大人のゼブラフィッシュ脳由来神経球の単離および培養

要約

ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。

要約

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

概要

哺乳動物の神経幹細胞（NSCは）分裂細胞のクラスターは、神経球^1と呼ばれるように自由に浮遊培養物中で成長する能力により、in vitroで特徴づけられています。上皮成長因子（EGF）及び線維芽細胞増殖因子（FGF）の存在下では、NSCは、すなわち 、二つの異なる娘細胞を生成するために、非対称自己再生のNSCを生成するためにいずれかの対称的に分裂し、または、分化前駆細胞および新規NSCを。ニューロスフェア培養物は、したがって、神経幹/前駆細胞とより分化した神経細胞^2-4の混合物であるNSCは、しかし、2つの特定の特性によって、他の神経球の細胞型と区別することができます。彼らは自由に長期の自己再生を表示します文化を浮遊し、それらは、細胞外マトリクス基板への成長因子の撤退と、接着以下のすべての神経細胞系統（ すなわち 、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイト）に分化することができます。 mammでALS、神経球培養系は成体脳におけるNSCの存在を示すために使用されるインビトロ系において最初であり、神経幹細胞および前駆細胞の増殖、自己再生能と多分化を分析するための最も一般的に使用されるツールのままです。したがって、球形成アッセイは、いくつかの欠点や限界⁴苦しむもかかわらず、この培養系は、そのインビボニッチ⁴から除去され、重要な調節因子を同定することに尽力してきたときに、幹細胞として振る舞うために、細胞の可能性を評価するための価値がありますNSC自己複製と細胞の運命決意^5-7の。

成体の神経発生が制限されている哺乳動物とは対照的に、ゼブラフィッシュは、構成的に、その生涯を通じて脳全体軸に沿って、新しいニューロンを産生します。ゼブラフィッシュ成体の脳は、ゼブラフィッシュにトンを理解するための強力なモデル生物を作る神経幹/前駆細胞を保有する複数の神経因性ニッチを表示します彼は、細胞、脳内の活動だけでなく、中枢神経系の再生に必要な分子プログラムを食い止めます。過去17年間で、いくつかの研究グループは、単離およびゼブラフィッシュ神経細胞^8,9を培養^するための方法論を開発しました。これらの研究は、 インビトロではなく、NSCのを維持し、その特性を調査で胚性神経細胞およびグリア細胞を産生することを目的としました。ニューロスフェアは、大人Apteronotusのleptorhynchus（ブラウンゴースト^{Knifefish）10}で生成されているが、ゼブラフィッシュにおけるニューロスフェア形成アッセイが確立されて残りました。

ここでは、ゼブラフィッシュの神経新生¹¹中のmiR-107の役割を実証するためのニューロスフェア形成アッセイを説明します。プロトコルが可能になります。1）ゼブラフィッシュの全脳から、またはそのような終脳、蓋、および小脳な​​どのいくつかの解剖脳領域からいずれかの成体神経幹細胞/前駆細胞のコレクションです。 FLの2）の生成浮動および成体神経幹/前駆細胞からの自己再生の神経球。 3）ダウンとアップレギュレーションをコードする遺伝子または小さな非コードRNAニューロスフェア中の¹¹の発現のためには、神経幹/前駆細胞の増殖および分化における役割を調査します。

プロトコル

WT ^CF株のゼブラフィッシュは、イェール大学施設内動物管理使用委員会（IACUCプロトコル番号2012から11473）によって承認されたプロトコルに従って上昇し、維持しました。全ての実験は、最初の研究目的のための動物の使用に関する遺体を規制するすべての関連する政府や機関の倫理によって承認されなければなりません。

