Ex Vivo оптогенетика Вскрытие страха схем в головном мозге Ломтики

Резюме

Оптогенетика подходы широко используются для манипулирования нейронной активности и оценивать последствия для функционирования мозга. Здесь методика изложена , что при экспрессии в естественных условиях оптического активатора Channelrhodopsin, позволяет экс естественных условиях анализа синаптических свойств конкретного дальнего радиуса действия и локальных нейронных связей в цепях страха , связанных с .

Аннотация

Оптогенетика подходы в настоящее время широко используется для изучения функции нейронных популяций и схем путем объединения целевых экспрессии легких активированных белков и последующей манипуляции нейронной активности светом. Channelrhodopsins () являются ХР света селекцией катионообменной каналы и когда слитые с флуоресцентным белком их выражение позволяет для визуализации и одновременной активации специфических типов клеток и их аксонов проекции в определенных областях мозга. С помощью стереотаксической инъекции вирусных векторов, CHR слитые белки могут быть конститутивной или условно выражается в специфических клетках определенной области мозга, и их аксонов проекции могут впоследствии быть изучены анатомически и функционально с помощью экс естественных условиях оптогенетика активации в срезах мозга. Это особенно важно, когда с целью понять синаптические свойства соединений, которые не могут быть решены с помощью обычных электрических подходов стимуляции, или при определении нового AFFEаренда и подключение эфферентной, который ранее был мало изучен. Вот, несколько примеров показывают, как этот метод может быть применен для исследования этих вопросов к выяснению цепи страха, связанных в миндалине. Миндалина является ключевым регионом для приобретения и выражения страха и хранения страха и эмоциональных воспоминаний. Многие линии доказательств указывают на то, что медиальная префронтальная кора головного мозга (MPFC) участвует в различных аспектах приобретения страха и исчезновения, но его точное подключение с миндалине только начинает понимать. Во- первых, показано , как экс виво оптогенетика активации может быть использован для изучения аспектов синаптической связи между MPFC афферентов и клеток - мишеней в базолатеральной миндалине (BLA). Кроме того, показано , как это экс виво оптогенетика подход может быть применен для оценки новых моделей подключения , с помощью группы ГАМКергических нейронов в миндалине, то paracapsular интеркалированная кластера клеток (mpITC), в качестве примера.

Введение

Точные инструменты для визуализации и одновременной активации специфических связей между областями мозга и определенными типами нейронов становятся все более важными для понимания функциональной связности основные функции мозга здоровых и болезненных состояний. В идеале, это влечет за собой физиологическое исследование точных синаптических свойств, с которыми выявлены нейроны общаются. Это особенно верно в отношении связей между областей мозга, которые не могут храниться в одном срезе острого мозга. В прошлом это было в значительной степени достигнуто в отдельных экспериментах. С одной стороны, нейронные трассеры впрыскивается в естественных условиях, были использованы в сочетании с последующим светом или электронно - микроскопического анализа пред- и постсинаптического партнеров. С другой стороны, когда волоконно-трактов из региона происхождения сохраняются и доступны при приготовлении слайсов, электростимуляция использовалась для оценки синаптические механизмы связи с клетками в целевом регионе,

С появлением оптогенетика, целевое выражение легких селекцией катион-каналы, такие как Channelrhodopsins (ХР) , слитого с флуоресцентными белками, теперь позволяет активацию нейронов и их аксонов траекторий позволяя при этом для их визуализации и ретроспективном анатомического анализа ^{1- 4.} Поскольку CHR-экспрессирующие аксоны могут стимулироваться даже когда отделено от родительского somata ^5, можно в мозговых срезах: 1) оценить исходные данные из областей мозга , которые не были доступны с обычной электрической стимуляции, так как волокна тракты не являются разделяемыми или конкретная траектория не известно; 2) однозначно определить область происхождения для конкретных входов, которые были постулируется, но не вполне понятных; и 3) исследовать функциональную связь между определенными типами клеток, как локально, так и в долгосрочных прогнозов. Из-за ряда преимуществ, это оптогенетика отображение схем в срезах мозга становится широкимLY используется в последние годы, и различные вирусные векторы для экспрессии флуоресцентно-меченый ХР легко доступны от коммерческих поставщиков. Некоторые ключевые преимущества оптогенетика активации по сравнению с обычными электрической стимуляции не являются повреждения ткани вследствие размещения стимуляции электродов, специфичность стимуляции волокон, потому что электрическая стимуляция может также набрать волокон прохода или других соседних ячеек, и столь же быстрым и во времени точной стимуляции. Кроме того, стереотаксической инъекции вирусных векторов легко могут быть направлены на конкретные области мозга ⁶ и условной или камерного типа конкретное выражение может быть достигнуто с помощью Cre-зависимую экспрессию и / или специфические промоторы ^7. Здесь этот метод применяется для отображения дальнего радиуса действия и локальных схем в системе страха.

