Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Resumen

enfoques Optogenética son ampliamente utilizados para manipular la actividad neuronal y evaluar las consecuencias para la función cerebral. Aquí, una técnica que se describe después de la expresión in vivo del activador óptico canalrodopsina, permite el análisis ex vivo de las propiedades sinápticas de largo alcance específico y conexiones neuronales locales en los circuitos relacionados con el miedo.

Resumen

enfoques Optogenética son ampliamente utilizados para estudiar la función de las poblaciones neuronales y los circuitos mediante la combinación de la expresión específica de proteínas activadas por la luz y la posterior manipulación de la actividad neural por la luz. Channelrhodopsins (CHRS) son cationes canales de luz cerrada y cuando se fusiona a una proteína fluorescente su expresión permite la visualización y la activación simultánea de los tipos de células específicas y sus proyecciones axonales en áreas definidas del cerebro. Via inyección estereotáctica de vectores virales, proteínas de fusión CHR pueden ser constitutivamente o condicionalmente expresan en células específicas de una región del cerebro definido, y sus proyecciones axonales posteriormente se pueden estudiar anatómica y funcionalmente a través de la activación ex vivo optogenético en rodajas de cerebro. Esto es de particular importancia cuando el objetivo de comprender las propiedades sinápticas de conexiones que no pueden ser tratados con los enfoques convencionales de estimulación eléctrica, o en la identificación de nuevos affealquiler y conectividad eferentes que fue previamente poco conocida. Aquí, algunos ejemplos ilustran cómo esta técnica se puede aplicar a investigar estas preguntas a la aclaración de los circuitos relacionados con el miedo en la amígdala. La amígdala es una región clave para la adquisición y expresión de miedo, y el almacenamiento de miedo y recuerdos emocionales. Muchas líneas de evidencia sugieren que la corteza prefrontal medial (córtex prefrontal medial) participa en diferentes aspectos de la adquisición del miedo y la extinción, pero su conectividad preciso con la amígdala está empezando a ser entendido. En primer lugar, se muestra cómo la activación ex vivo optogenético se puede utilizar para estudiar aspectos de la comunicación sináptica entre los aferentes mPFC y células diana en la amígdala basolateral (BLA). Además, se ilustra cómo este enfoque ex vivo optogenético se puede aplicar para evaluar nuevos patrones de conectividad utilizando un grupo de neuronas GABAérgicas en la amígdala, el clúster paracapsular intercalado celular (mpITC), como un ejemplo.

Introducción

herramientas precisas para la visualización y la activación simultánea de conexiones específicas entre las áreas del cerebro y los tipos específicos de neuronas son cada vez más importante en la comprensión de la conectividad funcional subyacentes de la función cerebral y la enfermedad estados sanos. Idealmente, esto implica la investigación de las propiedades fisiológicas precisas sinápticas con la que se comunican las neuronas identificadas. Esto es particularmente cierto para las conexiones entre las áreas del cerebro que no pueden ser preservados en una sola rebanada cerebral agudo. En el pasado, esto se ha conseguido en gran parte en experimentos separados. Por un lado, los trazadores inyectados neuronales in vivo se han empleado en combinación con la luz posterior o el análisis con microscopio electrónico de socios de pre y postsinápticos. Por otro lado, cuando tractos de fibras de la región de origen se conservan y accesible en la preparación rebanada, la estimulación eléctrica se ha utilizado para evaluar los mecanismos de comunicación sinápticas con las células en la región de destino.

