Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Resumo

abordagens optogenética são amplamente utilizados para manipular a atividade neural e avaliar as consequências para o funcionamento do cérebro. Aqui, uma técnica que é descrita por expressão in vivo do activador channelrodopsina óptico, permite a análise ex vivo de propriedades sinápticos de longo alcance específico e conexões neurais locais em circuitos relacionados com o medo.

Resumo

optogenetic abordagens são agora amplamente utilizados para estudar a função de populações neurais e circuitos através da combinação de expressão de proteínas alvo activado por luz e subsequente manipulação da actividade neuronal pela luz. Channelrhodopsins (CHRS) são-canais de catiões de luz fechado e quando fundida com uma proteína fluorescente sua expressão permite a visualização e a activação simultânea de tipos específicos de células e as suas projecções axonais em áreas definidas do cérebro. Através de injecção estereotáxica de vectores virais, as proteínas de fusão CHR pode ser expresso constitutivamente ou condicionalmente em células específicas de uma região do cérebro definido, e as suas projecções axonais pode subsequentemente ser estudados anatomicamente e funcionalmente através da activação optogenetic ex vivo em fatias de cérebro. Isto é de particular importância quando se pretende entender propriedades sinápticas de ligações que não podem ser abordados com as abordagens de estimulação elétrica convencional, ou na identificação de romance affealuguel e conectividade eferente que anteriormente foi mal compreendida. Aqui, alguns exemplos ilustram como esta técnica pode ser aplicada para investigar estas perguntas para elucidar circuitos relacionados com o medo na amígdala. A amígdala é uma região-chave para a aquisição e expressão do medo, e armazenamento de medo e memórias emocionais. Muitas linhas de evidência sugerem que o córtex pré-frontal medial (mPFC) participa em diferentes aspectos da aquisição medo e extinção, mas a sua conectividade preciso com a amígdala está apenas começando a ser entendida. Em primeiro lugar, é mostrado como a activação ex vivo optogenetic pode ser usado para estudar os aspectos da comunicação sináptica entre os aferentes mPFC e células-alvo na amígdala basolateral (BLA). Além disso, está ilustrado que como esta abordagem ex vivo optogenetic podem ser aplicadas para avaliar novos padrões de conectividade utilizando um grupo de neurónios GABAérgicos na amígdala, o cluster paracapsular célula intercalada (mpITC), como um exemplo.

Introdução

ferramentas precisas para visualização e ativação simultânea de conexões específicas entre áreas do cérebro e tipos específicos de neurônios estão se tornando mais importante para entender as conectividade funcional subjacentes função cerebral e doença estados saudáveis. Idealmente, isso implica investigação fisiológica das propriedades sinápticos precisos com que identificaram os neurônios se comunicam. Isto é particularmente verdadeiro para as ligações entre as áreas do cérebro que não podem ser conservados em uma única fatia cerebral aguda. No passado, isto foi largamente conseguido em experiências separadas. Por um lado, marcadores neurais injectados in vivo, foram empregues combinada com luz ou subsequente análise microscópica de electrões de parceiros de pré- e pós-sinápticos. Por outro lado, quando a partir de feixes de fibras da região de origem são preservados e acessíveis na preparação fatia, estimulação eléctrica tem sido utilizada para avaliar os mecanismos de comunicação com células sinápticas na região alvo.

