Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Riepilogo

approcci optogenetic sono ampiamente utilizzati per manipolare l'attività neurale e valutare le conseguenze per le funzioni cerebrali. Qui, una tecnica è descritto che dopo espressione in vivo dell'attivatore ottica channelrhodopsin, consente ex vivo analisi delle proprietà sinaptici di specifici gittata e connessioni neurali locali in circuiti paura correlati.

Abstract

approcci optogenetic sono ora ampiamente usati per studiare la funzione di popolazioni neuronali e circuiti combinando espressione mirata di proteine ​​luce-attivati ​​e successiva manipolazione dell'attività neurale dalla luce. Channelrhodopsins (CHRS) sono cationi canali luce-dipendenti e quando fuso con una proteina fluorescente loro espressione permette la visualizzazione e l'attivazione simultanea di specifici tipi cellulari e le loro proiezioni assonale in aree definite del cervello. Via iniezione stereotassica di vettori virali, proteine ​​di fusione CHR possono essere costitutivamente o condizionatamente espressi in cellule specifiche di una regione del cervello definito, e le loro proiezioni assonale possono essere successivamente studiato anatomicamente e funzionalmente via ex vivo attivazione optogenetic in fettine di cervello. Questo è di particolare importanza quando si punta a capire le proprietà sinaptiche di connessioni che non potevano essere affrontate con approcci convenzionali di stimolazione elettrica, o per identificare romanzo affeaffitto e connettività efferente che è stato precedentemente poco conosciuta. Qui, alcuni esempi illustrano come questa tecnica può essere applicata per studiare queste domande a chiarire i circuiti paura legate nell'amigdala. L'amigdala è una regione chiave per l'acquisizione e l'espressione di paura, e lo stoccaggio di memorie emozionali paura e. Molte linee di evidenza suggeriscono che la corteccia prefrontale mediale (mPFC) partecipa a diversi aspetti di acquisizione paura e l'estinzione, ma la sua connettività preciso con l'amigdala è appena iniziando a essere capito. In primo luogo, si mostra come ex vivo di attivazione optogenetic può essere utilizzato per studiare gli aspetti della comunicazione sinaptica tra le afferenze mPFC e cellule bersaglio nell'amigdala basolaterale (BLA). Inoltre, è illustrato come questo approccio optogenetic ex vivo può essere applicato per valutare modelli di connettività nuovi utilizzando un gruppo di neuroni GABAergici nell'amigdala, il cluster paracapsular intercalate cellule (mpITC), come esempio.

Introduzione

strumenti precisi per la visualizzazione e l'attivazione simultanea di connessioni specifiche tra aree cerebrali e specifici tipi di neuroni stanno diventando sempre più importante per capire le connettività funzionale sottostanti sani stati funzioni cerebrali e malattie. Idealmente, questo comporta indagini fisiologica di precise proprietà sinaptiche con cui i neuroni comunicano identificati. Ciò è particolarmente vero per i collegamenti tra aree cerebrali che non possono essere conservati in una sola fetta cerebrale acuto. In passato, questo è stato ampiamente raggiunto in esperimenti separati. Da un lato, traccianti neurali iniettate in vivo sono stati impiegati in combinazione con conseguente leggero o analisi al microscopio elettronico di partner pre e post-sinaptici. D'altra parte, quando tratti di fibre provenienti dalla regione di origine sono conservati e accessibili nella preparazione fetta, stimolazione elettrica è stato usato per valutare i meccanismi di comunicazione sinaptici con celle nella regione di destinazione.

Con l'avvento della optogenetics, l'espressione mirata di cationi canali luce-dipendenti, come Channelrhodopsins (CHRS) fuso con proteine ​​fluorescenti, consente ora di attivazione dei neuroni e loro traiettorie assonale pur consentendo la loro visualizzazione e post-hoc analisi anatomica ^{1- 4.} Perché assoni CHR-esprimono possono essere stimolati anche se isolate dal genitore somata ^5, è possibile in fettine di cervello a: 1) valutare ingressi da regioni cerebrali che non erano accessibili con la stimolazione elettrica convenzionale, in quanto tratti di fibre non sono separabili o la traiettoria specifica non è noto; 2) in modo inequivocabile identificare la regione di origine per gli ingressi specifici che sono stati postulate ma non completamente compresi; e 3) studiare la connettività funzionale tra i tipi di cellule definite, sia a livello locale e nelle proiezioni a lungo raggio. A causa di una serie di vantaggi, questa mappatura optogenetic di circuiti in fettine cerebrali è diventato ampiamente utilizzato negli ultimi anni, e una varietà di vettori virali per l'espressione di CHRS fluorescenti-taggato sono prontamente disponibili da fornitori commerciali. Alcuni vantaggi chiave di attivazione optogenetic sopra stimolazione elettrica convenzionale sono danni al tessuto a causa di posizionamento di elettrodi di stimolazione, la specificità della stimolazione fibra, perché la stimolazione elettrica può altresì assumere fibre di passaggio o di altre cellule vicine, e una stimolazione altrettanto rapido e temporalmente precisi. Inoltre, l'iniezione stereotassica di vettori virali può facilmente essere mirati a specifiche aree cerebrali ⁶ e specifica espressione condizionale o cellula-tipo può essere ottenuto utilizzando l'espressione Cre-dipendente e / o promotori specifici ^7. Qui, questa tecnica viene applicata per la mappatura di lungo raggio e circuiti locali nel sistema paura.