Миндалина является ключевым регионом для приобретения и выражения страха и хранения страха и эмоциональных воспоминаний ^8,9. Помимо сюдам миндалины, медиальная префронтальная кора головного мозга (MPFC) и гиппокамп (HC), структуры, которые взаимно соединены с миндалине, участвуют в аспектах приобретения, консолидации и поиска страха и исчезновения воспоминаний ^10,11. Деятельность в подразделениях MPFC - видимому, играет двойную роль в регулировании как высокого и низкого страха заявляет ^12,13. Это может быть частично опосредовано прямыми связями с MPFC к миндалине, которая будет контролировать активность миндалины и выход. Таким образом, в последние годы, некоторые исследования начались в естественных условиях экспериментов бывших срезов для исследования синаптических взаимодействий между MPFC афферентов и специфических клеток - мишеней в миндалине ^14-17.

Во время обучения страха, сенсорная информация об условных и безусловных раздражителей достигает миндалины с помощью проекций из специфических таламических и корковых областей. Пластичность этих входов нейронов в боковой части (LA) от basolateral миндалине (БЛА) является важным механизмом , лежащим страх кондиционирования ^9,18. Увеличение данные свидетельствуют о том, что параллельные пластические процессы в миндалине включают ингибирующие элементы для управления памятью страха ^19. Группа кластерной тормозных нейронов являются ГАМКергических медиальной paracapsular интеркалированного клетки (mpITCs), но их точная связь и функция не вполне понятно , ^20-22. Здесь отображение оптогенетика схема используется для оценки афферентные и эфферентные соединения этих клеток и их воздействие на целевые нейроны в мозжечковой миндалине, демонстрируя , что mpITCs получают прямой сенсорный вход от таламуса и коркового ретрансляционных станций ^23. Конкретное выражение ПГО в mpITCs или Bla нейронов позволяет отображение локальных взаимодействий, показывая, что mpITCs подавляют, но и взаимно активируются, Bla главных нейронов, помещая их в новые прямой подачи и обратной ингибирующих цепей, которые эффективно контролируют активность BLA23.

протокол

Заявление по этике: Все экспериментальные процедуры были в соответствии с директивой ЕС по использованию животных в научных исследованиях и были одобрены местным уходу и использованию животных комитета (Regierungspräsidium Тюбинген, земля Баден-Вюртемберг, Германия), ответственного за Университета Тюбингена.