Con el advenimiento de la optogenética, la expresión selectiva de cationes-canales de luz-gated, como Channelrhodopsins (CHRS) fusionado a las proteínas fluorescentes, ahora permite la activación de las neuronas y sus trayectorias axonales permitiendo al mismo tiempo su visualización y post-hoc análisis anatómico ^{1- 4.} Debido a que los axones CHR-expresan pueden ser estimulados incluso cuando separado de somata matriz ^5, es posible en rodajas de cerebro a: 1) evaluar las aportaciones de las regiones del cerebro que no eran accesibles con la estimulación eléctrica convencional, ya tractos de fibras no son separables o la trayectoria específica no se sabe; 2) identificar inequívocamente la región de origen de los insumos específicos que fueron postuladas pero no del todo comprendidas; y 3) investigar la conectividad funcional entre los tipos de células definidos, tanto a nivel local y en las proyecciones de largo alcance. Debido a una serie de ventajas, este mapeo optogenético de circuitos en cortes de cerebro se ha convertido en ampliaLy utilizado en los últimos años, y una variedad de vectores virales para la expresión de CHRS fluorescentemente etiquetado están fácilmente disponibles de proveedores comerciales. Algunas de las ventajas clave de activación optogenético sobre la estimulación eléctrica convencional hay daño al tejido debido a la colocación de electrodos de estimulación, la especificidad de la estimulación de la fibra debido a la estimulación eléctrica también puede reclutar fibras de paso o de otras células cercanas, y una estimulación igualmente rápida y temporalmente precisa. Además, la inyección estereotáxica de vectores virales fácilmente puede dirigirse a áreas específicas del cerebro ⁶ y expresión específica condicional o de tipo celular se puede lograr utilizando la expresión de Cre-dependiente y / o promotores específicos ^7. A continuación, se aplica esta técnica para el mapeo de largo alcance y los circuitos locales en el sistema del miedo.

La amígdala es una región clave para la adquisición y expresión de miedo, y el almacenamiento de miedo y recuerdos emocionales ^8,9. Aparte lado a otrom la amígdala, la corteza prefrontal medial (córtex prefrontal medial) y el hipocampo (HC), estructuras que están conectados recíprocamente a la amígdala, están implicados en los aspectos de la adquisición, consolidación y recuperación de miedo y extinción de recuerdos ^10,11. Actividad en las subdivisiones de la mPFC parece desempeñar un doble papel en el control tanto de alta como de baja temor estados ^12,13. Esto podría ser debido en parte mediado por conexiones directas desde el córtex prefrontal medial a la amígdala que controlaría la actividad de la amígdala y de salida. Por lo tanto, en los últimos años, varios estudios comenzaron en experimentos ex vivo rebanada para investigar las interacciones sinápticas entre los aferentes mPFC y células diana específicas en la amígdala ^14-17.

Durante el aprendizaje miedo, la información sensorial sobre los estímulos condicionado e incondicionado alcanza la amígdala a través de las proyecciones de las regiones talámicas y corticales específicas. La plasticidad de estas entradas de las neuronas en la parte lateral (LA) del Basolamígdala ateral (BLA) es un importante mecanismo que subyace en el condicionamiento del miedo ^9,18. La evidencia creciente sugiere que los procesos paralelos de plástico en la amígdala implican elementos inhibidores para controlar la memoria del miedo ^19. Un grupo de neuronas inhibidoras agrupados son los paracapsular intercalado células mediales GABAérgicas (mpITCs), pero su conectividad y función precisa se ​​entiende de manera incompleta ^20-22. Aquí, la cartografía circuito optogenético se utiliza para evaluar la conectividad aferentes y eferentes de estas células y su impacto en las neuronas diana en la amígdala, lo que demuestra que mpITCs reciben información sensorial directa de estaciones de relevo talámicas y corticales ^23. La expresión específica de la CDH en mpITCs o neuronas BLA permite representar las interacciones locales, revelando que mpITCs inhiben, sino que también están mutuamente activa, BLA neuronas principales, colocándolos en nuevos circuitos inhibitorios de alimentación directa y retroalimentación que controlan eficazmente la actividad BLA23.

Protocolo

declaración de la ética: Todos los procedimientos experimentales fueron de acuerdo con la directiva de la UE sobre el uso de animales en la investigación y fueron aprobados por el Cuidado de Animales local y el empleo Comisión (Regierungspräsidium Tübingen, estado de Baden-Württemberg, Alemania) responsable de la Universidad de Tübingen.

