בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

Summary

כאן אנו מספקים שיטה לשחזור לבחון neurogenesis למבוגרים באמצעות assay neurosphere נגזר מתוך הכלל המוח או מאחד את telencephalic, tectal או אזורים של המוח הקטן של המוח דג הזברה מבוגר. בנוסף, אנו מתארים את ההליך כדי לתפעל ביטוי גני neurospheres דג הזברה.

Abstract

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Introduction

תאי גזע עצביים יונקים (NSCs) מתאפיינים במבחנה על ידי היכולת שלהם לגדול בתרבויות "פנויות" כאשכולות של חלוקת תאים כינה ¹ neurospheres. בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו גורם גדילה פיברובלסטים (FGF), NSCs לחלק משני סימטרי ליצור NSCs עצמית חידוש, או סימטרית ליצירת שני תאים בת אחרת, כלומר., תא אב הבחנה ואת רומן המל"ל. תרבויות neurosphere ולכן הם תערובת של תאי גזע / אב עצביים תאים עצביים בדיל יותר ^2-4 NSCs עם זאת, ניתן להבחין בין תאים מסוגי neurosphere אחרים על ידי שני מאפיינים ספציפיים:. הם מציגים התחדשות עצמית לטווח ארוך חופשי צף תרבויות והם יכולים להתמיין לכל שושלות תאים עצביים (כלומר, הנוירונים, האסטרוציטים, ו oligodendrocytes) לאחר נסיגת גורמי גדילה הידבקות מצעים תאי מטריקס. בשנת mammals, מערכת תרבות neurosphere הייתה המערכת הראשונה במבחנה משמשת כדי להדגים את הנוכחות של NSCs במוח הבוגר ונשארה הכלי הנפוץ ביותר לנתח התפשטות, התחדשות עצמית קיבולת multipotency של ובתאים ו גזע עצביים. לכן, אף על פי מבחני יוצרים בתחום סובלים מכמה חסרונות ומגבלות ^4, מערכת התרבות הזאת היא בעל ערך עבור בהערכת הפוטנציאל של תא להתנהג כתא גזע כאשר ייוסר vivo ב שלה הנישה ⁴ ו כבר סייע בזיהוי רגולטורים מרכזיים של המל"ל עצמית התחדשות התא גורל קביעת ^5-7.

בניגוד ליונקים שהזמינו מוגבל neurogenesis למבוגרים, דג הזברה לייצר נוירונים חדשים constitutively לאורך ציר המוח כולו לאורך כל החיים שלהם. המוח המבוגר דג הזברה מציג מספר נישות נוירוגנית מחסה גזע עצבי / ובתאים עושים דג הזברה אורגניזם מודל עצמה להבנת tהוא גזע פעילות תא במוח כמו גם תוכניות המולקולריות הדרושים לרגנרציה מערכת עצבים מרכזית. במהלך 17 השנים האחרונות, מספר קבוצות מחקר פיתחו מתודולוגיות עבור בידוד culturing תאים עצביים דג הזברה ^8,9. מחקרים אלו נועדו לייצר נוירונים עובריים ותאי גלייה במבחנה, אך לא שמירה NSCs ולחקור את תכונותיהם. למרות neurospheres נוצר ב leptorhynchus המבוגר Apteronotus (Knifefish Ghost בראון) ^10, assay יוצרי neurosphere של דג הזברה נשאר שיוקם.

כאן אנו מתארים assay יוצרי neurosphere להפגין את התפקיד של miR-107 במהלך הנוירוגנזה דג הזברה ^11. הפרוטוקול מאפשר: 1) איסוף תאי גזע / אב עצביים למבוגרים או ממוח דג זברה כולה או מכמה אזורים במוח גזורים כגון telencephalon, את tectum, ואת המוח הקטן; 2) דור floating ו neurospheres עצמית חידוש מתאי גזע / אב מבוגר עצביים; 3) ולמטה ומעלה-רגולציה של ביטוי גנים המקודדים או RNAs ללא קידוד קטן ¹¹ ב neurospheres, על מנת לחקור את תפקידם התפשטות והבחנה של תאי גזע / אב עצביים.

