Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Zusammenfassung

Optogenetische Ansätze sind weit verbreitet zu manipulieren neuronale Aktivität und bewerten die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion verwendet. Hier wird eine Technik erläutert , dass bei in - vivo - Expression des optischen Aktivator Channelrhodopsin, ermöglicht eine ex vivo Analyse der synaptischen Eigenschaften bestimmter großer Reichweite und lokale neuronale Verbindungen in Angst bezogenen Schaltungen.

Zusammenfassung

Optogenetische Ansätze sind heute weit verbreitet durch die Kombination gezielte Expression von lichtaktivierten Proteine ​​und die anschließende Manipulation der neuronalen Aktivität die Funktion neuronaler Populationen und Schaltungen, die durch Licht zu studieren verwendet. Channelrhodopsinen (CHRS) sind lichtgesteuerter Kationenkanäle, und wenn ihre Expression ermöglicht die Visualisierung und gleichzeitige Aktivierung spezifischer Zelltypen und deren axonale Projektionen in definierten Bereichen des Gehirns zu einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Via stereotaktische Injektion von viralen Vektoren, ChR Fusionsproteine ​​konstitutiv werden können oder bedingt in spezifischen Zellen eines bestimmten Gehirnregion zum Ausdruck gebracht, und ihre axonalen Projektionen können anschließend anatomisch und funktionell mit Hilfe von Ex - vivo - optogenetische Aktivierung in Hirnschnitten untersucht werden. Dies ist von besonderer Bedeutung während des Zielens synaptischen Eigenschaften der Verbindungen zu verstehen, die nicht mit herkömmlichen elektrischen Stimulations Ansätzen angegangen werden können, oder bei der Identifizierung von neuen AffeMiete und ableitende Konnektivität, die bisher kaum verstanden wurde. Hier einige Beispiele veranschaulichen, wie diese Technik angewendet werden kann, um diese Fragen zu Aufklären Angst bezogenen Schaltungen in der Amygdala zu untersuchen. Die Amygdala ist eine Schlüsselregion für den Erwerb und die Expression von Angst und Speicherung von Angst und emotionale Erinnerungen. Viele Beweislinien legen nahe, dass die medialen präfrontalen Kortex (mPFC) in verschiedenen Aspekten der Angst Erfassung beteiligt und Extinktion, aber seine genaue Konnektivität mit der Amygdala beginnt gerade zu verstehen. Zuerst wird gezeigt , wie ex vivo optogenetische Aktivierung verwendet werden können Aspekte der synaptischen Verbindung zwischen mPFC Afferenzen und Zielzellen in der basolateralen Amygdala (BLA) zu studieren. Ferner ist dargestellt , wie diese ex vivo optogenetische Vorgehensweise angewendet werden kann , um neue Konnektivitätsmuster unter Verwendung einer Gruppe von GABA - ergen Neuronen in der Amygdala, dem paracapsular interkalierten Zellcluster (mpITC) als Beispiel zu bewerten.

Einleitung

Präzise Werkzeuge zur Visualisierung und gleichzeitige Aktivierung von spezifischen Verbindungen zwischen den Gehirnbereichen und bestimmten Arten von Neuronen werden immer wichtiger, um die funktionelle Konnektivität zugrunde liegende gesunde Gehirnfunktion und Krankheitszuständen zu verstehen. Idealerweise führt diese physiologische Untersuchung der genauen synaptischen Eigenschaften, mit denen identifiziert Neuronen kommunizieren. Dies gilt insbesondere für Verbindungen zwischen Gehirnbereichen, die nicht in einer einzigen akuten Hirnschnitt erhalten werden kann. In der Vergangenheit wurde dies in getrennten Experimenten weitgehend erreicht. Zum einen injizierten neuronalen Tracern in vivo wurden mit anschließender licht- oder elektronenmikroskopische Analyse der prä- und postsynaptischen Partnern kombiniert eingesetzt. Auf der anderen Seite, wenn Faserbahnen aus der Herkunftsregion erhalten sind und zugänglich im Schnittpräparat wurde eine elektrische Stimulation verwendet synaptischen Kommunikationsmechanismen mit Zellen in der Zielregion zu beurteilen.