1. Procedimiento de inyección estereotáctica

1. Preparar herramientas estériles (tijeras, bisturí, pinzas, taladros, agujas, material de sutura) utilizando un esterilizador. Organizar herramientas estériles y otras soluciones necesarias y suministros quirúrgicos como el canje de algodón estéril, desinfectante, solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, pH 7,4), y H ₂ O ₂ en un paño quirúrgico estéril.
2. Tire micropipetas de vidrio para inyecciones (Figura 1A, inserción) utilizando un 3 mm de ancho filamento caja en un microelectrodo horizontal extractor de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   Nota: Para las inyecciones profundas, la forma cónica del electrodo debe ser lo suficientementelargo para llegar a la mayoría de las ventrales coordenadas (aproximadamente 5 mm;. para las coordenadas, véase 1.10).
3. Premezcla 1 l de solución de virus y 0,2 l de solución de verde rápido 0,1% en PBS estéril (para una mejor visibilidad de la solución en la pipeta de vidrio). Llenar pipetas de vidrio con mezcla de solución de virus y verde rápido usando una pipeta de microlitro con una punta fina (Figura 1A, recuadro).
   Nota: El trabajo con vectores virales adeno-asociados recombinantes (rAAV) se considera nivel de bioseguridad 1 (BSL 1) de trabajo y debe ser realizado en un laboratorio BSL 1. rAAVs utilizados en este estudio (Figura 1C) fueron: 1) mPFC: rAAV-hsyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotipo 2/9) ^16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (serotipo 2/9) ^23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R)-YFP (serotipo 2/1) ²³
4. Anestesiar a un ratón utilizando una pequeña máquina de anestesia para animales (isoflurano: 3% de oxígeno para la inducción).
   Nota: Los ratones utilizados en este estudio fueron 4 -7 semanas de edad y de las siguientes cepas y genotipos: tipo salvaje C57Bl6 / J (experimento en las figuras 2A y 3A-D); GAD67-GFP ²⁴ (experimento en las Figuras 2B y 3E-H); Tac2 ^Cre-25 (experimento en las figuras 2C y 3I-J).
5. Afeitarse la cabeza entre las orejas y los ojos. Aplicar desinfectante (de povidona-iodo basada) a la cabeza afeitada usando hisopos de algodón.
6. Aplique un ungüento para los ojos para evitar el secado de los ojos durante la anestesia. Por vía subcutánea inyectar ratón con analgésicos (, solución basada en meloxicam 0,1 ml de 5 mg / ml).
7. Coloque el ratón en el marco estereotáxico (Figura 1A) y mantener la anestesia a través de una máscara de anestesia de gas (isoflurano: 2% en oxígeno para el mantenimiento). Comprobar la profundidad de anestesia utilizando reflejo de retirada del miembro antes de continuar.
   Nota: Mantener condiciones estériles, así como sea posible durante todo el procedimiento quirúrgico; llevar mascarilla desechable, ir quirúrgicawn y guantes.
8. Hacer incisión en la piel en la parte superior de la cabeza con unas tijeras. Tire con cuidado de la piel a un lado el uso de fórceps romos, fijar con abrazaderas para exponer la superficie del cráneo, y el cráneo limpio con H ₂ O _2.
9. Marcar los puntos de inyección en el cráneo utilizando un fino agujeros de perforación y marcadores permanentes de punta para ambos hemisferios (Figura 1B). Coordenadas para inyecciones en este estudio son (de bregma (mm)): mPFC: 1.9 anterior, lateral ± 0,3, 2,1 ventral; MGM / PIN: 3.0 posterior, lateral ± 1,8, 3,8 ventral; mpITC / BLA: 1,45 posterior, lateral ± 3,35, y 4,75 ventral.
10. Montar la pipeta de vidrio lleno en marco estereotáctico conectado a un dispositivo de inyección a presión y llevar la pipeta a la posición Bregma.
11. Rompa la punta de la pipeta de vidrio usando pinzas finas recta de punta. Haga esto con cuidado para evitar la formación de aerosoles de solución de virus. Asegúrese de que la punta de la pipeta es abierta mediante la aplicación de un par de pulsos de presión y la observación de extrusión de gotas de virusolución de s.
12. Ir a las coordenadas deseadas de inyección e inyectar la mitad del contenido de la pipeta (~ 0,5 l) usando los siguientes ajustes en el dispositivo de inyección a presión: Presión: 20 psi, la duración del pulso promedio: 30 ms, número medio de pulsos: 50.
13. Deja pipeta en el lugar durante ~ 1 min antes lentamente (1 mm / min) retraer él.
    Nota: Asegúrese de que la pipeta no está bloqueado antes de repetir el procedimiento con la misma pipeta en otro hemisferio. En el caso de la punta bloqueado, limpie o romper la punta y la posición de la pipeta cero al bregma nuevo.
14. cráneo limpia con PBS (pH 7,4), quitar las abrazaderas, tire suavemente de la piel juntos, y suturar la incisión con suturas botón individual (3 - 4 nudos). Aplicar desinfectante (de povidona-iodo basados) alrededor de la herida.
15. Detener la anestesia y no deje desatendida del ratón hasta que esté completamente despierto. Mantenga alojamiento individual o volver a la compañía de otros animales sólo cuando se recuperó por completo. Después de la operación, seguirá de cerca el estado de salud, y administer analgésico si es necesario. Siga los procedimientos de acuerdo a las normas formuladas por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo local.