1.準備

1. 解剖培地10mlを準備し、DMEM / F12の9.8ミリリットルに100×ペニシリン - ストレプトマイシンの200μlを添加します。
2. L-システイン溶液を調製する：組織培養のための水10ミリリットルに、L-システイン120mgのを追加します。 2週間まで4℃でL-システインソリューションを保存し、または1年まで-20℃でアリコートインチ
3. 組織培養のための水の1ミリリットルに、DNアーゼIのショップまで2ヶ月間4℃でのDNase I溶液10mgを追加：DNアーゼI溶液を準備します。
4. パパイン溶液を調製する：パパインsolutを準備しますイオンは、DMEM / F12の5ミリリットルに100μlのパパイン（約140台）、100μlのDNアーゼI（1％）と200μlのL-システイン（12 mg / mlで）を追加します。新たにパパイン溶液を毎回調製し、使用前に0.22μmの孔サイズのフィルターを用いて滅菌します。
5. 洗浄溶液を調製：93.85 mlのDPBS 1Xに650μlのグルコースを45％、500μLのHEPES、1M、5mlのFBSを追加し、洗浄溶液100mLを調製しました。使用前に0.22μmの孔径のフィルターを有する洗浄溶液を滅菌します。最大2ヶ月間4℃で洗浄液を保管してください。
6. インスリン溶液を調製する：組織培養用の水2mlに10 N NaOHおよび100mgのインスリンの25μlの液滴を追加し、インスリン溶液2mlを調製します。
7. EGFとFGF溶液を調製する：100μg/ mlの濃度でDMEM / F12の両方でマイトジェンを溶かします。 -20℃で10μlのアリコートとして保管してください。
8. 500μlの、1mlのアリコートとして-20℃で保存のB-27およびN-2は、サプリメント、respectiv：B-27、N-2メディアを準備しますエリー。
9. Z-分化条件培地を準備します、Z-分化条件培地の100ミリリットルを準備40μlのインスリン（50 mg / mlで）、500μlのB-27、1ミリリットルN-2、650μlのグルコース45％および1ミリリットルのを追加しますDMEM / F12の97.81ミリリットルに100×ペニシリン - ストレプトマイシン。使用前に、0.22μmの孔サイズのフィルタを有するZ-分化条件培地を滅菌します。 1週間まで4℃でZ-分化状態媒体を保管してください。
10. Z-条件培地を準備します、Z-条件培地の50ミリリットルを準備滅菌Z-分化条件培地の50ミリリットル（20 ngの/ ml）の中にEGFを10μlとFGFの10μlを添加します。 1週間まで4℃でZ-条件媒体に保管してください。
11. 5ミリリットル外塗布液に、DMEM / F12の4.9ミリリットルに細胞外マトリックス溶液（ 例えば 、マトリゲル。）の100μlを添加する：分化培養用の塗布液を準備します。氷の上で4℃で細胞外マトリックス溶液を解凍します。一度解凍し、uのために4℃で維持2週間のp。

大人のゼブラフィッシュの脳の2解剖

1. ゲルアイスパック100ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿を充填することにより解剖ベッドを準備します。その後、シャーレに蓋を置き、ゲルがフリーズするまで、-20℃でインキュベートします。蓋の場所の上にきれいなろ紙の正方形とプラスチックフィルムで濾紙とシャーレの両方をラップします。
2. 清潔で、各使用前に70％エタノールまたは熱により、すべての顕微解剖器具を滅菌します。解剖顕微鏡の近くにすべて滅菌解剖器具を置き、右安楽死の前に、光ファイバ照明で顕微鏡下で解剖ベッドを配置します。
3. 全脳の神経球の調製のための2大人のゼブラフィッシュを収集。 3〜4ゼブラフィッシュは、解剖脳領域からのニューロスフェアを生成します。
4. 施設内動物管理使用委員会により承認されたプロトコルを使用して、大人のゼブラフィッシュ（8-12カ月齢）を安楽死させます。次に、7で魚を浸しますすぐに5％5-10秒間エタノールおよび外科刃を用いて鰓のレベルで断頭続い解剖ベッドに置きます。
   1. 動物を安楽死させるために、動物のハートビートが徐々に遅くなり、循環が停止するまでトリカインメタンスルホン酸の過剰摂取（300ミリグラム/ L）を投与し、その後、氷水に浸します。
5. ダウンヘッドの背側を回して、ハサミを使って口にカット側から長手方向のカットをします。鉗子を使用すると、頭蓋底を露出させ、隣接するすべての組織を除去します。蓋に向かって脊髄の先頭から頭蓋骨の横方向の壁をカットします。
6. はさみを使用して、視神経を切断して除去した後、蓋のレベルで頭蓋骨の最も外側部の​​両側を削除します。頭部腹側を上に回します。鉗子を使用して、頭蓋骨の最も先端部の残りの部分をはがします。
7. 新しい皿のwiに頭蓋骨の残りの部分で脳に沿って転送します解剖培地（1.1）番目。すべてそのまま脳構造を維持し、マイクロナイフのプラスチック製のハンドルを使用して、解剖培地中の脳組織を清掃してください。
8. この点から、全体のゼブラフィッシュの脳を使用してプロトコルを続けます。
   1. あるいは、新鮮なメスで切開し、全体のゼブラフィッシュの脳から、または終脳、蓋/間脳や小脳からのニューロスフェアを生成するために、特定の脳領域に、このプロトコルを適応させます。 図3および参照¹¹によれば、関心の脳領域を分析するために、神経特異的な蛍光ゼブラフィッシュの神経トランスジェニック系統を使用してください。

