فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح

Summary

وتستخدم على نطاق واسع النهج علم البصريات الوراثي للتلاعب النشاط العصبي وتقييم النتائج المترتبة على وظيفة الدماغ. هنا، ويرد الاسلوب الذي عليها في الجسم الحي التعبير عن منشط البصرية Channelrhodopsin، ويسمح لخارج الجسم الحي تحليل خصائص متشابك بعيدة المدى محددة والوصلات العصبية المحلية في الدوائر ذات الصلة الخوف.

Abstract

وتستخدم نهج علم البصريات الوراثي الآن على نطاق واسع لدراسة وظيفة من السكان العصبي ودوائر عن طريق الجمع بين التعبير التي تستهدف تنشيط البروتينات الخفيفة والتلاعب لاحق من النشاط العصبي من الضوء. Channelrhodopsins (س.) هي قنوات الموجبة بوابات الخفيفة وعندما تنصهر لبروتين فلوري التعبير عنها يسمح لتصور وتفعيل المتزامن لأنواع معينة من الخلايا والتوقعات محور عصبي في مناطق محددة من الدماغ. عن طريق الحقن المجسم من النواقل الفيروسية، والبروتينات الانصهار مركز حقوق الانسان يمكن التعبير عنها بشكل جوهري أو مشروط في خلايا معينة من منطقة في الدماغ تعرف، ويمكن بعد ذلك التوقعات محواري على دراستها تشريحيا ووظيفيا عبر فيفو السابقين تفعيل علم البصريات الوراثي في شرائح الدماغ. هذا الأمر أهمية خاصة عندما تهدف إلى فهم خصائص متشابك من الاتصالات التي لا يمكن تناولها مع النهج التحفيز الكهربائي التقليدية، أو في تحديد affe روايةالإيجار والربط صادر الذي كان متصورا سيئة. هنا، بعض الأمثلة لتوضيح كيفية هذه التقنية يمكن تطبيقها على التحقيق في هذه الأسئلة لتوضيح الدوائر ذات الصلة خوف في اللوزة. اللوزة هي منطقة رئيسية لاكتساب والتعبير عن الخوف، وتخزين الخوف والذكريات العاطفية. العديد من خطوط الأدلة تشير إلى أن قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) تشارك في جوانب مختلفة من اكتساب الخوف والانقراض، ولكن الربط الدقيق مع اللوزة هو مجرد بداية ليكون مفهوما. أولا، فإنه يظهر كيف فيفو السابقين تفعيل علم البصريات الوراثي يمكن استخدامها لدراسة جوانب الاتصالات متشابك بين afferents mPFC والخلايا المستهدفة في اللوزة basolateral (جيش تحرير بلوشستان). وعلاوة على ذلك، ويتضح ذلك كيف يمكن لهذا النهج علم البصريات الوراثي المجراة سابقا يمكن تطبيقها لتقييم أنماط الاتصال رواية باستخدام مجموعة من الخلايا العصبية GABAergic في اللوزة، وparacapsular مجموعة مقحم الخلية (mpITC)، على سبيل المثال.

Introduction

أدوات دقيقة لتصور وتفعيل المتزامن لاتصالات محددة بين مناطق الدماغ وأنواع معينة من الخلايا العصبية أصبحت أكثر أهمية في فهم الكامنة صحية وظيفة الدماغ ومرض دول الربط الوظيفي. من الناحية المثالية، وهذا يستلزم التحقيق الفسيولوجية من خصائص متشابك دقيقة مع الذي حدد الخلايا العصبية التواصل. هذا صحيح بصفة خاصة للاتصالات بين مناطق الدماغ التي لا يمكن الحفاظ عليها في شريحة الدماغ الحادة واحدة هذا. في الماضي، وقد تحقق هذا إلى حد كبير في تجارب منفصلة. من ناحية، ضخت استشفاف العصبية في الجسم الحي واستخدمت جنبا إلى جنب مع ضوء لاحقة أو الإلكترون المجهري تحليل الشركاء قبل وبعد المشبكي. من ناحية أخرى، عندما يتم الحفاظ على مساحات الألياف من منطقة المنشأ ويمكن الوصول إليها في إعداد شريحة، وقد استخدم التحفيز الكهربائي لتقييم آليات الاتصال متشابك مع الخلايا في المنطقة المستهدفة.