Protocol

דג הזברה של זן WT ^CF הועלו ומתוחזק על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת ייל ועדת שימוש (מספר פרוטוקול IACUC 2,012-11,473). כל הניסויים לאשרו לראשונה על ידי כל מוסר ממשלתיים ומוסדיים רלוונטיים המסדירים גופים לגבי השימוש בבעלי חיים לצורכי מחקר.

1. הכנות

1. הכן 10 מ"ל של מדיום לנתיחה, להוסיף 200 μl של 100x פניצילין, סטרפטומיצין לתוך 9.8 מ"ל של DMEM / F12.
2. כן פתרון L- ציסטאין: 10 מ"ל מים עבור בתרבית רקמה, להוסיף 120 מ"ג של ציסטאין L. אחסן את הפתרון L-ציסטאין על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות, או aliquots ב -20 ° C עד 1 שנה.
3. הכן DNase לי פתרון: 1 מ"ל מים עבור בתרבית רקמה, להוסיף 10 מ"ג של DNase I. חנות הפתרון DNase אני על 4 מעלות צלזיוס עד 2 חודשים.
4. כן פתרון פפאין: להכין פפאין solutיון, להוסיף 100 פפאין μl (כ 140 יחידות), 100 DNase μl אני (1%) ו -200 μl L- ציסטאין (12 מ"ג / מ"ל) לתוך 5 מ"ל של DMEM / F12. טרי להכין הפתרון פפאין בכל פעם לעקר עם מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
5. הכן פתרון הכביסה: להכין 100 מ"ל של תמיסת כביסה, להוסיף 650 μl גלוקוז 45%, 500 μL HEPES 1 M ו -5 FBS מ"ל לתוך 93.85 מ"ל DPBS 1x. לעקר את פתרון הכביסה עם מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. אחסן את פתרון הכביסה ב 4 ° C עד 2 חודשים.
6. הכן פתרון אינסולין: להכין 2 מ"ל של תמיסת אינסולין, להוסיף טיפה 25 μl של 10 N NaOH ואינסולין 100 מ"ג ל -2 מ"ל מים עבור בתרבית רקמה.
7. הכינו פתרונות EGF ו FGF: ממיסים הן mitogens ב DMEM / F12 בריכוז 100 מיקרוגרם / מ"ל. חנות 10 aliquots μl ב -20 ° C.
8. הכן B-27 ו- N-2 מדיה: חנות B-27 ותוספי N-2 ב -20 ° C עד 500 μl ו 1 מ"ל aliquots, respectivאיליי.
9. הכן בינוני מצב Z-בידול: להכין 100 מ"ל של מדיום מצב Z-בידול, להוסיף 40 אינסולין μl (50 מ"ג / מ"ל), 500 μl B-27, 1 מ"ל N-2, 650 μl גלוקוז 45% ו 1 מ"ל של 100 x פניצילין, סטרפטומיצין לתוך 97.81 מ"ל של DMEM / F12. לעקר את מדיום מצב Z-בידול עם מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. אחסן מדיום מצב Z-בידול על 4 מעלות צלזיוס עד 1 בשבוע.
10. הכן בינוני Z-תנאי: להכין 50 מ"ל של התקשורת Z-תנאי, להוסיף 10 μl של EGF ו 10 μl של FGF לתוך 50 מ"ל של מדיום במצב סטרילי Z-בידול (20 ng / ml). אחסן את בינוני מצב Z ב 4 ° C עד 1 בשבוע.
11. כן פתרון ציפוי לתרבות בידול: עבור 5 מיליליטר פתרון ציפוי תאי, להוסיף 100 μl של פתרון מטריקס לתוך 4.9 מיליליטר של DMEM / F12 (למשל, Matrigel.). פתרון מטריקס הפשרה ב 4 ° C על קרח. לאחר ההפשרה, ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך up ל -2 שבועות.