Mit dem Aufkommen von Optogenetik, die gezielte Expression von lichtgesteuerten Kationenkanäle wie Channelrhodopsine (CHRS) an fluoreszierenden Proteinen fusioniert, ermöglicht nun die Aktivierung von Neuronen und ihrer axonalen Trajektorien während es für ihre Visualisierung und post-hoc - Analyse anatomischer ^{1- 4.} Weil chr-exprimierenden Axone sogar stimuliert werden kann , wenn von den Eltern somata ⁵ durchtrennt, ist es möglich , in brain slices: 1) Eingänge von Hirnregionen beurteilen , die nicht zugänglich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation waren, weil Faserbahnen nicht trennbar oder der spezifische Trajektorie ist nicht bekannt; 2) eindeutig die Herkunftsregion für bestimmte Eingaben zu identifizieren, die postuliert, wurden aber nicht vollständig verstanden; und 3) untersuchen die funktionelle Konnektivität zwischen definierten Zelltypen, sowohl lokal als auch in langfristigen Projektionen. Wegen einer Reihe von Vorteilen, diese optogenetische Abbildung von Schaltkreisen in Hirnschnitten geworden breitenly verwendet in den letzten Jahren, und eine Vielzahl von viralen Vektoren für die Expression von fluoreszenzmarkierten CHRS von kommerziellen Anbietern leicht erhältlich. Einige der wichtigsten Vorteile von optogenetische Aktivierung über herkömmliche elektrische Stimulation sind keine Schädigung des Gewebes durch die Platzierung der Stimulationselektroden, eine Spezifität von Faser Stimulation, weil die elektrische Stimulation auch Fasern der Passage oder anderen nahe gelegenen Zellen rekrutieren können, und eine ebenso schnelle und zeitlich präzise Stimulation. Zusätzlich können stereotaktische Injektion von viralen Vektoren können leicht an spezifischen Gehirnbereichen ⁶ und bedingte oder zelltypspezifische Expression ⁷ unter Verwendung von Cre-abhängige Expression und / oder spezifischer Promotoren erreicht werden , ausgerichtet sein. Hier wird diese Technik zur Kartierung von Langstrecken und lokale Schaltungen in der Angst-System angewendet.

Die Amygdala ist eine Schlüsselregion für den Erwerb und die Expression von Angst und Speicherung von Angst und emotionale Erinnerungen ^8,9. Neben from die Amygdala, dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) und Hippocampus (HC), Strukturen, die auf der Amygdala reziprok verbunden sind, werden in Aspekten der Erfassung, Konsolidierung und den Abruf von Angst und Extinktion Erinnerungen ^10,11 gebracht. Aktivität in Unterteilungen des mPFC erscheint bei der Kontrolle der hohen und niedrigen Angst heißt ^12,13 eine doppelte Rolle zu spielen. Dies könnte teilweise durch direkte Verbindungen von mPFC zur Amygdala vermittelt werden, die Amygdala-Aktivität steuern würde und ausgegeben. Daher ist in den letzten Jahren begannen mehrere Studien in ex vivo Scheibe Experimente synaptische Interaktionen zwischen mPFC Afferenzen und spezifischen Zielzellen in der Amygdala ^14-17 zu untersuchen.

Während Angst Lernen erreicht sensorische Informationen über bedingten und unbedingten Stimuli die Amygdala über Projektionen von spezifischen Thalamus und kortikale Regionen. Plasticity dieser Eingänge der Neuronen in dem Seitenteil (LA) des Basolateral Amygdala (BLA) ist ein wichtiger Mechanismus Angstkonditionierung ^9,18 zugrunde liegen. Zunehmende Hinweise darauf , dass parallel Kunststoff Prozesse in der Amygdala hemmenden Elemente beinhalten Angst Speicher zur Steuerung ^19. Eine Gruppe von Cluster - inhibitorischen Neuronen sind die GABA - erge medialen paracapsular interkaliert Zellen (mpITCs), aber ihre genaue Konnektivität und Funktion versteht sich unvollständig ^20-22. Hier wird optogenetische Schaltung Mapping verwendet und abführenden Konnektivität dieser Zellen und deren Auswirkungen auf die Zielneuronen in der Amygdala beurteilen zu können , was zeigt , dass mpITCs direkten sensorischen Input von Thalamus und kortikale Relaisstationen ²³ empfangen. Spezifische Expression von ChR in mpITCs oder BLA Neuronen ermöglicht die Zuordnung von lokalen Interaktionen und enthüllt, dass mpITCs hemmen, sind aber auch für beide Seiten aktiviert durch, BLA Haupt Neuronen, so dass sie in neuartigen Feedforward und Feedback hemmende Schaltungen platzieren, die effektiv BLA Aktivität steuern23.