مع ظهور علم البصريات الوراثي، والتعبير المستهدفة من قنوات الموجبة للضوء بوابات، مثل Channelrhodopsins (س.) لتنصهر البروتينات الفلورية، يمكن الآن تنشيط الخلايا العصبية ومساراتها محور عصبي بينما يسمح لتصور وبعد تحليل خاص التشريحية ^{1- 4.} لأن المحاور مركز حقوق الانسان، معربا عن أن يكون حافزا حتى عندما قطعت من somata الأم ^5، فمن الممكن في شرائح الدماغ إلى: 1) تقييم المدخلات من مناطق الدماغ التي لم تكن في متناول مع التحفيز الكهربائي التقليدية، لأن مساحات الألياف لا يمكن فصلها أو مسار معين ليس معروفا؛ 2) تحديد بشكل لا لبس فيه المنطقة من أصل لالمدخلات المحددة التي تم المفترضة ولكن غير مفهومة تماما. و3) تحقيق الربط الوظيفي بين أنواع الخلايا المحددة، على حد سواء محليا والتوقعات بعيدة المدى. بسبب وجود عدد من المزايا، أصبح هذا التعيين علم البصريات الوراثي للدوائر في شرائح الدماغ واسعةلاي المستخدمة في السنوات الأخيرة، ومجموعة متنوعة من النواقل الفيروسية للتعبير عن س. fluorescently الموسومة متوفرة بسهولة من الموردين التجارية. بعض المزايا الرئيسية لتفعيل علم البصريات الوراثي على التحفيز الكهربائي التقليدية هي عدم وجود ضرر في الأنسجة نتيجة لوضع أقطاب كهربائية التحفيز، خصوصية تحفيز ألياف بسبب التحفيز الكهربائي ويمكن أيضا توظيف الألياف المرور أو خلايا أخرى مجاورة، والتحفيز السريع على قدم المساواة ودقيق زمنيا. وبالإضافة إلى ذلك، حقن المجسم من ناقلات فيروسية يمكن بسهولة أن تستهدف مناطق محددة في الدماغ ⁶ و المشروط أو خلية من نوع التعبير محددة يمكن تحقيق ذلك باستخدام التعبير لجنة المساواة العرقية التي تعتمد و / أو المروجين محدد ^7. هنا، يتم تطبيق هذه التقنية لرسم خرائط طويلة المدى ودوائر المحلية في نظام الخوف.

اللوزة هي منطقة رئيسية لاكتساب والتعبير عن الخوف، وتخزين الخوف والذكريات العاطفية ^8،9. وبصرف النظر جيئة وذهابام اللوزة، وقشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) وقرن آمون (HC)، والهياكل التي ترتبط تبادليا اللوزة، وتورط في جوانب الاستحواذ، وتوطيد واسترجاع الخوف والانقراض ذكريات ^10،11. يبدو النشاط في التقسيمات الفرعية للmPFC أن تلعب دورا مزدوجا في السيطرة على الخوف على حد سواء ارتفاع وانخفاض تنص ^12،13. يمكن أن يكون في اطار بوساطة ذلك عن طريق الاتصالات المباشرة من mPFC إلى اللوزة المخية التي من شأنها أن تتحكم في نشاط اللوزة والإخراج. لذلك، في السنوات الأخيرة، بدأت عدة دراسات في السابق تجارب شريحة الجسم الحي للتحقيق في التفاعلات متشابك بين afferents mPFC والخلايا المستهدفة المحددة في اللوزة ^14-17.