1. Стереотактическая Процедура Инъекции

1. Подготовьте стерильные инструменты (ножницы, скальпели, зажимы, сверла, иглы, шовный материал), используя стерилизатор. Устройте стерильные инструменты и другие необходимые решения и хирургические принадлежности , такие как стерильные ватные свопы, дезинфицирующим, стерильного фосфатным буферным раствором (PBS, рН 7,4) и H ₂ O ₂ на стерильной хирургической простыне.
2. Потянуть стеклянные микропипетки для инъекций (рис 1А, вставка) с использованием широкой коробки нити 3 мм на горизонтальную микроэлектродом съемника в соответствии с инструкциями изготовителя.
   Примечание: Для получения глубоких инъекций, электрод конусности должен быть достаточнодолго, чтобы достичь вентральной большинство координат (около 5 мм;. для координат, см 1.10).
3. Премикс 1 мкл раствора вируса и 0,2 мкл 0,1% быстрого зеленого раствора в стерильной PBS (для лучшей видимости раствора в стеклянной пипетки). Заполните стеклянные пипетки смесью раствора вируса и быстрого зеленого с использованием микролитре пипетки с тонким кончиком (рис 1А, вставка).
   Примечание: Работа с рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (Раав) считается уровень биологической безопасности 1 (BSL 1) работа и должна выполняться в BSL 1 лаборатории. rAAVs , используемые в данном исследовании (рис 1C) были: 1) MPFC: Раав-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (серотип 2/9) ^16; 2) МГМ / PIN: Раав-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (серотип 2/9) ^23; 3) mpITC / БЛА: Раав-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (серотип 2/1) ²³
4. Обезболить мышь, используя небольшое животное анестезии машина (Isoflurane: 3% кислорода для индукции).
   Примечание: Мыши, используемые в данном исследовании, были 4 -7 недель , и из следующих штаммов и генотипов: C57BL6 / J дикого типа (эксперимент на фиг.2А и 3А-D); GAD67-GFP , ²⁴ (эксперимент на фигурах 2В и 3E-H); Tac2-Cre ²⁵ (эксперимент на фигурах 2С и 3i-J).
5. Бритье головы между ушами и глазами. Применение дезинфицирующего средства (провидон-йода на основе) к бритой голове с помощью ватного тампона.
6. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание глаза во время анестезии. Подкожно вводят мышь с обезболивающим (мелоксикам основе, 0,1 мл 5 мг / мл раствора).
7. Поместите мышь в стереотаксической рамы (Рисунок 1А) и поддержания анестезии с помощью противогаза анестезии (Isoflurane: 2% в кислороде для технического обслуживания). Проверьте анестезии глубину, используя снятие конечности рефлекс перед продолжением.
   Примечание: Поддержание стерильных условий, а также возможно в течение всей хирургической процедуры; носить одноразовые маски для лица, хирургические идутWn, и перчатки.
8. Сделайте разрез кожи на верхней части головы с помощью ножниц. Осторожно потяните кожу в сторону , используя тупой пинцет, зафиксировать с помощью зажимов подвергать поверхность черепа, а чистый череп с H ₂ O _2.
9. Места инъекций Все на черепе с помощью тонкого наконечника перманентным маркером и просверлить отверстия для обоих полушарий (рис. 1В) Координаты для инъекций в данном исследовании (от брегмы (мм)): MPFC: 1.9 передней, боковой ± 0,3, вентральный 2,1; МГМ / PIN: задний 3,0, боковая ± 1,8, вентральный 3,8; mpITC / БЛА: задний 1,45, боковая ± 3,35 и 4,75 вентральной.
10. Установите заполненный стеклянной пипетки на стереотаксической рамы, соединенного с инъекционной давления устройства и довести пипетку в положение темени.
11. Оторвать кончик стеклянной пипетки с использованием тонких прямой кончик пинцетом. Делайте это осторожно, чтобы предотвратить аэрозольный поколение раствора вируса. Убедитесь, что наконечник пипетки открыт путем применения несколько импульсов давления и наблюдая за выдавливание капли Вируs решение.
12. Перейти к требуемым координатам впрыска и ввести половину содержимого пипетки (~ 0,5 мкл), используя следующие настройки на устройстве впрыска под давлением: Давление: 20 фунтов на квадратный дюйм средняя длительность импульса: 30 мс, среднее число импульсов: 50.
13. Оставьте пипеткой на месте в течение ~ 1 мин, прежде чем медленно (1 мм / мин) его втягивания.
    Примечание: Убедитесь, что пипетка не блокируется перед повторением процедуры с той же пипеткой на другом полушарии. В случае заблокированного наконечника, очистите или прекращаться наконечник и нулевое положение пипетки на брегмы снова.
14. Чистый череп с PBS (рН 7,4), снимите зажимы, осторожно потяните кожу вместе, и сшивать разрез с индивидуальной кнопкой шовного (3 - 4 узла). Применение дезинфицирующего средства (провидон-йод), основанный вокруг раны.
15. Прекратить анестезию и не оставляйте без присмотра мышь, пока не будет полностью просыпаются. Держите одного Размещенный или вернуться к компании других животных только тогда, когда он полностью выздоровел. В послеоперационном периоде продолжают следить за состоянием здоровья, и Adminisтер анальгезирующим действием, если это необходимо. Следуйте процедурам в соответствии с правилами, выдвинутый местным уходу и использованию животных комитетом.