Com o advento de Optogenetics, a expressão específica de canais de catiões de luz fechado, tais como Channelrhodopsins (CHRS) fundida com proteínas fluorescentes, permite agora que a activação de neurónios e as suas trajectórias de axonais embora permitindo a sua visualização e post-hoc de análise anatómica ^{1- 4.} Porque axônios ChR expressam pode ser estimulada mesmo quando separado do somata pai ^5, é possível, em fatias de cérebro para: 1) avaliar entradas de regiões do cérebro que não eram acessíveis com estimulação elétrica convencional, porque tratos de fibras não são separáveis ​​ou a trajetória específica não é conhecida; 2) inequivocamente identificar a região de origem para entradas específicas que foram postuladas, mas incompletamente compreendida; e 3) investigar a conectividade funcional entre tipos celulares definidos, tanto a nível local e nas projeções de longo alcance. Devido a um certo número de vantagens, este mapeamento optogenetic de circuitos em fatias de cérebro tornou-se largamenteLY utilizado nos últimos anos e uma variedade de vectores virais para expressão de chrs marcadas com fluorescência estão prontamente disponíveis a partir de fornecedores comerciais. Algumas das principais vantagens da ativação optogenetic sobre estimulação elétrica convencional não são danos ao tecido devido à colocação de eletrodos de estimulação, a especificidade da estimulação da fibra, porque a estimulação elétrica pode também recrutar fibras de passagem ou outras células vizinhas, e um estímulo igualmente rápida e temporalmente preciso. Além disso, a injecção estereotáxica de vectores virais pode ser facilmente orientada para áreas específicas do cérebro ⁶ e expressão específica condicional ou tipo de célula pode ser conseguido usando expressão de Cre-dependente e / ou promotores específicos ^7. Aqui, esta técnica é aplicada para o mapeamento de longo alcance e circuitos locais no sistema de medo.

A amígdala é uma região-chave para a aquisição e expressão do medo, e armazenamento de medo e memórias emocionais ^8,9. Além froestou a amígdala, o córtex pré-frontal medial (mPFC) e hipocampo (HC), estruturas que são mutuamente ligadas à amígdala, estão implicadas nos aspectos de aquisição, consolidação e recuperação de medo e extinção memórias ^10,11. Actividade em subdivisões do mPFC parece desempenhar um papel duplo no controle de alta e baixa medo afirma ^12,13. Isso pode em parte ser mediada por conexões diretas de mPFC para a amígdala que controlaria atividade da amígdala e saída. Por isso, nos últimos anos, vários estudos começaram em ex vivo experimentos fatia para investigar as interações sinápticas entre aferentes mPFC e células-alvo específicos na amígdala ^14-17.

Durante a aprendizagem medo, a informação sensorial sobre os estímulos condicionado e incondicionado atinge a amígdala através de projeções de regiões do tálamo e córtex específicos. Plasticidade destes insumos aos neurônios na parte lateral (LA) da basolamígdala ateral (BLA) é um importante mecanismo subjacente medo condicionado ^9,18. Evidências crescentes sugerem que os processos de plástico paralelas na amígdala envolvem elementos inibitórios para controlar memória do medo ^19. Um grupo de neurônios inibitórios em cluster são os GABAérgicos paracapsular intercalados células mediais (mpITCs), mas a sua conectividade e função precisa não é completamente compreendida ^20-22. Aqui, o mapeamento do circuito optogenética é utilizado para avaliar aferentes e eferentes conectividade dessas células e seu impacto sobre os neurônios-alvo na amígdala, demonstrando que mpITCs recebe entrada sensorial direta de estações retransmissoras talâmicos e corticais ^23. expressão específica do ChR em mpITCs ou neurônios BLA permite o mapeamento das interações locais, revelando que mpITCs inibir, mas também são mutuamente ativado por, BLA principais neurônios, colocando-os em circuitos inibitórios feed-forward e feedback novos que controlam eficazmente a atividade BLA23.

Protocolo

declaração de ética: Todos os procedimentos experimentais foram de acordo com a directiva da UE sobre a utilização de animais em pesquisa e foram aprovados pelo Animal Care local e Comitê de Uso (Regierungspräsidium Tuebingen, estado de Baden-Württemberg, Alemanha), responsável pela Universidade de Tübingen.