خلال التعلم الخوف والمعلومات الحسية عن المحفزات مكيفة وغير مشروطة تصل اللوزة عبر التوقعات من المناطق المهادية والقشرية محددة. اللدونة من هذه المدخلات إلى الخلايا العصبية في الجزء الجانبي (LA) من basolاللوزة ateral (جيش تحرير بلوشستان) هي آلية هامة الكامنة تكييف الخوف ^9،18. وتشير أدلة متزايدة على أن عمليات البلاستيك موازية في اللوزة تنطوي على عوامل المثبطة للسيطرة على ذاكرة الخوف ^19. مجموعة من الخلايا العصبية المثبطة مقسمة إلى كتل هي GABAergic سطي paracapsular مقحم الخلايا (mpITCs)، ولكن التواصل فيما بينها الدقيق وظيفة غير مفهومة تماما ^20-22. هنا، يتم استخدام خرائط الدوائر علم البصريات الوراثي لتقييم وارد وصادر التواصل بين هذه الخلايا وتأثيرها على الخلايا العصبية المستهدفة في اللوزة المخية، مما يدل على أن mpITCs تلقي المدخلات الحسية المباشرة من محطات التقوية المهادية والقشرية ^23. تعبيرا محددا من مركز حقوق الانسان في mpITCs أو الخلايا العصبية جيش تحرير بلوشستان يسمح رسم الخرائط من التفاعلات المحلية، وكشف عن أن mpITCs تمنع، ولكن أيضا تنشيط للطرفين من خلال الخلايا العصبية الرئيسية جيش تحرير بلوشستان، وتجعلهم في الدوائر المثبطة رواية التغذية إلى الأمام وردود الفعل التي تتحكم في فعالية النشاط جيش تحرير بلوشستان23.

Protocol

بيان الأخلاق: وكانت جميع الإجراءات التجريبية وفقا لتوجيهات الاتحاد الأوروبي على استخدام الحيوانات في البحوث وتمت الموافقة من قبل رعاية الحيوان المحلية واللجنة الاستخدام (Regierungspräsidium توبنغن، ولاية بادن فورتمبيرغ، ألمانيا) مسؤولة عن جامعة توبنغن.