2. Dissection של המוח למבוגרים דג הזברה

1. הכן לנתיחה למיטה על ידי מילוי 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי עם שקיות קרח ג'ל. ואז לשים את המכסה על צלחת פטרי דגירה ב -20 ° C עד קופא ג'ל. נוסף על המקום מכסה ריבוע של נייר סינון נקי לעטוף הן נייר לסנן בצלחת פטרי עם סרט פלסטי.
2. נקי לעקר את כל מכשירי microdissection ב -70% אתנול או חום לפני כל שימוש. שמים את כל המכשירים לנתיחה מעוקר ליד מיקרוסקופ לנתח, וממש לפני המתת חסד, למקם את המיטה לנתיחה תחת מיקרוסקופ עם תאורה של סיבים אופטיים.
3. אסוף דג זברה מבוגר 2 עבור הכנת neurosphere כל המוח; ו 3 עד 4 דג הזברה כדי ליצור neurospheres מאזורים המוח גזור.
4. להרדים דג זברה מבוגרת (גיל 8-12 חודשים) באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש. לאחר מכן, לטבול את הדגים 7אתנול 5% למשך 5-10 שניות ובמהירות למקם במיטה לנתיחה ואחריו עריפת ראש ברמת הזימים באמצעות סכין כירורגית.
   1. כדי להרדים חיות, לנהל ממנת יתר (300 מ"ג / ליטר) של methanesulfonate tricaine עד פעימות הלב של החיה בהדרגה מאטות את זרימת מפסיק, ואז לטבול במים קרים.
5. סובב את הצד הגבה ראש למטה, באמצעות המספריים לעשות חתך אורכים מן הצד החתוך אל הפה. באמצעות מלקחיים לחשוף את בסיס הגולגולת ולהסיר כל הרקמות הסמוכות. חותכים את קירות לרוחב הגולגולת מתחילת חוט השדרה לכיוון tectum.
6. בעזרת מספריים, לחתוך ולהסיר עצבי הראייה ולאחר מכן הסר את שני הצדדים של החלק לרוחב ביותר של הגולגולת ברמה של tectum. הפעל למעלה בצד הגחון הראש. בעזרת מלקחיים, לקלף את שאר חלק הפסגה ביותר של הגולגולת.
7. מעביר את המוח יחד עם החלק הנותר של הגולגולת לתוך wi תבשיל חדשth מדיום דיסקציה (1.1). נקו את רקמת המוח במדיום לנתיחה באמצעות ידית הפלסטיק של סכין מיקרו, שמירה על כל המבנים במוח שלם.
8. מנקודה זו, להמשיך בפרוטוקול באמצעות המוח דג הזברה כולה.
   1. לחלופין להתאים את הפרוטוקול לאזורים ספציפיים במוח כדי ליצור neurospheres ממוח דג זברה כולה או מן telencephalon, tectum / diencephalon או המוח הקטן גזור עם אזמל טרי. השתמש בקו מהונדס עצבי דג זברת ניאון ספציפי עצבי לנתח את האזור במוח של פי עניין איור 3 ו אסמכתא ^11.