成人の脳の3単一細胞解離

1. 生物学的安全キャビネット内の後続のすべての作業を実行します。解剖培地800μlのを含む1.5 mlチューブに脳組織を転送する（ステップ1.1で調製しました）。脳組織に触れることなく、ピペットで解剖媒体を削除します。
2. パパイン溶液（ステップ1.4）の500μlを添加して、10分間37℃で脳組織を消化。それは、細胞生存率を減少させることができたとして、15分以上インキュベートしないでください。
3. インキュベーション後、下から〜0.25インチ1,000μlのピペットチップカットを使用して、15ミリリットルコニカルチューブにパパイン溶液500μlで脳組織を移します。静かにゆっくりと同じチップで上下に10回ピペッティングすることにより脳組織を解離します。アップピペットと15倍以上ダウンし、それが細胞の生存率を変化させる可能性があるので、このステップの間に空気の泡を生成しませんしないでください。
4. ノーカット千μlの定期的なチップを用いてダウン10-13回ピペッティングし、続いて37℃で10分間、再び脳組織をインキュベートします。アップピペットと15回以上ダウンし、細胞死を回避するためにしないでください。
5. 室温で5分間（RT）、800×gで洗浄液（ステップ1.5）、遠心2mlの細胞懸濁液を添加することにより酵素消化を停止します。慎重秒をデカントupernatant 1,000μlの定期的な先端でピペッティングすることによっておよびダウン激しく指で、次いでチューブをタップして、残りの溶液中にペレットを再懸濁。次に、洗浄液の2ミリリットルを追加します。
6. この段階では、単一細胞懸濁液が得られたことを顕微​​鏡で確認してください。室温で5分間、800×gで再び細胞懸濁液を遠心します。上清を除去し、新鮮なZ-条件培地（ステップ1.10）の1ミリリットルを使用してペレットを再懸濁。
7. トリパンブルー¹²とを用いて、染色細胞は青色の死細胞を除くことにより、血球計数器を使用して生細胞を数えます。各ウェルに200μlの細胞懸濁液と新鮮なZ-条件培地300μlで24ウェルプレートを準備します。 〜500細胞/μlの密度でシード細胞。ゼブラフィッシュ脳由来のニューロスフェアは、37℃でよく成長しないので、5％CO ₂で30℃のインキュベーターで培養した細胞を維持します。

一次ニューロスフェアの4世代

1. in vitroでの 1日（DIV1）した後、顕微鏡下で成人の全脳から得られた単一細胞懸濁液を観察し、破片がウェルの中心部に蓄積されたかどうかに注意してください。慎重に（可能な場合はそれ以下）の媒体のおよそ100μLをピペットで任意の破片を除去します。次に、新鮮なZ-条件培地100μlを追加します。単一細胞懸濁液は、この時点（ 図2A DIV1）で観察されるはずです。
2. in vitroでの 2日間（DIV2）の後、培養細胞を展開します。先端カット1,000μlのピペットを使用して、収集し、よく新しいに各ウェルからの細胞懸濁液の250μlのを転送します。すべてのウェルに新鮮なZ-条件培地250μlのを追加します。培養細胞を拡大する前に、よく全体に上下にピペッティングすることにより、非常に穏やかな懸濁液を均質化します。
3. 繰り返しは、 インビトロで 、次の4日間（DIV4）のための4.1と4.2を繰り返します。ニューロスフェアの大きさの漸進的増加は、viのでなければなりませんDIV3及びDIV4（ 図2BおよびC）を中心とウェルの縁部でsible。
   注：一次ニューロスフェアは、通路または多分化を評価するための分化のために処理することができます。あるいは、それらは、分化プロセス中の特定の遺伝子の役割を特徴付けるためにヌクレオまたはリポフェクション¹¹のために処理することができます。