Protokoll

Ethik Aussage: Alle experimentellen Verfahren waren in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie über die Verwendung von Tieren in der Forschung und wurden von der lokalen Animal Care und Use Committee (Regierungspräsidium Tübingen, Baden-Württemberg, Deutschland), die für die Universität Tübingen genehmigt.

1. Stereotactic Injektionsverfahren

1. Bereiten Sie sterile Werkzeuge (Schere, Skalpell, Klemmen, Bohrer, Nadeln, Nahtmaterial) mit einem Sterilisator. Anordnen sterile Instrumente und andere erforderliche Lösungen und Chirurgie liefert wie sterile Baumwoll Swaps, Desinfektionsmittel, sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und H ₂ O ₂ auf einem sterilen chirurgischen Abdecktuchs.
2. Ziehen Glasmikropipetten für Injektionszwecke (1A, Einschub) einen 3 mm breiten Feld Filaments auf einer horizontalen Mikroelektrode puller gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird .
   Hinweis: Bei tiefen Injektionen sollte die Elektrode Verjüngung ausreichendlange die ventrale meisten Koordinaten zu erreichen (ca. 5 mm;. für Koordinaten, siehe 1.10).
3. Premix 1 ul Viruslösung und 0,2 ul 0,1% Fast Green-Lösung in sterilem PBS (zur besseren Sichtbarkeit der Lösung in der Glaspipette). Füllen Glaspipetten mit einer Mischung aus Viruslösung und schnell grün eine Mikroliterpipette mit einer feinen Spitze (1A, Einschub) verwendet wird .
   Hinweis: Arbeiten mit rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren (rAAV) wird Biosicherheitsstufe angesehen 1 (BSL 1) Arbeit und muss in einem BSL 1 Labor durchgeführt werden. rAAVs in dieser Studie verwendet wurden (Abbildung 1C) waren: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (Serotyp 2/9) ^16; 2) mgm / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (Serotyp 2/9) ^23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1A-DIOhChR2 (H134R) -YFP (Serotyp 2/1) ²³
4. Anesthetize eine Maus ein kleines Tier Anästhesiegerät (Isofluran: 3% in Sauerstoff für Induktion) verwendet wird.
   Anmerkung: Die Mäuse in dieser Studie verwendet wurden, waren 4 -7 Wochen alt und der folgenden Stämme und Genotypen: C57Bl6 / J Wildtyp (Experiment in den 2A und 3A-D); GAD67-GFP ²⁴ (Experiment in den 2B und 3E-H); TAC2-Cre ²⁵ (Experiment in den 2C und 3I-J).
5. Shave Kopf zwischen den Ohren und Augen. Wenden Sie Desinfektionsmittel (Providon-Jod-Basis) zu rasierten Kopf mit Wattestäbchen.
6. Tragen Sie eine Augensalbe zum Austrocknen der Augen während der Narkose zu verhindern. Subkutan injizieren Maus mit analgetischen (Meloxicam-basierte, 0,1 ml von 5 mg / ml Lösung).
7. Platzieren der Maus in stereotaktischen Rahmen (1A) und aufrechtzuerhalten Anästhesie über eine Gasnarkosemaske (Isofluran: 2% in Sauerstoff für Wartung). Überprüfen Narkose Tiefe Reflex mit Gliedmaßen Rückzug, bevor Sie fortfahren.
   Hinweis: Behalten Sie sterilen Bedingungen so gut wie möglich während des gesamten chirurgischen Eingriffs; tragen Einweg-Gesichtsmaske, chirurgische gown und Handschuhe.
8. Machen Hautschnitt auf der Oberseite des Kopfes mit einer Schere. Ziehen Sie die Haut an der Seite stumpfen Pinzette, fix mit Klammern Schädeloberfläche freizulegen, und saubere Schädel mit H ₂ O _2.
9. Mark Injektionsstellen auf Schädel , der eine feine Spitze Permanentmarker und Bohrungen für beide Hemisphären (1B) verwendet wird . Koordinaten für Injektionen in dieser Studie sind (von Bregma (mm)): mPFC: anteriore 1.9, lateral ± 0,3, ventralen 2.1; Mgm / PIN: posterior 3.0, lateral ± 1,8, ventralen 3,8; mpITC / BLA: posterior 1,45, Seiten ± 3,35, und ventralen 4,75.
10. Montieren gefüllt Glaspipette auf stereotaktischen Rahmen verbunden mit einer Druckeinspritzvorrichtung und bringen die Pipette zu Bregma Position.
11. Brechen Sie die Spitze der Glaspipette mit feinen geraden Spitze Pinzette. Tun Sie dies vorsichtig Aerosolerzeugung von Viruslösung zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze ein paar Druckimpulse durch die Anwendung und die Beobachtung der Extrusion von Tropfen viru geöffnet ists Lösung.
12. Gehen Sie zu den gewünschten Injektions Koordinaten und injizieren die Hälfte der Pipetteninhalt (~ 0,5 ul) die folgenden Einstellungen auf dem Druckinjektionsvorrichtung mit: Druck: 20 psi, mittlere Pulslänge: 30 ms, die durchschnittliche Anzahl von Impulsen: 50.
13. Lassen Sie Pipette in Platz für ca. 1 min, bevor sie langsam (1 mm / min) zurückgezogen wird es.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Pipette nicht blockiert wird, bevor Verfahren mit der gleichen Pipette auf anderen Hemisphäre zu wiederholen. Bei blockierten Spitze, reinigen oder brechen wieder Spitze und Null Pipette Position bei Bregma ab.
14. Saubere Schädel mit PBS (pH 7,4), entfernen Sie Klemmen, die Haut sanft zusammen ziehen und vernähen den Schnitt mit einzelnen Knopfnaht (3-4 Knoten). Wenden Sie Desinfektionsmittel (Providon-Jod-Basis) um die Wunde.
15. Stoppen Sie die Anästhesie und lassen Sie nicht die Maus unbeaufsichtigt, bis er vollständig wach ist. Halten Sie einzelne Untergebracht oder Rückkehr in Gesellschaft anderer Tiere nur, wenn sie vollständig erholt. Postoperativ weiterhin den Gesundheitsstatus zu überwachen und Verwalter Analgetikum, falls erforderlich. Befolgen Sie die Anweisungen nach den Regeln von der lokalen Animal Care und Use Committee vorgelegt.