2. Приготовление острого Ломтики

1. Подготовка ACSF, резка решение, инструменты (ножницы, скальпель, пинцет, шпатель, пипетки Пастера), и агар блоков.
   Примечание: 1 л искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) требуется в эксперименте, и получают путем растворения химических веществ в бидистиллированной H ₂ O , как ранее опубликованных ^16,23. Режущий раствор готовят путем дополнения 200 мл ACSF с 0,87 мл 2 М MgSO ₄ маточного раствора.
2. Кислородсодержащих ACSF и режущая раствор в течение всего эксперимента с 95% O ₂ и 5% CO _2.
3. Глубоко обезболить мышь с помощью небольшого животного анестезии машину, используя изофлуран (3% кислорода). Проверьте анестезии глубину, используя снятие конечности рефлекс перед продолжением.
4. Обезглавьте мышь, используя большие ножницы и сразу же охладитьголова в ледяном растворе резки.
5. Открытый череп одного срединный разрез от хвостового к ростральной и осторожно надавите куски черепа к сторонам с помощью щипцов. Быстро удалить мозг, осторожно подняв его из черепа, используя небольшое округлое шпателя. Отрежьте мозжечка с скальпелем. Поместите мозг в ледяном растворе резки.
6. Для участков инъекции MPFC: отрезать переднюю часть мозга (содержащего MPFC), используя скальпель и поставить в ледяном растворе резки до нарезки.
7. Удалите излишки раствора для резки с фильтровальной бумагой и клеем заднюю часть головного мозга на сцену vibratome.
8. Для наклонных срезов миндалины, клей мозг на агаровой блок (4%) срезают на 35 ° угол (рис 1D, средний). Для корональных миндалины ломтиками, инъекции сайтов МГМ / ПИН и инъекции сайтов MPFC, клей мозг непосредственно на стадии (Рисунок 1D, слева и справа). Поместите дополнительный агар блок позади мозга для обеспечения стабильности в то время как нарезка.
9. Placе этап в режущую камеру с охлажденным льдом насыщенным кислородом раствором резания, который поддерживают при температуре 4 ° С с помощью охлаждающего устройства. Приготовьте острые кусочки миндалине (320 мкм) с использованием сапфирового лезвия. Поместите ломтики в интерфейс камеры, поставляемой с окисленной ACSF при комнатной температуре.
10. После приготовления острых миндалины ломтиками, поместить интерфейс камеры в водяной бане при 36 ° C, чтобы восстановить ломтики в течение 35 - 45 мин. Затем верните интерфейс камеры до комнатной температуры. Для записи с этих срезов, переходите к шагу 3.2.
11. Во время начала шага 2.10, вырезать кусочки участков инъекции, как описано выше для острых миндалины срезов (шаги 2.8 - 2.9). Восстановление срезов в водяную не требуется здесь. Необязательно: Для быстрого определения местоположения в месте инъекции, наблюдать срезы на стереоскоп, снабженный флуоресцентной лампой и соответствующих наборов фильтров.
12. Fix ломтики, содержащие инъекции сайты для ретроспективном анализа путем прослаивая их между двумя фильтровальной бумаги и submerрежимных их в 4% параформальдегида (PFA) в PBS раствор O / N. Для анализа участков инъекции переходите к шагу 4.1.