L'amigdala è una regione chiave per l'acquisizione e l'espressione di paura, e lo stoccaggio di memorie emozionali ^8,9 paura e. Oltre from l'amigdala, la corteccia prefrontale mediale (mPFC) e l'ippocampo (HC), strutture che sono reciprocamente collegati al amigdala, sono implicati in aspetti di acquisizione, il consolidamento e il recupero di paura e di estinzione ricordi ^10,11. Attività in suddivisioni del mPFC sembra giocare un doppio ruolo nel controllare sia alta e bassa la paura afferma ^12,13. Questo potrebbe in parte essere mediato da collegamenti diretti da mPFC all'amigdala che avrebbe controllato l'attività e l'uscita amigdala. Pertanto, negli ultimi anni, diversi studi hanno iniziato a ex vivo esperimenti fetta di indagare le interazioni sinaptiche tra afferenze mPFC e cellule bersaglio specifici nell'amigdala ^14-17.

Durante l'apprendimento la paura, le informazioni sensoriali sulla stimoli condizionati e incondizionati raggiunge l'amigdala attraverso proiezioni specifiche regioni del talamo e corticali. Plasticità di questi ingressi ai neuroni nella parte laterale (LA) del Basolamigdala ateral (BLA) è un importante meccanismo alla base condizionamento alla paura ^9,18. Una crescente evidenza suggerisce che i processi di plastica paralleli nell'amigdala coinvolgono elementi inibitori per il controllo della memoria timore ^19. Un gruppo di neuroni inibitori cluster sono i mediale paracapsular intercalate cellule GABAergici (mpITCs), ma la loro connettività e precisa funzione non è completamente compresa ^20-22. Qui, la mappatura del circuito optogenetic viene utilizzato per valutare la connettività afferenti ed efferenti di queste cellule e il loro impatto sui neuroni bersaglio nell'amigdala, dimostrando che mpITCs ricevono input sensoriali direttamente dalle stazioni talamici e corticali relè ^23. espressione specifica del CHR mpITCs o neuroni BLA permette la mappatura delle interazioni locali, rivelando che mpITCs inibiscono, ma sono anche reciprocamente attivato, BLA neuroni principali, mettendoli in nuovi circuiti inibitori feed-forward e retroazione che controllano efficacemente l'attività BLA23.

Protocollo

dichiarazione etica: Tutte le procedure sperimentali erano in conformità con la direttiva UE sulla uso di animali nella ricerca e sono stati approvati dalla cura degli animali locali e del Comitato Usa (Regierungspräsidium Tuebingen, stato di Baden-Württemberg, Germania) responsabile per l'Università di Tubinga.