1. إجراء حقن المجسم

1. إعداد أدوات معقمة (مقص، مشرط، والمشابك، وحفر، والإبر، مواد خياطة الجروح) باستخدام معقم. ترتيب أدوات معقمة والحلول الأخرى المطلوبة وإمدادات الجراحة مثل مقايضات معقمة من القطن، مطهر، معقم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4)، و H ₂ O ₂ على ثنى الجراحية المعقمة.
2. سحب بال micropipettes الزجاج لحقن (الشكل 1A، أقحم) باستخدام 3 مم واسعة مربع خيوط على مسرى مكروي الأفقي مجتذب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   ملاحظة: للحصول على حقن عميقة، يجب أن يكون تفتق القطب بما فيه الكفايةمنذ فترة طويلة للوصول إلى معظم الإحداثيات البطنية (حوالي 5 ملم؛ لالإحداثيات، انظر 1.10).
3. بريمكس 1 ميكرولتر من حل الفيروس و 0.2 ميكرولتر من حل سريع الأخضر 0.1٪ في برنامج تلفزيوني العقيمة (لرؤية أفضل من الحل في ماصة الزجاج). ملء الماصات الزجاج مع مزيج من حل الفيروس والأخضر سريع باستخدام ماصة ميكروليتر مع طرف على ما يرام (الشكل 1A، أقحم).
   يعتبر العمل مع المؤتلف المرتبطة الغدة النواقل الفيروسية (rAAV) مستوى السلامة الحيوية 1 (BSL 1) العمل ويحتاج إلى أن يقوم في بي إس إل 1 المختبر: ملاحظة. كانت rAAVs المستخدمة في هذه الدراسة (الشكل 1C): 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (المصلي 2/9) ^16؛ 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (المصلي 2/9) ^23؛ 3) mpITC / جيش تحرير بلوشستان: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (المصلي 2/1) ²³
4. تخدير الماوس باستخدام آلة التخدير الحيوانات الصغيرة (الأيزوفلورين: 3٪ في الأكسجين لتحريض).
   ملاحظة: الفئران المستخدمة في هذه الدراسة كانت 4 -7 أسابيع من العمر والسلالات والطرز التالية: C57Bl6 / J النوع البري (تجربة في أرقام 2A و 3A-D)؛ GAD67-GFP ²⁴ (التجربة في أرقام 2B و3E-H)؛ Tac2-لجنة المساواة العرقية ²⁵ (التجربة في أرقام 2C و3I-J).
5. حلق الرأس بين الأذنين والعينين. تطبيق مطهر (providone اليود القائم) إلى حليق الرأس باستخدام قطعة قطن.
6. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء التخدير. تحت الجلد حقن الفأر مع مسكن (القائم على ميلوكسيكام، 0.1 مل من 5 ملغ / مل حل).
7. ضع الماوس في إطار المجسم (الشكل 1A) والحفاظ على التخدير عن طريق قناع غازات التخدير (الأيزوفلورين: 2٪ في الأكسجين للصيانة). تحقق عمق التخدير باستخدام انسحاب الطرف المنعكس قبل المتابعة.
   ملاحظة: الحفاظ على ظروف معقمة وكذلك ممكن خلال العملية الجراحية بأكمله؛ ارتداء قناع الوجه القابل للتصرف، الذهاب الجراحيةسفل، وقفازات.
8. جعل شق الجلد في أعلى الرأس باستخدام مقص. سحب الجلد بلطف إلى الجانب باستخدام الملقط حادة، مع تحديد المشابك لفضح سطح الجمجمة، والجمجمة نظيفة مع H ₂ O _2.
9. مواقع الحقن علامة على الجمجمة باستخدام غرامة غيض علامة وحفر ثقوب دائمة لكل من نصفي الكرة الأرضية (الشكل 1B). إحداثيات الحقن في هذه الدراسة (من Bregma (مم)): mPFC: الأمامي 1.9 الجانبية ± 0.3، 2.1 بطني. MGM / PIN: الخلفية 3.0 الجانبية ± 1.8، 3.8 بطني. mpITC / جيش تحرير بلوشستان: الخلفي 1.45، 3.35 ± الوحشي، وبطني 4.75.
10. جبل ماصة زجاجية مملوءة على إطار المجسم اتصال إلى جهاز حقن الضغط وتقديم ماصة للموقف Bregma.
11. قطع غيض من ماصة الزجاج باستخدام ملقط غرامة مستقيم الحافة. هل هذا بلطف لمنع توليد الهباء الجوي من حل الفيروس. تأكد من غيض ماصة مفتوح من خلال تطبيق عدد قليل من البقول ضغط ومراقبة قذف قطرات من فيروالصورة الحل.
12. انتقل إلى إحداثيات حقن المطلوب وحقن نصف محتوى ماصة (~ 0.5 ميكرولتر) باستخدام الإعدادات التالية على جهاز حقن الضغط: الضغط: 20 رطل، ومتوسط ​​طول النبض: 30 مللي ثانية، ومتوسط ​​عدد النبضات: 50.
13. ترك ماصة في مكان ~ 1 دقيقة قبل ببطء (1 مم / دقيقة) يتراجع ذلك.
    ملاحظة: تأكد لا يتم حظر على يقين ماصة قبل تكرار العملية مع نفس ماصة على نصف الكرة الأرضية الآخر. في حالة طرف المحظورة، نظيفة أو قطع طرف وموقف ماصة صفر في Bregma مرة أخرى.
14. الجمجمة نظيفة مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4)، وإزالة المشابك، بلطف سحب الجلد معا، وخياطة الجرح مع الفردية خياطة زر (3-4 عقدة). تطبيق مطهر (providone اليود القائم) حول الجرح.
15. وقف التخدير ولا تترك الماوس غير المراقب حتى يتم مستيقظا تماما. الحفاظ يقع فندق واحد أو العودة إلى صحبة الحيوانات الأخرى فقط عندما تعافى تماما. بعد العمل الجراحي، ومواصلة مراقبة الوضع الصحي، واداريةثالثا مسكن إذا لزم الأمر. اتبع الإجراءات وفقا للقواعد التي طرحتها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المحلية.