2. Preparación de cortes agudos

1. Preparar ACSF, solución de corte, herramientas (tijeras, bisturí, pinzas, espátula, pipeta Pasteur) y bloques de agar.
   Nota: 1 L de artificial de fluido cerebro-espinal (ACSF) se requiere por experimento, y se prepara mediante la disolución de los productos químicos en H bidestilada ₂ O como publicó anteriormente ^16,23. Solución de corte se prepara completándolo 200 ml de ACSF con 0,87 ml de H _MgSO4 solución madre 2.
2. ACSF oxigenar y solución de corte durante todo el experimento con un 95% _{de O2} y 5% de _CO2.
3. Profundamente anestesiar ratón usando una pequeña máquina de anestesia en animales utilizando isoflurano (3% en oxígeno). Comprobar la profundidad de anestesia utilizando reflejo de retirada del miembro antes de continuar.
4. Decapitar ratón usando tijeras grandes y desconectar inmediatamentela cabeza de corte en una solución enfriada con hielo.
5. cráneo abierto por una sola incisión en la línea media del caudal a rostral y empuje suavemente trozos de cráneo a los lados con unas pinzas. Eliminar rápidamente el cerebro levantando suavemente hacia afuera del cráneo usando una pequeña espátula redondeada. Cortar el cerebelo con el escalpelo. Coloque cerebro en solución de corte enfriado con hielo.
6. Para los sitios de inyección mPFC: cortar parte anterior del cerebro (que contiene el córtex prefrontal medial) utilizando un bisturí y poner en solución de corte en frío con hielo hasta el corte.
7. Retire el exceso de solución de corte con un papel de filtro y la cola de la parte posterior del cerebro en el escenario vibratome.
8. Para rebanadas amígdala inclinados, pegar el cerebro en un bloque de agar (4%) de corte en un ángulo de 35 ° (Figura 1D, medio). Para rebanadas coronales amígdala, sitios de inyección de MGM / PIN y sitios de inyección mPFC, pegar el cerebro directamente en el escenario (Figura 1D, izquierda y derecha). Colocar un bloque de agar adicional detrás del cerebro para la estabilidad, mientras que rebanar.
9. Place etapa en la cámara de corte con solución de corte oxigenada enfriada en hielo que se mantiene a 4 ° C utilizando una unidad de refrigeración. Preparar rodajas agudas de la amígdala (320 micras) con una cuchilla de zafiro. Coloque las rebanadas en una cámara de interfaz suministrado con ACSF oxigenada a temperatura ambiente.
10. Después de la preparación de las rebanadas de la amígdala agudas, coloque la cámara de interfaz en un baño de agua a 36 ° C para recuperar las rebanadas de 35 - 45 min. Posteriormente, el retorno de la cámara de interfaz a RT. Para la grabación de estos cortes, continúe con el paso 3.2.
11. Durante el inicio de la etapa 2.10, cortar rodajas de los sitios de inyección como se ha descrito antes para los sectores de la amígdala agudas (pasos 2.8 a 2.9). No se requiere la recuperación de las rebanadas en el baño de agua aquí. Opcional: Para estimar rápidamente la ubicación del sitio de la inyección, observe las rebanadas en un estereoscopio equipado con una lámpara fluorescente y juego de filtros adecuados.
12. Fijar las rebanadas contienen sitios de inyección para el análisis post-hoc intercalando ellos entre dos papeles de filtro y submerging en 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS solución de O / N. Para el análisis de los sitios de inyección de proceder con el paso 4.1.