1. Processo de injeção estereotáxica

1. Preparar as ferramentas estéreis (tesouras, bisturis, pinças, perfuração, agulhas, material de sutura), utilizando um esterilizador. Providenciar ferramentas estéreis e soluções necessárias outras fontes e cirurgia, tais como permutas estéreis algodão, desinfectante, estéril tamponada de fosfato salino (PBS, pH 7,4) e H ₂ O ₂ em uma cobertura cirúrgica estéril.
2. Puxar as micropipetas de vidro para injectáveis ​​(Figura 1A, inserir) utilizando a 3 mm de largura de filamentos caixa em um microeléctrodo horizontal puxador de acordo com as instruções do fabricante.
   Nota: Para injecções profundas, a conicidade eléctrodo deve ser suficientementetempo para atingir as ventrais maioria das coordenadas (aproximadamente 5 mm;. para coordenadas, ver 1.10).
3. Pré-mistura 1 ml de solução de vírus e 0,2 ul de solução verde rápido 0,1% em PBS estéril (para melhor visibilidade da solução na pipeta de vidro). Preencha pipetas de vidro com uma mistura de solução de vírus e verde rápido usando uma pipeta de microlitro com uma ponta fina (Figura 1A, inserir).
   Nota: Trabalhar com adeno-associados vectores virais recombinantes (rAAV) é considerado um nível de segurança biológica (BSL 1) de trabalho e tem de ser realizado num laboratório BSL 1. rAAVs utilizados neste estudo (Figura 1C) foram: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (sorotipo 2/9) ^16; 2) MGM / PIN: rAAV-Cagh-ChR2 (H134R) -mCherry (sorotipo 2/9) ^23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotipo 2/1) ²³
4. Anestesiar um rato usando um pequeno aparelho de anestesia de animais (isoflurano: 3% em oxigênio para a indução).
   Nota: Os ratos utilizados neste estudo foram 4 -7 semanas de idade e uma das seguintes estirpes e genótipos: C57BL6 / J tipo selvagem (experiência nas Figuras 2A e 3A-D); GAD67 ^GFP-24 (experiência nas Figuras 2B e 3E-H); TAC2-Cre ²⁵ (experimento nas Figuras 2C e 3I-J).
5. Raspar a cabeça entre as orelhas e os olhos. Aplicar desinfectante (providone de iodo-base) para a cabeça raspada usando cotonetes.
6. Aplique uma pomada para evitar a secagem dos olhos durante a anestesia. Injectar subcutaneamente rato com analgésico (, 0,1 ml de 5 mg de solução de base de meloxicam / ml).
7. Coloque rato na moldura estereotáxica (Figura 1A) e manter a anestesia através de uma máscara de anestesia de gás (isoflurano: 2% em oxigénio para manutenção). Verifique a profundidade da anestesia usando reflexo de retirada do membro antes de continuar.
   Nota: Manter condições estéreis, bem como possível durante todo o procedimento cirúrgico; usar máscara descartável, go cirúrgicaWN e luvas.
8. Faça incisão na pele em cima da cabeça com uma tesoura. Com cuidado, puxe a pele para o lado usando uma pinça sem corte, fixe com grampos para expor a superfície do crânio, e crânio limpo com H ₂ O _2.
9. Locais de injecção marca no crânio usando uma multa buracos ponta do marcador e perfuração permanentes para ambos os hemisférios (Figura 1B). Coordenadas para injeções neste estudo são (da bregma (mm)): mPFC: anterior 1.9, lateral ± 0,3, ventral 2.1; MGM / PIN: posterior 3.0, lateral ± 1,8, ventral 3,8; mpITC / BLA: 1,45 posterior, lateral ± 3,35, 4,75 e ventral.
10. Montar pipeta de vidro cheio sobre a armação estereotáxica ligado a um dispositivo de injecção e a pressão para trazer a posição da pipeta bregma.
11. Quebre a ponta da pipeta de vidro usando pinça fina reta de ponta. Faça isso com cuidado para evitar a geração de aerossol de solução de vírus. Certifique-se a ponta da pipeta é aberta através da aplicação de alguns pulsos de pressão e observando extrusão de gotas de virusolução s.
12. Ir para as coordenadas de injeção desejados e injetar metade do conteúdo da pipeta (~ 0,5 mL) utilizando as seguintes definições no dispositivo de injeção de pressão: Pressão: 20 psi, duração média de pulso: 30 ms, o número médio de pulsos: 50.
13. Deixar no lugar pipeta para ~ 1 min antes de se lentamente (1 mm / min) retirá-los.
    Nota: Certifique-se de pipeta não está bloqueada antes de repetir o procedimento com o mesmo pipeta sobre outro hemisfério. Em caso de ponta bloqueado, limpa ou quebrar ponta ea posição da pipeta zero no bregma novamente.
14. crânio limpo com PBS (pH 7,4), remova grampos, puxe a pele juntos, e suturar a incisão com sutura botão individual (3 - 4 nós). Aplicar desinfectante (providona-iodo com base) em torno da ferida.
15. Pare a anestesia e não deixar o mouse sem vigilância até que esteja totalmente acordado. Mantenha única alojados ou retornar à companhia de outros animais apenas quando estiver totalmente recuperado. No pós-operatório, continuar a monitorizar o estado de saúde, e adminisTer analgésico, se necessário. Siga os procedimentos de acordo com as regras apresentadas pelo Comitê Animal Care e Use o local.