2. إعداد شرائح الحادة

1. إعداد ACSF، وقطع حل، أدوات (مقص، مشرط، ملقط، ملعقة، ماصة باستير)، وكتل آغار.
   ملاحظة: 1 لتر من الاصطناعي الدماغية الشوكي السائل (ACSF) مطلوب في التجربة، وأنها مستعدة عن طريق إذابة المواد الكيميائية في المقطر المزدوج-H ₂ O كما نشرت سابقا ^16،23. يتم تحضير محلول القطع من خلال استكمال 200 مل من ACSF مع 0.87 مل من 2 M MgSO ₄ الحل الأسهم.
2. ACSF الأوكسجين والحل القطع في كافة مراحل التجربة مع 95٪ O ₂ و 5٪ CO _2.
3. تخدير عميق ماوس باستخدام آلة التخدير الحيوانات الصغيرة باستخدام الأيزوفلورين (3٪ في الأكسجين). تحقق عمق التخدير باستخدام انسحاب الطرف المنعكس قبل المتابعة.
4. قطع رأس فأر باستخدام مقص كبير والبرد فورارئيس في حل قطع الجليد الباردة.
5. الجمجمة مفتوحة من شق خط الوسط واحد من الذيلية إلى منقاري، ودفع بلطف قطعة من الجمجمة إلى الجانبين باستخدام ملقط. بسرعة إزالة الدماغ عن طريق رفع برفق خارج الجمجمة باستخدام ملعقة صغيرة مدورة. قطع المخيخ مع مشرط. وضع الدماغ في حل قطع الجليد الباردة.
6. لمواقع الحقن mPFC: قطع الجزء الأمامي من الدماغ (التي تحتوي على mPFC) باستخدام مشرط ووضعها في محلول قطع الجليد الباردة حتى تشريح.
7. إزالة حل القطع الزائد مع ورقة الترشيح والغراء الجزء الخلفي من الدماغ على خشبة المسرح vibratome.
8. لشرائح اللوزة إمالة، الغراء الدماغ على خفض كتلة آغار (4٪) عند 35 درجة زاوية (1D الشكل، وسط). لشرائح اللوزة الاكليلية، مواقع الحقن MGM / PIN ومواقع الحقن mPFC، الغراء الدماغ مباشرة على خشبة المسرح (1D الشكل، اليسار واليمين). وضع كتلة آغار إضافي وراء الدماغ للاستقرار أثناء تقطيع.
9. PLACالمرحلة الإلكترونية في قطع الغرفة مع الحل قطع الاوكسيجين الجليد الباردة التي يتم الاحتفاظ في 4 درجة مئوية باستخدام وحدة التبريد. تحضير شرائح الحادة للاللوزة (320 ميكرون) باستخدام شفرة الياقوت. وضع شرائح في غرفة واجهة المتوفرة مع ACSF الاوكسيجين في RT.
10. بعد إعداد شرائح اللوزة الحادة، ووضع غرفة واجهة في بالحمام المائي في 36 درجة مئوية لاسترداد شرائح ل35 - 45 دقيقة. وفي وقت لاحق، والعودة غرفة اجهة لRT. للتسجيل من هذه الشرائح، تابع الخطوة 3.2.
11. أثناء بدء خطوة 2.10، وقطع شرائح من مواقع الحقن كما هو موضح من قبل لشرائح اللوزة الحادة (الخطوات 2،8-2،9). ليس مطلوبا استرداد شرائح في بالحمام المائي هنا. اختياري: لتقدير بسرعة موقع الحقن، ومراقبة شرائح على المجسام مجهزة مصباح الفلورسنت وأجهزة تصفية مناسبة.
12. إصلاح شرائح تحتوي على مواقع الحقن لتحليل ما بعد مخصصة من قبل يقحم عليها بين أوراق الترشيح وsubmerجينج لهم في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني حل O / N. لتحليل مواقع الحقن المضي قدما في خطوة 4.1.

