072-04000
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml.
Trycold gel	Sigma	TGP8	gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit	Lonza	VPI-1004
Trypan blue stain	Life Technologies	15250061