3. Visualización y estimulación de fibras presinápticas

1. Preparar microscopio parche para la activación optogenético de fibras y células:
   1. Centre el diodo emisor de luz montada (LED) en la vía de suministro de luz.
   2. Medir la intensidad de la luz LED en el plano focal posterior y en la salida de cada objetivo con un medidor de potencia de la elección de la longitud de onda apropiada de 470 nm.
   3. Calcular la intensidad de la luz en mW / mm ² y crear una curva de calibración (intensidad del LED (%) frente a la salida de luz (mW / mm ²⁾⁾ para cada objetivo para los valores medidos para 470 nm longitud de onda.
2. Recuperar una rebanada amígdala aguda de la cámara de interfaz y lugar en la cámara de corte montado en el microscopio vertical equipado con una lámpara fluorescente. Tenga cuidado de colocar el trozo de tal manera que el SLICe superficie que mira hacia arriba en la cámara de interfaz también se coloca hacia arriba en la cámara de grabación. Perfundir rebanada con ASCF fresca, oxigenada, a razón de 1-2 ml / min a una temperatura de ~ 31 ° C.
3. Observe fibras presinápticas en el corte utilizando la lámpara fluorescente en combinación con los conjuntos de filtro para la proteína fluorescente específico expresado. Utilice objetivo 5x para obtener una visión general (Figura 1E), y 60x objetivo para la evaluación de la densidad de las fibras dentro del área objetivo.
   Nota: Para GFP y YFP, el uso conjunto de filtros "verde" (excitación 472/20, Divisor de rayos 495, 490 Emisión LP) para mCherry uso conjunto de filtros "rojo" (excitación 560/40, Divisor de rayos 585, emisión 630/70) como se especifica en la tabla de materiales / equipos.
4. Abra o restringir la abertura en la vía de luz del microscopio como se desee para el experimento (Figura 2D).
5. Para obtener una grabación de parches, llenar un parche pipeta con solución interna y Mount In soporte del electrodo. Aplicar presión positiva a la pipeta de parche y baje lentamente que por primera vez en la solución del baño y luego bajo control visual en el sector mediante el micromanipulador.
   1. Acercarse a la neurona de interés con la pipeta parche desde el lado y la parte superior. Liberar la presión positiva cuando la pipeta está en la superficie de la célula (hoyuelo visible en la superficie celular) y obtener una "gigaseal" mediante la aplicación de presión negativa.
   2. Aplicar más de succión para romper el parche de membrana para obtener células enteras de grabación. Posteriormente, estimular fibras marcadas con el LED conectado con la longitud de onda apropiada para la activación de Chr (470 nm) durante la grabación de las respuestas eléctricas de la célula.
   3. Para la estimulación sináptica comenzar con una baja intensidad de LED y aumentar hasta que se alcanza la amplitud de la corriente sináptica deseada. Disparar el LED mediante la configuración de las salidas digitales en el software de adquisición de datos para controlar el tiempo y el pulso largo (ejemplos de la figura3).
      Nota: otro software y / o generadoras de TTL dispositivos se pueden utilizar para desencadenar LED.
6. Repita la estimulación con la abertura abierta o restringida (etapa 3.4) en la vía de luz del microscopio como se desee para la próxima célula registrada y / o en presencia de fármacos específicos.
7. Después de grabar, arreglar las rebanadas para el análisis post-hoc intercalando ellos entre dos papeles de filtro y sumergiéndolas en el 4% PFA O / N.
8. Analizar datos electrofisiológicos.
   Nota: El uso de software adecuado para visualizar los datos de barrido registrados para cada línea estimulación individual. Al analizar los efectos de las drogas, usar rutinas de detección de picos para obtener curso temporal del efecto del fármaco sobre amplitudes de corriente sinápticas para todos los barridos individuales. Determinar cuando el efecto del fármaco alcanza el estado de equilibrio. Para preparar las respuestas medios representativos de las cifras, utilizar el software en un promedio de ≥10 barridos individuales por condición experimental (véase la figura 3B-D, FH, J panel derecho).
   Nota: varios paquetes de software alternativos pueden ser utilizados para el análisis de datos.