3. التصور وتحفيز ألياف قبل المشبكي

1. إعداد المجهر التصحيح لتفعيل علم البصريات الوراثي من الألياف والخلايا:
   1. توسيط الصمام الثنائي ضوء ينبعث منها شنت (LED) على مسار تسليم خفيفة.
   2. قياس شدة الضوء LED في المستوى البؤري الظهر وفي إخراج كل هدف مع السلطة متر اختيار الطول الموجي المناسب من 470 نانومتر.
   3. حساب شدة الضوء في ميغاواط / مم ² وإنشاء منحنى المعايرة (كثافة LED (٪) مقابل ناتج الضوء (ميغاواط / مم ²⁾⁾ لكل هدف من الأهداف عن القيم المقاسة عن 470 نانومتر الطول الموجي.
2. استرداد شريحة اللوزة الحادة من غرفة واجهة ومكان في الغرفة شريحة التي شنت على المجهر تستقيم مجهزة مصباح الفلورسنت. احرص على وضع شريحة من هذا القبيل أن SLICالبريد سطح تواجه صعودا في غرفة واجهة يواجه أيضا صعودا في غرفة تسجيل. يروي شريحة مع الطازجة، ASCF الاوكسيجين بمعدل 1-2 مل / دقيقة عند درجة حرارة ~ 31 درجة مئوية.
3. مراقبة الألياف قبل المشبكي في شريحة باستخدام مصباح الفلورسنت بالاشتراك مع مجموعات مرشح المناسبة لببروتين معين التعبير عنها. استخدام الهدف 5X للحصول على نظرة عامة (الشكل 1E)، و60X الهدف لتقييم كثافة الألياف داخل المنطقة المستهدفة.
   ملاحظة: للحصول على GFP و YFP، واستخدام تصفية مجموعة "الخضراء" (الإثارة 472/20، مقسم الأشعة 495، انبعاث 490 ليرة لبنانية) لmCherry استخدام فلتر ضبط "الأحمر" (الإثارة 560/40، مقسم الأشعة 585، انبعاث 630/70) كما هو محدد في الجدول المواد / المعدات.
4. فتح أو تقييد فتحة في ضوء مسار المجهر النحو المرغوب فيه للتجربة (الشكل 2D).
5. للحصول على تسجيل التصحيح، وملء ماصة التصحيح مع الحل الداخلي وجبل طحامل القطب ن. تطبيق الضغط الايجابي على ماصة التصحيح وخفض ببطء لأول مرة في حل حمام ثم تحت المراقبة البصرية في شريحة باستخدام micromanipulator.
   1. الاقتراب من الخلايا العصبية في المصالح مع ماصة التصحيح من جانب وأعلى. الافراج عن الضغط الايجابي عندما ماصة هو على سطح الخلية (مرئية الدمل على سطح الخلية) والحصول على "gigaseal" عن طريق الضغط السلبي.
   2. تطبيق مزيد من الشفط لتمزق غشاء التصحيح للحصول على تسجيل خلية كاملة. وفي وقت لاحق، وتحفيز ألياف المسمى مع الصمام مرتبطة باستخدام الطول الموجي المناسب لتفعيل لجنة حقوق الإنسان (470 نانومتر) في حين تم تسجيل الاستجابات الكهربائية من الخلية.
   3. لتحفيز متشابك تبدأ مع الصمام كثافة منخفضة وزيادة حتى يتم الوصول إلى السعة الحالية متشابك المطلوب. تحريك الصمام عن طريق تكوين مخرجات الرقمية في البرنامج الحصول على البيانات للسيطرة على توقيت ونبض طول (الأمثلة في الشكل3).
      ويمكن استخدام برامج أخرى و / أو توليد TTL أجهزة لتحريك الصمام: مذكرة.
6. كرر التحفيز مع فتح أو المقيدة الفتحة (الخطوة 3.4) في ضوء مسار المجهر النحو المرغوب فيه للخلية سجلت المقبلة و / أو في وجود أدوية محددة.
7. بعد تسجيل، وتحديد شرائح لتحليل ما بعد مخصصة من قبل يقحم عليها بين أوراق الترشيح وغمر لهم في 4٪ PFA O / N.
8. تحليل البيانات الكهربية.
   ملاحظة: استخدام البرمجيات المناسبة لتصور البيانات الاجتياح المسجلة لكل فرد التحفيز حاليا. عند تحليل آثار المخدرات، استخدم للكشف عن الروتين الذروة للحصول على مدار الساعة من تأثير المخدرات على سعة الحالية متشابك لجميع الاحتلالات الفردية. تحديد متى يصل تأثير المخدرات حالة مستقرة. لإعداد متوسط ​​الاستجابات التمثيلية للشخصيات، استخدام البرنامج لمتوسط ​​≥10 الاحتلالات الفردية لكل حالة تجريبية (راجع الشكل 3B-D، FH، J اللوحة اليمنى).
   ملاحظة: عدة حزم البرمجيات بديلة يمكن استخدامها لتحليل البيانات.