3. Визуализация и стимуляция пресинаптических волокон

1. Подготовьте патч-микроскоп для оптогенетика активации волокон и клеток:
   1. Сосредоточьте установлен светоизлучающий диод (LED) на световом пути доставки.
   2. Измерение интенсивности света СИД на задней фокальной плоскости и на выходе каждой из задач с помощью измерителя мощности Выбор соответствующей длиной волны 470 нм.
   3. Рассчитать интенсивность света в мВт / мм ² и создать калибровочной кривой (LED интенсивность (%) в зависимости от светового потока (мВт / мм ²⁾⁾ для каждой цели для значений , измеренных для 470 нм.
2. Получить острый миндалины кусочек из интерфейса камеры и места в срезе камере, установленной на прямой микроскоп, снабженный флуоресцентной лампой. Позаботьтесь, чтобы поместить кусочек такой, что SLICе поверхность была обращена вверх в интерфейсе камеры также была обращена вверх в записи камеры. Заливать ломтик свежей, насыщенной кислородом ASCF со скоростью 1 - 2 мл / мин при температуре ~ 31 ° C.
3. Обратите внимание пресинаптических волокон в срезе, используя люминесцентную лампу в комбинации с соответствующими наборами фильтров для конкретного флуоресцентного белка, экспрессируемого. Использование 5x цели для получения обзора (рис 1E) и 60x цели для оценки плотности волокон в пределах целевой области.
   Примечание: Для получения GFP и YFP, использование фильтра устанавливается "зеленый" (возбуждение 472/20, светоделитель 495, эмиссия 490 LP) для mCherry использовать набор фильтров "красный" (возбуждение 560/40, светоделитель 585, эмиссия 630/70), как указано в таблице материалов / оборудования.
4. Открыть или ограничить отверстие в световом пути микроскопа , как требуется для эксперимента (рис 2D).
5. Чтобы получить запись патч, заполнить патч пипетку с внутренним решением и смонтировать ян держатель электрода. Применить положительное давление на патч пипетки и медленно опустите его сначала в раствор ванны, а затем под визуальным контролем в срезе с помощью микроманипулятора.
   1. Подход нейрон интересов с исправлениями пипеткой со стороны и сверху. Освободить положительное давление, когда пипетка находится на поверхности клетки (впадина видимой на поверхности клетки) и получить "gigaseal" с помощью отрицательного давления.
   2. Применить дальнейшее всасывание к разрыву мембраны патч, чтобы получить запись целой клетки. В дальнейшем, стимулировать меченые волокна с подключенным светодиодом с использованием соответствующей длины волны для активации Chr (470 нм) во время записи электрических ответов из клетки.
   3. Для синаптической стимуляции начать с низкой интенсивностью светодиода и увеличить до желаемого синаптической амплитуда тока не будет достигнута. Спусковой крючок LED путем настройки цифровых выходов в программном обеспечении сбора данных для управления временем и длительность импульса (примеры на рисунке3).
      Примечание: другое программное обеспечение и / или TTL-генерирующие устройства могут быть использованы для запуска LED.
6. Повторное возбуждение с открытым или ограниченным отверстием (этап 3.4) в микроскопе светового пути, как требуется для следующей записанной ячейки и / или в присутствии специфических препаратов.
7. После записи, фиксируют срезы для ретроспективном анализа путем прослаивая их между двумя фильтровальной бумаги и погружая их в 4% PFA O / N.
8. Анализ электрофизиологических данных.
   Примечание: Используйте соответствующее программное обеспечение для визуализации данных записанных развертки для каждого отдельного стимуляции в автономном режиме. При анализе воздействия наркотиков, использование пиковых процедур обнаружения для получения временной ход действия лекарственного средства на синаптических амплитуды тока для всех отдельных разверток. Определите, когда действие препарата достигает устойчивого состояния. Для получения репрезентативных средних ответов на чертежах, используют программное обеспечение для средних ≥ 10 отдельных взмахов в экспериментальных условиях (ср Рисунок 3B-D, FH, J правая панель).
   Примечание: несколько альтернативных пакетов программного обеспечения могут быть использованы для анализа данных.