4. Análisis post-hoc de los puntos de inyección

1. Lavar rebanadas de sitios de inyección (de la etapa 2.12) y el registro de los sitios (si se desea la re-formación de imágenes, de la etapa 3.7) tres veces en PBS. Esto se hace mediante la sustitución de varias veces la solución con PBS fresco en un agitador giratorio tres veces durante 10 min.
2. Preparar solución al 2% de agar-agar en PBS, y dejar que se enfríe a ~ 65 ° C. Coloque las rebanadas planas en la parte inferior de una pequeña placa de Petri de 30 mm de diámetro, incrustar en rodajas agar-agar y dejar enfriar hasta que solidifique.
3. Pegar un bloque de agar con el sector o sectores incorporado a la etapa de un vibratome y colocar etapa en la cámara de corte con PBS.
4. Resección rebanadas a 70 micras de espesor incrustado. Opcional: Después de la resección, las rebanadas se pueden teñir, es decir, con NeuroTrace para revelar citoarquitectura (Figura 3A, C), y / o btinción de inmunofluorescencia y de YFP o mCherry para aumentar la señal de la proteína de fusión Chr.
5. rebanadas de montaje en portaobjetos y cubreobjetos con medio de montaje. Sitios de inyección de la imagen y, si se desea, también cortes de imagen que contienen fibras en las áreas de proyección utilizando un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal de escaneo láser (Figura 2A-C).

Resultados

En esta sección se muestra el flujo de trabajo de un enfoque optogenético ex vivo y los resultados representativos de diferentes estrategias experimentales para investigar las propiedades fisiológicas de las proyecciones sensoriales y moduladores de largo alcance a BLA y neuronas mpITC así como las propiedades de conectividad local entre mpITC y BLA.

Después de la inyección estereotáctica del vector viral selec...

Discusión

Este protocolo describe un método para la ex vivo investigación optogenético de los circuitos neuronales y la conectividad local que se pueden implementar fácilmente en la mayoría, si no todas, las verticales rebanada de grabación de patch-clamp configuraciones, equipándolos con un ~ 470 nm LED en el puerto de luz de epifluorescencia. Una ventaja importante de la estimulación optogenética de proyecciones axonales en rebanadas es que permite la activación y la investigación de las propiedades de las c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgery
Stereotactic frame	Stoelting, USA	51670	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor	Stoelting, USA	51625	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice	Stoelting, USA	50264	no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer	Toohey Company, USA	T25-2-900	other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries	World Precision Instruments, Germany	1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo	Eickemeyer, Germany	213261
DC Temperature Controler and heating pad	FHC, USA	40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000	Sutter Instruments, USA	P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75	Melag, Germany	08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)	Penn Vector Core, USA	AV-1-20298P
fast green	Roth, Germany	0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)	CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine)	Purdure Products, USA	BSOL32	can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)	Boehringer Ingelheim, Germany		can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment	Bayer, Germany	0191	can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)	Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle	Fine Science Tools, Germany	12050-01
Braided Silk Suture	Fine Science Tools, Germany	18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	for composition see references #16 and #23
internal patch solutions	for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate	Roth, Germany	P027.1	prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V	Fisher Scientific, Germany	920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65	Fisher Scientific, Germany	770180
Sapphire blade	Delaware Diamond Knives		custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16	Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Canada	2012-12699
Patch microscope, BX51WI	Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier	Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A	Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10	Molecular Devices, USA		used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05	Luigs & Neumann, Germany	200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25	Luigs & Neumann, Germany	210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7	Luigs & Neumann, Germany	200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes	World Precision Instruments, Germany	GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber	Satorius Stedim Biotech, Germany	13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE	CoolLED, UK	244-1400	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, UK	pE-ADAPTOR-50E	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470	Rapp Optoelectronic	L70-000	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter	Rapp Optoelectronic	inquire with company	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation)	AHF, Germany	F49-560	Filters can be bought as set F46-008
(beamsplitter)	AHF, Germany	F48-585	Filters can be bought as set F46-008
(emission)	AHF, Germany	F47-630	Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation)	AHF, Germany	F39-472	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(beamsplitter)	AHF, Germany	F43-495W	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(emission)	AHF, Germany	F76-490	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter	Coherent, USA	1098293
IgorPro Software, Version 6	Wavemetrics, USA		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Neuromatic suite of macros for IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA)	Roth, Germany	0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain	Invitrogen	N-21479
agar-agar for embedding and resectioning	Roth, Germany	5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding	SPL Life Sciences		alternatives can be used
Slides, Super Frost	R. Langenbrinck, Germany	61303802	alternatives can be used
cover slips	R. Langenbrinck, Germany	3000302	alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium	Vector Laboratories, USA	H-1000	alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation	Satorius Stedim Biotech, Germany	11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710	Zeiss, Germany