4. بعد خاص تحليل مواقع حقن

1. تغسل شرائح من مواقع الحقن (من الخطوة 2.12) وتسجيل المواقع (إذا كان المطلوب هو إعادة التصوير، من الخطوة 3.7) ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني. ويتم ذلك عن طريق استبدال مرارا وتكرارا الحل مع برنامج تلفزيوني جديد على شاكر الدورية ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة.
2. إعداد 2٪ محلول الآجار في برنامج تلفزيوني، وندعه يبرد إلى ~ 65 درجة مئوية. مكان شرائح مسطحة على الجزء السفلي من الصغيرة 30 مم طبق بتري قطر، تضمين شرائح في أجار أجار وندعه يبرد حتى الصلبة.
3. الغراء كتلة أجار مع شريحة جزءا لا يتجزأ أو شرائح لمرحلة من مراحل vibratome ووضع مرحلة في قطع الغرفة مع برنامج تلفزيوني.
4. بتر جزءا لا يتجزأ من شرائح إلى 70 ميكرون سمك. اختياري: بعد resectioning، يمكن أن تكون ملطخة شرائح، أي مع Neurotrace للكشف عن التهندس الخلوي (الشكل 3A، C)، و / أو بذ تلطيخ المناعي للYFP أو mCherry لتعزيز إشارة من انصهار بروتين مركز حقوق الانسان.
5. شرائح جبل على الشرائح وساترة مع وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. مواقع الحقن صورة و، إذا رغبت في ذلك، أيضا شرائح صورة تحتوي على الألياف في مناطق الإسقاط باستخدام مجهر فلوري أو متحد البؤر ليزر المسح المجهر (الشكل 2A-C).

النتائج

وهذا المقطع يبين سير العمل نهج علم البصريات الوراثي خارج الحي ونتائج ممثلة من استراتيجيات تجريبية مختلفة للتحقيق في الخصائص الفيزيولوجية من التوقعات الحسية وتغييري بعيدة المدى لجيش تحرير بلوشستان والخلايا العصبية mpITC وكذلك خصائص الاتصال الم...

Discussion

يصف هذا البروتوكول وسيلة لخارج الحي التحقيق علم البصريات الوراثي من الدوائر العصبية والربط المحلية التي يمكن تنفيذها بسهولة على معظم، إن لم يكن كلها، تستقيم شريحة تسجيل التصحيح، المشبك الاجهزة عن طريق تزويدهم مع ~ 470 نانومتر LED في ميناء ضوء epifluorescence. والميزة الر?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgery
Stereotactic frame	Stoelting, USA	51670	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor	Stoelting, USA	51625	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice	Stoelting, USA	50264	no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer	Toohey Company, USA	T25-2-900	other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries	World Precision Instruments, Germany	1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo	Eickemeyer, Germany	213261
DC Temperature Controler and heating pad	FHC, USA	40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000	Sutter Instruments, USA	P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75	Melag, Germany	08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)	Penn Vector Core, USA	AV-1-20298P
fast green	Roth, Germany	0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)	CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine)	Purdure Products, USA	BSOL32	can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)	Boehringer Ingelheim, Germany		can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment	Bayer, Germany	0191	can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)	Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle	Fine Science Tools, Germany	12050-01
Braided Silk Suture	Fine Science Tools, Germany	18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	for composition see references #16 and #23
internal patch solutions	for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate	Roth, Germany	P027.1	prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V	Fisher Scientific, Germany	920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65	Fisher Scientific, Germany	770180
Sapphire blade	Delaware Diamond Knives		custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16	Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Canada	2012-12699
Patch microscope, BX51WI	Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier	Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A	Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10	Molecular Devices, USA		used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05	Luigs & Neumann, Germany	200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25	Luigs & Neumann, Germany	210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7	Luigs & Neumann, Germany	200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes	World Precision Instruments, Germany	GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber	Satorius Stedim Biotech, Germany	13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE	CoolLED, UK	244-1400	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, UK	pE-ADAPTOR-50E	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470	Rapp Optoelectronic	L70-000	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter	Rapp Optoelectronic	inquire with company	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation)	AHF, Germany	F49-560	Filters can be bought as set F46-008
(beamsplitter)	AHF, Germany	F48-585	Filters can be bought as set F46-008
(emission)	AHF, Germany	F47-630	Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation)	AHF, Germany	F39-472	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(beamsplitter)	AHF, Germany	F43-495W	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(emission)	AHF, Germany	F76-490	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter	Coherent, USA	1098293
IgorPro Software, Version 6	Wavemetrics, USA		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Neuromatic suite of macros for IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA)	Roth, Germany	0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain	Invitrogen	N-21479
agar-agar for embedding and resectioning	Roth, Germany	5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding	SPL Life Sciences		alternatives can be used
Slides, Super Frost	R. Langenbrinck, Germany	61303802	alternatives can be used
cover slips	R. Langenbrinck, Germany	3000302	alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium	Vector Laboratories, USA	H-1000	alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation	Satorius Stedim Biotech, Germany	11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710	Zeiss, Germany