2. Preparação de fatias aguda

1. Prepare ACSF, solução de corte, ferramentas (tesouras, bisturi, pinças, espátula, Pasteur pipeta) e blocos de agar.
   Nota: 1 L de fluido cérebro-espinal artificial (ACSF) é necessária por experiência, e é preparado por dissolução de produtos químicos em bidestilada _H2O como publicado anteriormente ^16,23. Solução de corte é preparado suplementando 200 ml de ACSF com 0,87 ml de uma solução M de estoque 2 _MgSO4.
2. ACSF oxigenado e solução de corte ao longo da experiência, com 95% de _O2 e 5% de CO _2.
3. Profundamente anestesiar rato usando um pequeno aparelho de anestesia animal utilizando isoflurano (3% em oxigênio). Verifique a profundidade da anestesia usando reflexo de retirada do membro antes de continuar.
4. Decapitar rato usando tesouras grandes e chill imediatamentecabeça na solução de corte gelada.
5. Abrir crânio por uma única incisão na linha média do caudal a rostral e empurre pedaços de crânio para os lados usando uma pinça. Rapidamente remover cérebro, levantando-o suavemente para fora do crânio usando uma pequena espátula arredondado. Cortar cerebelo com bisturi. Coloque cerebral em solução de corte gelada.
6. Para locais de injecção mPFC: cortar parte anterior do cérebro (contendo mPFC) utilizando um bisturi e colocados em solução de corte gelada até cortar.
7. Remover solução de corte o excesso com um papel de filtro e cola na parte posterior do cérebro para o palco vibratome.
8. Para fatias amígdala inclinadas, cole o cérebro em um corte do bloco de ágar (4%) em um ângulo de 35 ° (Figura 1D, no meio). Para fatias amígdala coronais, locais de injecção MGM / PIN e locais de injecção mPFC, cole o cérebro diretamente no palco (Figura 1D, esquerda e direita). Coloque um bloco de agar adicional por trás do cérebro para a estabilidade, enquanto cortando.
9. Placfase E em corte da câmara de corte com uma solução oxigenado gelado que é mantida a 4 ° C utilizando uma unidade de arrefecimento. Prepare fatias agudas da amígdala (320 microns) usando uma lâmina de safira. Coloque fatias numa câmara de interface fornecido com ACSF oxigenado à TA.
10. Após a preparação de fatias agudas amígdala, colocar a câmara de interface num banho de água a 36 ° C para recuperar fatias por 35 - 45 min. Subsequentemente, voltar a câmara de interface para a TA. Para gravar a partir dessas fatias, prossiga com o passo 3.2.
11. Durante o início da etapa 2.10, cortar fatias dos locais de injecção como descrito antes para fatias amígdala agudas (passos 2,8-2,9). Recuperação de fatias no banho de água não é necessária aqui. Opcional: Para estimar rapidamente local no local da injecção, observe fatias em um estereoscópio equipado com uma lâmpada fluorescente e filtros adequados.
12. Fix fatias contendo locais de injecção para análise post-hoc por intercalando-os entre dois papéis de filtro e submerging-los em 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS solução O / N. Para a análise de locais de injecção continue com o passo 4.1.