1. procedura di iniezione stereotassica

1. Preparare strumenti sterili (forbici, bisturi, pinze, trapano, aghi, materiale di sutura) utilizzando uno sterilizzatore. Disporre strumenti sterili e altre soluzioni necessarie e le forniture di chirurgia quali swap sterili di cotone, disinfettante, sterile tampone fosfato (PBS, pH 7,4), e H ₂ O ₂ su un telo chirurgico sterile.
2. Tirare micropipette di vetro per iniezioni (Figura 1A, inserto) con 3 mm di larghezza scatola filamento su un microelettrodo orizzontale estrattore secondo le istruzioni del produttore.
   Nota: Per le iniezioni in profondità, il cono elettrodo dovrebbe essere sufficientementelungo per raggiungere le ventrali maggior parte delle coordinate (circa 5 mm. per le coordinate, vedi 1.10).
3. Premix 1 ml di soluzione di virus e 0,2 ml di 0,1% soluzione verde veloce in PBS sterile (per una migliore visibilità della soluzione nel pipetta di vetro). Riempire pipette di vetro con la miscela di soluzione di virus e verde veloce con una pipetta microlitro con una punta fine (Figura 1A, nel riquadro).
   Nota: Lavorare con ricombinanti vettori virali adeno-associati (rAAV) è considerato livello di biosicurezza 1 (BSL 1) il lavoro e deve essere eseguita in un BSL 1 laboratorio. rAAVs utilizzati in questo studio (Figura 1C) sono stati: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (sierotipo 2/9) ^16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (sierotipo 2/9) ^23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1A-DIOhChR2 (H134R) -YFP (sierotipo 2/1) ²³
4. Anestetizzare un mouse utilizzando una piccola macchina animale anestesia (isoflurano: 3% di ossigeno per l'induzione).
   Nota: I topi utilizzati in questo studio sono stati 4 -7 settimane di vita e dei seguenti ceppi e genotipi: C57Bl6 / J wild type (esperimento nelle figure 2A e 3A-D); GAD67-GFP ²⁴ (esperimento nelle figure 2B e 3E-H); TAC2-Cre ²⁵ (esperimento nelle figure 2C e 3I-J).
5. Radersi la testa tra le orecchie e gli occhi. Applicare il disinfettante (Providone iodio-based) per la testa rasata utilizzando tamponi di cotone.
6. Applicare una pomata oculare per evitare l'essiccazione degli occhi durante l'anestesia. Sottocutanea iniettare mouse con analgesici (0,1 ml di 5 mg / soluzione meloxicam basata ml).
7. Posizionare il mouse nel frame stereotassico (Figura 1A) e mantenere l'anestesia tramite una maschera di anestesia del gas (isoflurano: 2% di ossigeno per la manutenzione). Controllare la profondità dell'anestesia con arto ritiro reflex prima di continuare.
   Nota: Mantenere condizioni sterili, nonché possibile durante tutta la procedura chirurgica; indossare maschera usa e getta, Go chirurgicawn, e guanti.
8. Fare incisione cutanea sulla parte superiore della testa con le forbici. Tirare delicatamente la pelle a lato con pinze smussato, fissare con fascette per esporre superficie del cranio, e cranio pulito con H ₂ O _2.
9. Siti di iniezione segno sul cranio con una multa fori marcatori e trapano permanenti di punta per entrambi gli emisferi (Figura 1B). Coordinate per iniezioni in questo studio sono (da Bregma (mm)): mPFC: anteriore 1.9, laterale ± 0.3, 2.1 ventrale; MGM / PIN: posteriore 3.0, laterale ± 1.8, 3.8 ventrale; mpITC / BLA: posteriore 1.45, laterale ± 3,35 e 4,75 ventrale.
10. Montare pipetta di vetro riempito sul telaio stereotassico collegato ad un dispositivo di iniezione a pressione e portare la pipetta in posizione Bregma.
11. Rompere la punta della pipetta di vetro con pinza sottile diritto-punta. Fate questo delicatamente per evitare la generazione di aerosol di soluzione virus. Assicurarsi che la punta della pipetta è aperto mediante l'applicazione di un paio di impulsi di pressione e osservando estrusione di gocce di Virusoluzione s.
12. Vai alle coordinate iniezione desiderati e iniettare la metà del contenuto della pipetta (~ 0,5 ml) utilizzando le seguenti impostazioni del dispositivo di iniezione a pressione: Pressione: 20 psi, durata media di impulso: 30 ms, numero medio di impulsi: 50.
13. Lasciare pipetta in posizione per ~ 1 min prima lentamente (1 mm / min) richiamo della medesima.
    Nota: Assicurarsi che la pipetta non sia bloccato prima di ripetere procedura con lo stesso pipetta sulla emisfero. In caso di punta bloccato, pulire o rompere punta e la posizione della pipetta zero Bregma di nuovo.
14. Pulire cranio con PBS (pH 7,4), rimuovere i morsetti, tirare delicatamente la pelle insieme, e suturare l'incisione con sutura singolo pulsante (3 - 4 nodi). Applicare il disinfettante (Providone iodio-based) intorno alla ferita.
15. Arrestare il anestesia e non lasciare incustodita del mouse fino a quando è completamente sveglio. Mantenere singola alloggiati o tornare alla compagnia di altri animali solo se pienamente recuperato. Dopo l'intervento, continuerà a monitorare lo stato di salute, e amminiter analgesico se necessario. Seguire le procedure in base alle leggi formulate dal Comitato di cura degli animali e uso locale.