2. Herstellung von Acute Slices

1. Bereiten Sie ACSF, Schneiden Lösung, Werkzeuge (Schere, Skalpell, Pinzetten, Spatel, Pasteurpipette) und Agarblöcken.
   Anmerkung: 1 L künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (ACSF) pro Experiment erforderlich ist , und hergestellt wird durch Chemikalien in doppelt destilliertem H ₂ O , wie zuvor ^16,23 veröffentlicht aufzulösen. Cutting - Lösung wird durch Ergänzung 200 ml ACSF mit 0,87 ml 2 M MgSO ₄ Stammlösung hergestellt.
2. Oxygenat ACSF und Schneidelösung während des Experiments mit 95% O ₂ und 5% CO _2.
3. Tief betäuben Maus ein kleines Tier Anästhesiegerät mit Isofluran (3% in Sauerstoff) verwendet wird. Überprüfen Narkose Tiefe Reflex mit Gliedmaßen Rückzug, bevor Sie fortfahren.
4. Enthaupten Maus große Schere und sofort kühlenKopf in eiskaltes Schneidelösung.
5. Offene Schädel durch einen einzigen Mittelschnitt von kaudal rostral und drücken Sie vorsichtig Stück des Schädels an den Seiten einer Pinzette. Schnell Gehirn entfernen, indem Sie es vorsichtig aus dem Schädel Anheben eines kleinen runden Spachtel. Abgeschnitten Cerebellum mit Skalpell. Platzieren Sie Gehirn in eiskaltem Schneidelösung.
6. Für mPFC Injektionsstellen: vorderen Teil des Gehirns (mit mPFC) mit einem Skalpell und setzen in eiskaltem Schneidelösung bis Schneiden abgeschnitten.
7. Überschüssiges Schneidelösung mit einem Filterpapier und kleben Sie den hinteren Teil des Gehirns auf die Vibratom Bühne.
8. Für gekippten Amygdala Scheiben, kleben Sie das Gehirn auf einem Agar - Block (4%) schneiden bei einem 35 ° Winkel (1D, Mitte). Für koronalen Amygdala Scheiben, mgm / PIN Injektionsstellen und mPFC Injektionsstellen, kleben Sie das Gehirn direkt auf der Bühne (1D, links und rechts). Legen Sie einen zusätzlichen Agar-Block hinter Gehirn für Stabilität beim Schneiden.
9. Place Stufenkammer mit eiskaltem mit Sauerstoff angereicherten Schneidelösung in Schneiden, die bei 4 ° C unter Verwendung einer Kühleinheit gehalten wird. Bereiten akuten Scheiben der Amygdala (320 & mgr; m) mit einem Saphirklinge. Die Scheiben in einer Schnittstelle Kammer mit Sauerstoff angereicherten ACSF bei RT geliefert.
10. Nach der Herstellung der akuten Amygdala Scheiben, legen Sie die Schnittstelle Kammer in einem Wasserbad bei 36 ° C Scheiben zu erholen für 35 - 45 min. Anschließend kehren die Schnittstelle Kammer auf RT. Denn von diesen Scheiben aufnehmen, fahren Sie mit Schritt 3.2.
11. Während Beginn des Schrittes 2.10 geschnittenen Scheiben der Injektionsstellen nach wie vor für die akute Amygdala Scheiben beschrieben (Schritte 2,8 bis 2,9). Rückgewinnung von Scheiben im Wasserbad ist hier nicht erforderlich. Optional: Um schnell Injektionsstelle Lage abzuschätzen, beobachten Scheiben auf einem Stereoskop mit einer Leuchtstofflampe und geeigneter Filtersätze ausgestattet.
12. Fix Scheiben enthält, Injektionsstellen für die Post-hoc-Analyse, indem sie zwischen zwei Filterpapieren sandwichartig und submerGing sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) in O / N PBS-Lösung. Für die Analyse der Injektionsstellen fahren Sie mit Schritt 4.1.