3. Visualização e estimulação de fibras pré-sinápticos

1. Prepare microscópio patch para activação optogenetic de fibras e células:
   1. Centralize o diodo emissor de montada (LED) para a via de entrega de luz.
   2. Medir a intensidade da luz de LED no plano focal posterior e na saída de cada objectivo com um medidor de potência escolher o comprimento de onda de 470 nm adequado.
   3. Calcule a intensidade da luz em mW / mm ² e criar uma curva de calibração (intensidade LED (%) versus saída de luz (mW / mm ²⁾⁾ para cada objetivo para valores medidos para 470 nm de comprimento.
2. Recuperar uma fatia amígdala aguda a partir da câmara de interface e o local na câmara de fatia montado no microscópio vertical equipado com uma lâmpada fluorescente. Tome cuidado para posicionar a fatia de modo que a slice a superfície voltada para cima na câmara de interface também é voltada para cima na câmara de gravação. Perfundir fatia com ASCF fresco, oxigenado a uma taxa de 1-2 ml / min a uma temperatura de ~ 31 ° C.
3. Observe fibras pré-sinápticos na fatia usando a lâmpada fluorescente em combinação com filtros adequados para a proteína fluorescente específico expresso. Use objectivo 5x obter uma visão geral (Figura 1E), e 60x objectivo para a avaliação de densidade de fibras dentro da área alvo.
   Nota: Para GFP e YFP, o uso de filtro definir "verde" (Excitação 472/20, Refletor 495, Emissão 490 LP) para mCherry usar filtro definido "vermelho" (Excitação 560/40, Refletor 585, Emissão 630/70), conforme especificado na tabela de materiais / equipamentos.
4. Abrir ou restringir a abertura no percurso de luz do microscópio como desejado para a experiência (Figura 2D).
5. Para obter uma gravação de remendo, preencher uma pipeta de patch com uma solução interna e montar isuporte do eletrodo n. Aplique uma pressão positiva para a pipeta patch e abaixe lentamente pela primeira vez na solução do banho e depois sob controle visual na fatia usando o micromanipulador.
   1. Aproxime-se do neurônio de interesse com a pipeta patch a partir do lado e superior. Libertar a pressão positiva quando a pipeta está na superfície da célula (covinha visível na superfície da célula) e obter um "gigaseal" por aplicação de pressão negativa.
   2. Aplicar mais sucção à ruptura do remendo de membrana para se obter a gravação de célula inteira. Posteriormente, estimular fibras marcadas com o LED ligado usando o comprimento de onda apropriado para ativar Chr (470 nm) durante a gravação de respostas elétricas da célula.
   3. Para a estimulação sináptica começar com uma intensidade do LED de baixo e aumentar até a amplitude da corrente sináptica desejada seja atingida. Acionar o LED, configurando saídas digitais no software de aquisição de dados para controlar o comprimento de tempo e pulso (exemplos na Figura3).
      Nota: Outras software e / ou TTL de geração de dispositivos podem ser usados ​​para acionar LED.
6. Repita estimulação com abertura aberta ou restrita (passo 3.4) na via de luz do microscópio como desejado para a célula seguinte gravada e / ou na presença de fármacos específicos.
7. Após a gravação, corrigir fatias para análise post-hoc por intercalando-os entre dois papéis de filtro e submergindo-os em 4% PFA O / N.
8. Analisar dados eletrofisiológicos.
   Nota: Use o software adequado para visualizar os dados de varredura registrados para cada estímulo indivíduo offline. Quando a análise dos efeitos de drogas, utilizar rotinas de detecção de pico para obter a evolução no tempo do efeito do fármaco em amplitudes de corrente sinápticas para todos os varrimentos individuais. Determinar quando o efeito da droga atinge o estado estacionário. Para preparar respostas médios representativos de figuras, usar o software para médias ≥10 varreduras individuais por condição experimental (cf Figura 3B-D, FH, J painel da direita).
   Nota: várias alternativas pacotes de software pode ser utilizado para a análise de dados.