一次ニューロスフェアの5継代

1. 各ウェルからの組織培養の250μlのを削除し、機械的に1ミリリットルピペットでDIV4のニューロスフェアを解離します。気泡形成が細胞死を増加させ得るような、あまりにも急速に上下にピペットとしないでください。
2. 血球計数器で細胞をカウントし、24ウェルプレートの各ウェルに初代培養上清250μlの中に800細胞/μLを配布します。
3. 各ウェルにZ-条件培地250μlのを追加します。
4. ステップ4.2で報告されているように、in vitroで 2日（DIV2）の後、培養細胞を拡大D 4.3。

一次ニューロスフェアの6分化

1. 12ウェルプレートの各ウェルにそれらを配置することにより、室温で乾燥したカバーガラスその後、10分間、70％エタノールに浸してカバーガラスを滅菌します。
2. それは広く拡大し、全体のカバーガラスを覆うことができるようにカバーガラスの中央に細胞外コーティング液（ステップ1.11）の300μLを加えます。そして、（加湿細胞培養インキュベーターを使用して）1時間37℃でインキュベートします。
3. インキュベーション後、細胞外のコーティング溶液を除去し、37℃で2時間、カバーガラスを乾燥させます。
4. 各ウェルからの組織培養の250μlのを削除します。機械的に上下にピペッティングにより（より広いエンドチップ付き）1ミリリットルピペットでウェル当たりすべてDIV4の一次ニューロスフェアを解離。
5. 種子は、（先に調製した細胞外マトリックスでコーティングしたカバーガラス上に4×10 ³細胞/ mlの細胞密度でステップ6.1から6のニューロスフィア細胞懸濁液を解離しました。3）基板に付着するまで_{、5％CO 2}中、30℃で、少なくとも30分間保ちます。その後、培地を除去し、迅速に5％CO ₂中で30℃で24時間、細胞を培養する前に、予め温めておいた新鮮Z分化条 ​​件培地（ステップ1.9）を1ml加えます。
6. 2日毎に、細胞differentationの時間の間にZ-分化条件培地の半分を交換してください。

一次ニューロスフェアの7遺伝子操作

1. 4℃で80×gで8分間遠心分離することによりDiV3-4一次ニューロスフェア（ステップ4.3）を収集します。 previouly DNAプラスミドベクターの¹¹または核-トランスフェクションに記載されているように商業oligonucleoatidesのリポソームトランスフェクションのために準備します。
2. 反応混合物を100μl（82μlのnucleofactor液とサプリメントの18μl）を4×10 ³細胞/μlでの細胞密度で再懸濁し、ニューロスフェアのペレット。
3. 神経球をミックスsuspensi（1μgの/μlのでプラスミド株）選択肢のDNAプラスミドベクターの5μlを持つ上。 nucleotransfectionのためのNucleofectorキュベットに神経球/ DNA混合物を移し、ヌクレオキットが提供するメーカーの指示に従ってプログラムをヌクレオ選択します。
4. すぐヌクレオ後、細胞を予め温めZ条件培地（1.10）を500mlの容量を追加し、上記のように、それらの細胞の再生および/または分化の特性を研究するためのトランスフェクトされた神経球をプレート。

結果

アダルトゼブラフィッシュ神経球文化の一般的スキーム

ここでは、成人のゼブラフィッシュの脳から行っニューロスフェア形成アッセイのプロトコルのすべての手順を説明します。まず、成体神経幹細胞/前駆細胞は、ゼブラフィッシュの全脳から、またはそのような終脳、蓋および小脳（ 図1A-C）などのいく?...

ディスカッション

このプロトコルの主な目的は、神経幹/前駆細胞の細胞および分子の機能を研究するためにゼブラフィッシュの脳由来の神経球を分離し、培養大人のすることです。ここでは、成人のゼブラフィッシュの脳から、多能性神経細胞を選択し、3神経細胞型、 すなわち 、アストロサイト、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトを生成する方法を報告しています。再現性のニューロスフェア...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS 1x	Life Technologies	14190-144
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C6852-25g
B-27	Life Technologies	17504-044
N-2	Life Technologies	17502-048	N-2 supplement (100x) liquid
HEPES	Life Technologies	15630	1 M
D-(+)-Glucose 45%	Sigma	G8769
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Insulin	Sigma	I5500-50 mg
DNAse	Sigma	DN25-10mg
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Matrigel	Becton Dickinson	356234
PFA	TCI	P0018
PBS	AmericanBio	AB11072-04000
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml.
Trycold gel	Sigma	TGP8	gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit	Lonza	VPI-1004
Trypan blue stain	Life Technologies	15250061