3. Visualisierung und Stimulation der präsynaptischen Fibers

1. Bereiten Sie Patch-Mikroskop für optogenetische Aktivierung von Fasern und Zellen:
   1. Zentrieren Sie die montierte Leuchtdiode (LED) auf den Lichtabgabeleitung.
   2. Messen Sie die LED-Lichtintensität an der hinteren Brennebene und am Ausgang jedes Objektiv mit einem Leistungsmesser die entsprechende Wellenlänge von 470 nm zu wählen.
   3. Berechnen Sie die Lichtintensität in mW / mm ² und erstellen Sie eine Kalibrierungskurve (LED - Intensität (%) im Vergleich zu Lichtleistung (mW / mm ²⁾⁾ für jedes Ziel für Werte für 470 nm Wellenlänge gemessen.
2. Rufen Sie einen spitzen Amygdala Scheibe von der Schnittstellenkammer und in der Schnittkammer auf den aufrechten Mikroskop mit einer Leuchtstofflampe ausgestattet montiert. Achten Sie auf die Scheibe, so dass der SLIC zu positionierene Oberfläche nach oben in der Schnittstellenkammer zugewandt ist, ist auch mit Blick nach oben in der Aufnahmekammer. Perfundieren slice mit frischem, oxygenierte ASCF mit einer Rate von 1 bis 2 ml / min bei einer Temperatur von ca. 31 ° C.
3. Beobachten präsynaptischen Fasern in der Schicht, die Leuchtstofflampe in Kombination mit geeigneter Filtersätze für das spezifische fluoreszierende Protein exprimiert werden. Verwenden 5x Ziel eine Übersicht (Figur 1E) zu erhalten, und 60x Ziel für die Beurteilung der Faserdichte innerhalb des Zielbereichs.
   Hinweis: Für die GFP und YFP, wählen Sie Filter setzen "grün" (Erregungs 472/20, Strahlteiler 495, Emission 490 LP) für mCherry verwenden Filter-Set "rot" (Erregungs 560/40, Strahlteiler 585, Emission 630/70), wie angegeben in den Materialien / Ausrüstung Tisch.
4. Öffnen oder die Öffnung in dem Mikroskop Lichtweg beschränken , wie für das Experiment (2D) erwünscht.
5. Um einen Patch Aufzeichnung zu erhalten, eine Patch-Pipette mit internen Lösung füllen und montieren in Elektrodenhalter. Bewerben positiven Druck auf die Pipette Patch und langsam zuerst in die Badlösung senken und dann unter Sichtkontrolle in die Scheibe der Mikromanipulator mit.
   1. Nähern Sie sich dem Neuron von Interesse mit der Patch-Pipette von der Seite und von oben. Lösen positive Druck, wenn die Pipette auf der Oberfläche der Zelle ist (dimple sichtbar auf der Zelloberfläche) und erhalten eine "Gigaseal" durch Unterdruck angelegt wird.
   2. Tragen Sie weitere Sog der Membranscheibe zu Bruch Whole-Cell-Aufzeichnung zu erhalten. Anschließend stimulieren markierte Fasern mit der angeschlossenen LED die entsprechende Wellenlänge zur Aktivierung ChR mit (470 nm), während elektrische Antworten aus der Zelle aufnehmen.