3. דיסוציאציה תא בודד של המוח המבוגר

1. בצע את כל העבודה הבאה בתוך ארון בטיחות ביולוגי. מעבירים את רקמת המוח לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 800 μl של מדיום לנתיחה (מוכן בשלב 1.1). הסר את המדיום לנתיחה על ידי pipetting, בלי לגעת רקמת המוח.
2. הוסף 500 μl של פתרון פפאין (שלב 1.4) ולעכל את רקמת המוח על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אין דגירה יותר מ -15 דקות, מכיוון שזה עלול להקטין כדאיות התא.
3. לאחר דגירה, להעביר את רקמת המוח עם 500 μl של פתרון פפאין לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות חתך טיפ pipet 1,000 μl ב ~ 0.25 ס"מ מהחלק התחתון. בעדינות לנתק את רקמת המוח על ידי pipetting לאט למעלה ולמטה 10 פעמים עם אותו הקצה. אל pipet למעלה ולמטה יותר מ -15 פעמים, ואינו מייצרים בועות אוויר במהלך שלב זה, כפי שהוא יכול לשנות כדאי תא.
4. דגירה רקמת המוח שוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחריה pipetting מעלה ומטה 10-13 פעמים באמצעות קצה קבוע נימול 1,000 μl. אל pipet למעלה ולמטה יותר מ 15 פעמים, כדי למנוע מוות של תאים.
5. עצור את עיכול אנזימטי על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת שטיפה (שלב 1.5), ו צנטריפוגות ההשעיה התא ב 800 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בזהירות למזוג היםupernatant ו resuspend גלול בפתרון הנותר על ידי קשה על הצינור נמרץ עם אצבע ולאחר מכן על ידי pipetting למעלה ולמטה עם קצה קבוע 1,000 μl. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של תמיסת שטיפה.
6. בשלב זה, לבדוק תחת מיקרוסקופ כי השעית תא בודדת התקבלה. צנטריפוגה השעית התא שוב ב 800 XG במשך 5 דקות ב RT. הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולה באמצעות 1 מ"ל של מדיום חדש Z-תנאי (שלב 1.10).
7. תאי כתם באמצעות trypan ¹² כחול ולספור את תאי חיים באמצעות hemocytometer על ידי למעט תאים מתים כחולים. הכן צלחת 24 גם עם 200 μl של השעית תא 300 μl של מדיום חדש Z-תנאים בכל טוב. תאי זרע בצפיפות של ~ 500 תאים / μl. שמור על תאים בתרבית באינקובטור ב 30 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2, מאז neurospheres מוח נגזרות דג הזברה לא גדל היטב על 37 מעלות צלזיוס.

4. דור יסודי Neurospheres

1. אחרי 1 יום במבחנה (DiV1), לקיים את ההשעיה תא בודד המתקבל במוח הבוגר כולו מתחת למיקרוסקופ לציין אם פסולת שהצטברה במרכז הבאר. מוציאים בזהירות את כל הפסולת על ידי pipetting כ 100 μl של המדיום (פחות אם אפשר). לאחר מכן להוסיף 100 μl של מדיום Z-תנאים טריים. המתלים תא יחיד יש לשים לב בשלב זה (איור 2 א DiV1).
2. אחרי 2 ימים במבחנה (DiV2), להרחיב תאים בתרבית. בעזרת פיפטה 1,000 μl עם חתך קצה, לאסוף ולהעביר 250 μl של השעיה תא מבאר כל לתוך באר חדשה. הוסף 250 μl של מדיום חדש Z-תנאים לתוך כל הבארות. לפני הרחבת תאים בתרבית, homogenize ההשעיה מאוד בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה לאורך הבאר.
3. חזור על שלבי 4.1 ו -4.2 עבור הימים 4 הבאים במבחנה (DiV4). עלייה הדרגתית גודל neurospheres צריכה להיות visible במרכז וקצוות של הבאר DiV3 ו DiV4 (תרשים 2B ו- C).
   הערה: neurospheres הראשי יכול להיות מעובד למעבר או בידול להעריך multipotency. לחלופין, הם יכולים להיות מעובד על nucleofection או שאיבה-transfection ¹¹ לאפיין את התפקיד של גנים ספציפיים במהלך תהליך ההתמיינות.

5. Passaging יסודי Neurospheres

1. סור 250 μl של תרבות רקמה מכל טוב מכאני לנתק neurospheres DiV4 עם טפטפת 1 מיליליטר. אל pipet מעלה ומטה מהר מדי כמו היווצרות בועת אוויר מאי עלה מוות של תאים.
2. ספירת התאים עם hemocytometer ולהפיץ 800 תאים / μl ב 250 μl של supernatant התרבות העיקרי לבאר כל צלחת 24 באר.
3. הוסף 250 μl של מדיום Z-מצב זה טוב.
4. אחרי 2 ימים במבחנה (DiV2), להרחיב תאים בתרבית כפי שדווח בשלב 4.2ד 4.3.