2. Preparazione di acuta fette

1. Preparare ACSF, soluzione di taglio, strumenti (forbici, bisturi, pinze, spatola, pipetta Pasteur), e blocca agar.
   Nota: 1 L di artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF) è richiesto per ogni esperimento, e viene preparata sciogliendo sostanze chimiche nel doppio distillata H ₂ O come precedentemente pubblicato con il ^16,23. Soluzione di taglio viene preparata completandola 200 ml di ACSF con 0,87 ml di 2 M MgSO ₄ soluzione madre.
2. ACSF Ossigenare e soluzione di taglio durante l'esperimento con 95% O ₂ e 5% CO _2.
3. Profondamente anestetizzare mouse utilizzando una piccola macchina animale anestesia con isoflurano (3% di ossigeno). Controllare la profondità dell'anestesia con arto ritiro reflex prima di continuare.
4. Decapitare mouse usando forbici grandi e subito rilassarsitesta in soluzione di taglio ghiacciata.
5. Aprire il cranio da una singola incisione mediana da caudale a rostrale e spingere delicatamente pezzi di cranio ai lati con pinze. Rapidamente rimuovere cervello sollevando delicatamente fuori cranio con una piccola spatola arrotondata. Tagliare il cervelletto con bisturi. Mettere cervello in soluzione di taglio ghiacciata.
6. Per i siti di iniezione mPFC: tagliare parte anteriore del cervello (contenente mPFC) con un bisturi e mettere in soluzione di taglio ghiacciata fino affettare.
7. Rimuovere soluzione di taglio in eccesso con carta da filtro e incollare la parte posteriore del cervello sul palco vibratome.
8. Per fette amigdala inclinati, incollare il cervello su un taglio di blocco di agar (4%) con un angolo di 35 ° (Figura 1D, al centro). Per fette amigdala coronali, siti di iniezione MGM / PIN e siti di iniezione mPFC, incollare il cervello direttamente sul palco (Figura 1D, a destra ea sinistra). Posizionare un blocco di agar aggiuntivo dietro cervello per la stabilità, mentre affettare.
9. Place fase in camera di taglio con soluzione di taglio ossigenato ghiacciata che viene mantenuta a 4 ° C utilizzando un gruppo di raffreddamento. Preparare fette acuta dell'amigdala (320 micron) con una lama zaffiro. Mettere le fette in una camera di interfaccia fornito con ACSF ossigenato a temperatura ambiente.
10. Dopo la preparazione di fette amigdala acute, posizionare la camera di interfaccia a bagnomaria a 36 ° C per recuperare fette per 35 - 45 min. Successivamente, riportare la camera di interfaccia per RT. Per la registrazione da queste fette, procedere con passo 3.2.
11. Durante l'inizio della fase di 2.10, tagliare delle fette dei siti di iniezione, come descritto in precedenza per le fette amigdala acute (passi 2,8-2,9). Il recupero di fette nel bagnomaria non è necessario qui. Facoltativo: per stimare rapidamente posizione del sito di iniezione, osservare le fette su uno stereoscopio dotato di una lampada fluorescente e appositi set di filtri.
12. Fissare fette contenenti siti di iniezione per l'analisi post-hoc da loro sandwich tra due carte da filtro e submerli ging in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS soluzione O / N. Per l'analisi dei siti di iniezione procedere con passo 4.1.