   3. Für synaptische Stimulation mit einer niedrigen LED-Intensität beginnen und zu erhöhen, bis die gewünschte synaptischen Stromamplitude erreicht ist. Auslöser der LED durch digitale Ausgänge in der Datenerfassungs - Software die Konfiguration der Zeitpunkt und die Pulslänge (Beispiele in Abbildung zu steuern3).
      Hinweis: andere Software und / oder TTL-erzeugende Geräte können zur Auslösung LED verwendet werden.
6. Wiederholen Stimulation mit geöffneten oder begrenzte Öffnung (Schritt 3.4) in dem Mikroskop Lichtweg wie für das nächste aufgezeichnete Zelle und / oder in Gegenwart von bestimmten Arzneimitteln erwünscht.
7. Nach der Aufnahme beheben Scheiben für die Post-hoc-Analyse, indem sie zwischen zwei Filterpapieren sandwichartig und sie in 4% PFA O / N Untertauchen.
8. Analysieren elektro Daten.
   Hinweis: Verwenden Sie eine geeignete Software zur Visualisierung aufgenommenen Sweep-Daten für jede einzelne Stimulation offline. Wenn Wirkungen von Medikamenten zu analysieren, verwenden Spitzenerkennungsroutinen Zeitverlauf der Arzneimittelwirkung auf die synaptische Stromamplituden für alle einzelnen Sweeps zu erhalten. Bestimmen Sie, wann die Arzneimittelwirkung stabilen Zustand erreicht. Zur Herstellung von repräsentativen Durchschnitt Antworten für Zahlen verwenden Software durchschnittliche ≥10 einzelnen Durchläufe pro Versuchsbedingung (siehe Abbildung 3B-D, FH, J rechts).
   Hinweis: mehrere alternative Softwarepakete können für die Datenanalyse verwendet werden.

4. Post-hoc-Analyse von Injektionsstellen

1. Waschen Scheiben Injektionsstellen (aus Schritt 2.12) und Aufnahmestellen (wenn Re-Imaging gewünscht wird, aus Schritt 3.7) dreimal in PBS. Dies wird durch wiederholtes Ersetzen Lösung mit frischem PBS auf einer rotierenden Schüttelmaschine dreimal für 10 min durchgeführt.
2. Bereiten Sie 2% Agar-Agar-Lösung in PBS, und lassen Sie es auf ~ 65 ° C abkühlen. Die Scheiben flach auf dem Boden eines kleinen Durchmesser von 30 mm Petrischale, betten Scheiben in Agar-Agar und lassen Sie es, bis es fest abkühlen.
3. Kleben Sie einen Agar-Block mit eingebetteten Scheibe oder Scheiben auf der Bühne eines Vibratom und platzieren Bühne im Schneidraum mit PBS.
4. Resection eingebettet Scheiben bis 70 & mgr; m Dicke. Optional: Nach Resektion kann Scheiben gefärbt werden, das heißt mit Neurotrace zu offenbaren Cytoarchitektur (3A, C), und / oder by Immunfluoreszenzanfärbung für YFP oder mCherry das Signal von der MRK-Fusionsproteins zu steigern.
5. Berg Scheiben auf Dias und Deckglas mit Montage Medien. Bildinjektionsstellen und, falls gewünscht, auch Bildscheiben Fasern in den Projektionsbereichen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops oder eines konfokalen Laser-Scanning - Mikroskop (2A-C) enthält.