בידול 6. יסודי Neurospheres

1. לעקר משקפי כיסוי על ידי טבילה 70% אתנול למשך 10 דקות, ולאחר מכן כוסות כיסוי יבשות ב RT ידי הצבת לבאר כל צלחת 12-היטב.
2. הוספת 300 μl של פתרון ציפוי התאי (שלב 1.11) במרכז הזכוכית המכסה בצורה כזו כי זה יכול להרחיב נרחב ולכסות את הזכוכית המכסה כולו. לאחר מכן, לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (באמצעות תרבית תאים חממה humidified).
3. הסר את פתרון הציפוי התאי לאחר דגירה, ולייבש את הזכוכית המכסה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
4. סור 250 μl של תרבות רקמה מכל טוב. מבחינה מכנית לנתק כל neurospheres העיקרי DiV4 לכל טוב עם טפטפת 1 מ"ל (עם קצה רחב-סוף) על ידי pipetting למעלה ולמטה.
5. זרע ניתק המתלים תא neurosphere בצפיפות תא של 4 x 10 ³ תאים / מ"ל על coverglasses מצופה מטריקס שהוכן קודם לכן (שלב 6.1-6.3) ולשמור לפחות 30 דקות, ב 30 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2, עד מצורף המצע. לאחר מכן, להסיר את המדיום תרבות במהירות להוסיף 1 מ"ל של מדיום חדש מחומם מראש מצב Z-בידול (שלב 1.9) לפני culturing התאים למשך 24 שעות על 30 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.
6. כל יומיים, להחליף מחצית בינונית מצב Z-בידול בתקופת תא differentation.

7. ג'ין מניפולציה של ראשי Neurospheres

1. אסוף neurospheres העיקרי DiV3-4 (שלב 4.3) על ידי צנטריפוגה במשך 8 דקות ב 80 x ז ב 4 מעלות צלזיוס. היכונו transfection liposome של oligonucleoatides מסחרי previouly תיאר ¹¹ או-transfection Nucleo של וקטורים פלסמיד דנ"א.
2. Resuspend גלולה neurosphere בצפיפות תא של 4 x 10 ³ תאים / μl ב 100 μl של תערובת התגובה (82 μl פתרון nucleofactor ו -18 μl של תוספת).
3. מערבבים את neurosphere suspensiעל עם 5 μl של וקטורים פלסמיד דנ"א של בחירה (מניות פלסמיד ב 1 מיקרוגרם / μl). מעבירים את התערובת neurosphere / דנ"א לתוך קובט Nucleofector עבור nucleotransfection ובחר Nucleofector התוכנית בהתאם להוראות היצרן שמספק ערכת Nucleofector.
4. מיד לאחר nucleofection, להוסיף נפח של 500 מ"ל של התקשורת מחומם מראש Z-תנאי (1.10) אל התאים צלחת neurospheres transfected ללימוד התחדשות התאים שלהם ו / או נכסים בידול, כפי שתואר לעיל.

תוצאות

כשמסתכלים על התמונה הכללית של תרבות למבוגרים דג הזברה neurosphere

כאן אנו מתארים את כל השלבים של הפרוטוקול של assay יוצרי neurosphere בצע ממוח דג הזברה המבוגר. ראשית, תאי גזע / אב עצביים למבוגרים נאספו גם ...

Discussion

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לבודד neurospheres שמופק מהמוח דג הזברה תרבות למבוגרים ללימוד התכונות תאית ומולקולרית של תאי גזע / אב עצביים. כאן אנו מדווחים כיצד לבחור תאים עצביים מולטיפוטנטיים וליצור שלושה סוגי התאים העצביים, כלומר, האסטרוציטים, נוירונים oligodendrocytes,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS 1x	Life Technologies	14190-144
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C6852-25g
B-27	Life Technologies	17504-044
N-2	Life Technologies	17502-048	N-2 supplement (100x) liquid
HEPES	Life Technologies	15630	1 M
D-(+)-Glucose 45%	Sigma	G8769
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Insulin	Sigma	I5500-50 mg
DNAse	Sigma	DN25-10mg
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Matrigel	Becton Dickinson	356234
PFA	TCI	P0018
PBS	AmericanBio	AB11072-04000
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml.
Trycold gel	Sigma	TGP8	gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit	Lonza	VPI-1004
Trypan blue stain	Life Technologies	15250061