4. ретроспективном анализ Инъекции сайтов

1. Промыть срезы участков инъекции (со стадии 2.12) и записи сайтов (если повторная визуализация желательно, начиная с шага 3.7) три раза в PBS. Это делается путем многократного замены раствора со свежим PBS на ротационном вибраторе три раза в течение 10 мин.
2. Приготовьте 2% агар-агар раствор в PBS, и дайте ему остыть до ~ 65 ° C. Место ломтики плашмя на дно небольшого 30 мм чашках Петри диаметром, встраивать ломтики в агар-агар, и пусть она остынет до твердого продукта.
3. Клей агар блок со встроенным срезе или ломтиков на стадии vibratome и поместите этап в режущую камеру с PBS.
4. Резекция встроенные срезы толщиной 70 мкм. Дополнительно: После резекции, ломтики могут быть окрашены, то есть, с Neurotrace выявить цитоархитектуры (Фигура 3А, С), и / или бY иммунофлуоресценции окрашивание на YFP или mCherry для усиления сигнала от гибридного белка Chr.
5. Mount ломтика на слайдах и покровное с монтажными средствами массовой информации. Инжекционные изображения сайтов и, при желании, также изображения кусочки , содержащие волокна в области проекции с помощью флуоресцентного микроскопа или конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Фиг.2А-С).

Результаты

В этом разделе показан рабочий процесс ех естественных условиях оптогенетика подхода и представительных результатов различных экспериментальных стратегий , чтобы исследовать физиологические свойства сенсорных и модуляторными долгосрочных прогнозов в BLA и mpITC...

Обсуждение

Этот протокол описывает метод экс естественных условиях оптогенетика исследования нейронных цепей и локальной связи , которые могут быть легко реализованы на большинстве, если не все, в вертикальном положении ломтика записи патч-зажим расстановок, оснастив их с ~ 470 нм LED на эпифлу...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgery
Stereotactic frame	Stoelting, USA	51670	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor	Stoelting, USA	51625	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice	Stoelting, USA	50264	no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer	Toohey Company, USA	T25-2-900	other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries	World Precision Instruments, Germany	1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo	Eickemeyer, Germany	213261
DC Temperature Controler and heating pad	FHC, USA	40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000	Sutter Instruments, USA	P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75	Melag, Germany	08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)	Penn Vector Core, USA	AV-1-20298P
fast green	Roth, Germany	0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)	CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine)	Purdure Products, USA	BSOL32	can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)	Boehringer Ingelheim, Germany		can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment	Bayer, Germany	0191	can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)	Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle	Fine Science Tools, Germany	12050-01
Braided Silk Suture	Fine Science Tools, Germany	18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	for composition see references #16 and #23
internal patch solutions	for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate	Roth, Germany	P027.1	prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V	Fisher Scientific, Germany	920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65	Fisher Scientific, Germany	770180
Sapphire blade	Delaware Diamond Knives		custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16	Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Canada	2012-12699
Patch microscope, BX51WI	Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier	Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A	Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10	Molecular Devices, USA		used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05	Luigs & Neumann, Germany	200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25	Luigs & Neumann, Germany	210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7	Luigs & Neumann, Germany	200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes	World Precision Instruments, Germany	GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber	Satorius Stedim Biotech, Germany	13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE	CoolLED, UK	244-1400	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, UK	pE-ADAPTOR-50E	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470	Rapp Optoelectronic	L70-000	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter	Rapp Optoelectronic	inquire with company	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation)	AHF, Germany	F49-560	Filters can be bought as set F46-008
(beamsplitter)	AHF, Germany	F48-585	Filters can be bought as set F46-008
(emission)	AHF, Germany	F47-630	Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation)	AHF, Germany	F39-472	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(beamsplitter)	AHF, Germany	F43-495W	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(emission)	AHF, Germany	F76-490	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter	Coherent, USA	1098293
IgorPro Software, Version 6	Wavemetrics, USA		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Neuromatic suite of macros for IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA)	Roth, Germany	0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain	Invitrogen	N-21479
agar-agar for embedding and resectioning	Roth, Germany	5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding	SPL Life Sciences		alternatives can be used
Slides, Super Frost	R. Langenbrinck, Germany	61303802	alternatives can be used
cover slips	R. Langenbrinck, Germany	3000302	alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium	Vector Laboratories, USA	H-1000	alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation	Satorius Stedim Biotech, Germany	11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710	Zeiss, Germany