Ergebnisse

Dieser Abschnitt zeigt den Workflow eines ex vivo optogenetischen Ansatz und repräsentative Ergebnisse aus verschiedenen experimentellen Strategien , um die physiologischen Eigenschaften von sensorischen und modulierende Langstrecken - Projektionen BLA und mpITC Neuronen sowie Eigenschaften der lokalen Konnektivität zwischen mpITC und BLA zu untersuchen.

Nach stereotaktische Injektion des ausgewählten Virusvektor a...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur ex vivo optogenetische Untersuchung von neuronalen Schaltkreise und lokale Konnektivität , die leicht auf die meisten umgesetzt werden können, wenn alle aufrechten Scheibe Patch-Clamp - Aufnahme - Setups , indem sie mit einem ~ 470 nm LED an der Epifluoreszenz Licht Port Ausrüstung nicht. Ein großer Vorteil der optogenetische Stimulation der axonale Projektionen in Scheiben ist, dass es für die spezifische Aktivierung und Untersuchung von Eigenschaften von Verb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgery
Stereotactic frame	Stoelting, USA	51670	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor	Stoelting, USA	51625	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice	Stoelting, USA	50264	no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer	Toohey Company, USA	T25-2-900	other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries	World Precision Instruments, Germany	1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo	Eickemeyer, Germany	213261
DC Temperature Controler and heating pad	FHC, USA	40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000	Sutter Instruments, USA	P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75	Melag, Germany	08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)	Penn Vector Core, USA	AV-1-20298P
fast green	Roth, Germany	0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)	CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine)	Purdure Products, USA	BSOL32	can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)	Boehringer Ingelheim, Germany		can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment	Bayer, Germany	0191	can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)	Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle	Fine Science Tools, Germany	12050-01
Braided Silk Suture	Fine Science Tools, Germany	18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	for composition see references #16 and #23
internal patch solutions	for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate	Roth, Germany	P027.1	prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V	Fisher Scientific, Germany	920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65	Fisher Scientific, Germany	770180
Sapphire blade	Delaware Diamond Knives		custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16	Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Canada	2012-12699
Patch microscope, BX51WI	Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier	Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A	Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10	Molecular Devices, USA		used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05	Luigs & Neumann, Germany	200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25	Luigs & Neumann, Germany	210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7	Luigs & Neumann, Germany	200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes	World Precision Instruments, Germany	GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber	Satorius Stedim Biotech, Germany	13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE	CoolLED, UK	244-1400	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, UK	pE-ADAPTOR-50E	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470	Rapp Optoelectronic	L70-000	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter	Rapp Optoelectronic	inquire with company	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation)	AHF, Germany	F49-560	Filters can be bought as set F46-008
(beamsplitter)	AHF, Germany	F48-585	Filters can be bought as set F46-008
(emission)	AHF, Germany	F47-630	Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation)	AHF, Germany	F39-472	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(beamsplitter)	AHF, Germany	F43-495W	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(emission)	AHF, Germany	F76-490	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter	Coherent, USA	1098293
IgorPro Software, Version 6	Wavemetrics, USA		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Neuromatic suite of macros for IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA)	Roth, Germany	0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain	Invitrogen	N-21479
agar-agar for embedding and resectioning	Roth, Germany	5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding	SPL Life Sciences		alternatives can be used
Slides, Super Frost	R. Langenbrinck, Germany	61303802	alternatives can be used
cover slips	R. Langenbrinck, Germany	3000302	alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium	Vector Laboratories, USA	H-1000	alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation	Satorius Stedim Biotech, Germany	11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710	Zeiss, Germany