4. análise post-hoc de locais de injecção

1. Lavar as fatias de locais de injecção (do passo 2.12) e registo dos sítios (se re-imagem é desejada, a partir do passo 3,7) três vezes em PBS. Isto é feito através da substituição de uma solução várias vezes com PBS fresco num agitador rotativo três vezes durante 10 min.
2. Preparar a solução de agar-agar a 2% em PBS, e deixe esfriar para ~ 65 ° C. Coloque as fatias planas na parte inferior de um pequeno prato de 30 milímetros de diâmetro petri, incorporar fatias em ágar-ágar e deixe esfriar até sólido.
3. Cole um bloco de agar com uma fatia ou fatias incorporado ao palco de um vibratome e coloque estágio no corte de câmara com PBS.
4. Ressecção fatias a 70 mm de espessura incorporado. Opcional: Após a ressecção, fatias podem ser coradas, ou seja, com Neurotrace para revelar citoarquitetura (Figura 3A, C), e / ou bimunofluorescência y para YFP ou mCherry para aumentar o sinal da proteína de fusão Chr.
5. fatias de montagem em lâminas e lamela com meios de montagem. Locais de injecção imagem e, se desejado, também as fatias de imagem contendo fibras nas áreas de projecção utilizando um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal de laser de varrimento (Figura 2A-C).

Resultados

Esta seção mostra o fluxo de trabalho de uma abordagem ex vivo optogenética e resultados representativos de diferentes estratégias experimentais para investigar as propriedades fisiológicas das projeções sensoriais e moduladores de longo alcance para BLA e neurônios mpITC bem como propriedades de conectividade local entre mpITC e BLA.

Após a injecção estereotáxica de o vector viral seleccionado nas coorden...

Discussão

Este protocolo descreve um método para ex vivo investigação optogenetic dos circuitos neurais e conectividade local que pode ser facilmente implementados na maioria, se não todos, verticais fatia de gravação de patch-clamp setups, equipando-os com um ~ 470 LED no porto luz epifluorescência nm. Uma grande vantagem da estimulação optogenetic de projecções axonais em fatias é que ele permite a activação e a investigação das propriedades de ligações que não eram acessíveis com estimulação elé...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgery
Stereotactic frame	Stoelting, USA	51670	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor	Stoelting, USA	51625	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice	Stoelting, USA	50264	no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer	Toohey Company, USA	T25-2-900	other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries	World Precision Instruments, Germany	1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo	Eickemeyer, Germany	213261
DC Temperature Controler and heating pad	FHC, USA	40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000	Sutter Instruments, USA	P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75	Melag, Germany	08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)	Penn Vector Core, USA	AV-1-20298P
fast green	Roth, Germany	0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)	CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine)	Purdure Products, USA	BSOL32	can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)	Boehringer Ingelheim, Germany		can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment	Bayer, Germany	0191	can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)	Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle	Fine Science Tools, Germany	12050-01
Braided Silk Suture	Fine Science Tools, Germany	18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	for composition see references #16 and #23
internal patch solutions	for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate	Roth, Germany	P027.1	prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V	Fisher Scientific, Germany	920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65	Fisher Scientific, Germany	770180
Sapphire blade	Delaware Diamond Knives		custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16	Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Canada	2012-12699
Patch microscope, BX51WI	Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier	Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A	Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10	Molecular Devices, USA		used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05	Luigs & Neumann, Germany	200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25	Luigs & Neumann, Germany	210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7	Luigs & Neumann, Germany	200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes	World Precision Instruments, Germany	GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber	Satorius Stedim Biotech, Germany	13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE	CoolLED, UK	244-1400	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, UK	pE-ADAPTOR-50E	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470	Rapp Optoelectronic	L70-000	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter	Rapp Optoelectronic	inquire with company	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation)	AHF, Germany	F49-560	Filters can be bought as set F46-008
(beamsplitter)	AHF, Germany	F48-585	Filters can be bought as set F46-008
(emission)	AHF, Germany	F47-630	Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation)	AHF, Germany	F39-472	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(beamsplitter)	AHF, Germany	F43-495W	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(emission)	AHF, Germany	F76-490	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter	Coherent, USA	1098293
IgorPro Software, Version 6	Wavemetrics, USA		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Neuromatic suite of macros for IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA)	Roth, Germany	0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain	Invitrogen	N-21479
agar-agar for embedding and resectioning	Roth, Germany	5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding	SPL Life Sciences		alternatives can be used
Slides, Super Frost	R. Langenbrinck, Germany	61303802	alternatives can be used
cover slips	R. Langenbrinck, Germany	3000302	alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium	Vector Laboratories, USA	H-1000	alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation	Satorius Stedim Biotech, Germany	11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710	Zeiss, Germany