3. Visualizzazione e stimolazione delle fibre Presinaptico

1. Preparare microscopio di patch per l'attivazione optogenetic di fibre e cellule:
   1. Centrare il diodo montato emissione luminosa (LED) sul percorso di consegna luce.
   2. Misurare l'intensità della luce LED in corrispondenza del piano focale posteriore e all'uscita di ciascun obiettivo con un misuratore di potenza scelta opportuna lunghezza d'onda di 470 nm.
   3. Calcolare l'intensità della luce in mW / mm ² e creare una curva di calibrazione (intensità del LED (%) rispetto emissione luminosa (mW / mm ²⁾⁾ per ciascun obiettivo per valori misurati per 470 nm.
2. Recuperare una fetta dell'amigdala acuta dalla camera dell'interfaccia e posto nella camera fetta montato sul microscopio verticale dotato di una lampada fluorescente. Fare attenzione a posizionare la fetta in modo tale che il SLICe superficie rivolta verso l'alto nella camera di interfaccia è anche rivolto verso l'alto nella camera di registrazione. Profumato fetta fresca, ASCF ossigenata ad una velocità di 1 - 2 ml / min ad una temperatura di ~ 31 ° C.
3. Osservare fibre presinaptiche nella fetta utilizzando la lampada fluorescente in combinazione con appositi set di filtri per la proteina fluorescente specifica espresso. Utilizzare obiettivo 5x per ottenere una visione d'insieme (Figura 1E), e 60x oggettiva per la valutazione della densità delle fibre all'interno della zona di destinazione.
   Nota: Per GFP e YFP, utilizzare il filtro impostato "verde" (eccitazione 472/20, divisore di fascio 495, Emissione 490 LP) per mCherry utilizzare il filtro impostato "rosso" (eccitazione 560/40, divisore di fascio 585, Emissione 630/70), come specificato nella tabella materiali / attrezzature.
4. Aprire o limitare l'apertura nel percorso ottico del microscopio come desiderato per l'esperimento (Figura 2D).
5. Per ottenere una registrazione patch, riempire una pipetta di patch con una soluzione interna e montare iportaelettrodo n. Applicare una pressione positiva alla pipetta di patch e abbassare lentamente in primo luogo nella soluzione bagno e poi sotto il controllo visivo nella fetta utilizzando il micromanipolatore.
   1. Avvicinatevi al neurone di interessi con la pipetta di patch di lato e in alto. Rilasciare pressione positiva quando la pipetta è sulla superficie della cellula (fossetta visibile sulla superficie cellulare) ed ottenere un "gigaseal" applicando pressione negativa.
   2. Applicare in seguito alla rottura di aspirazione la patch di membrana per ottenere la registrazione a cellula intera. Successivamente, stimolare fibre marcate con LED collegato utilizzando la lunghezza d'onda appropriata per attivare ChR (470 nm) durante la registrazione risposte elettriche dalla cella.
   3. Per la stimolazione sinaptica iniziare con una bassa intensità LED e aumentare fino a raggiungere la ampiezza della corrente sinaptica desiderato. TRIGGER il LED configurando uscite digitali nel software di acquisizione dei dati di controllare i tempi e il polso lunghezza (esempi della Figura3).
      Nota: altri software e / o TTL che generano i dispositivi possono essere utilizzati per attivare LED.
6. Ripetere stimolazione con diaframma aperto o ristretto (passo 3.4) nel percorso ottico del microscopio come desiderato per la cella successiva registrati e / o in presenza di farmaci specifici.
7. Dopo la registrazione, correggere le fette per l'analisi post-hoc da loro sandwich tra due carte da filtro e sommergendo nel 4% PFA O / N.
8. Analizzare i dati elettrofisiologici.
   Nota: Usare un software adatto per la visualizzazione dei dati spazzata registrati per ogni singola linea di stimolazione. Quando si analizzano gli effetti delle droghe, utilizzare routine di rilevamento di picco per ottenere andamento nel tempo degli effetti della droga su ampiezze delle correnti sinaptiche per tutti i singoli spazza. Determinare quando l'effetto della droga raggiunge lo stato stazionario. Per preparare le risposte medi rappresentativi per le figure, utilizzare il software per la media ≥10 singoli spazza ogni condizione sperimentale (cf figura 3B-D, FH, J pannello di destra).
   Nota: diversi pacchetti software alternativi possono essere utilizzati per l'analisi dei dati.

4. analisi post-hoc dei siti di iniezione

1. Lavare le fette di siti di iniezione (dal punto 2.12) e la registrazione siti (se ri-immagini si desidera, dal punto 3.7) per tre volte in PBS. Questo viene fatto ripetutamente sostituendo soluzione PBS fresco su un agitatore rotante per tre volte per 10 min.
2. Preparare soluzione al 2% agar-agar in PBS, e lasciarlo raffreddare a ~ 65 ° C. Mettere le fette appoggiati sul fondo di un piccolo piatto di 30 millimetri di diametro di Petri, incorporare fette in agar-agar e lasciate raffreddare fino solido.
3. Incollare un blocco di agar con la fetta o fette incorporato per la fase di un vibratome e mettere in primo piano in camera di taglio con PBS.
4. La resezione fette a 70 micron di spessore incorporato. Opzionale: Dopo resezione, fette possono essere colorati, cioè con Neurotrace rivelare citoarchitettura (Figura 3A, C), e / o by colorazione immunofluorescenza per YFP o mCherry per amplificare il segnale proveniente dalla proteina di fusione ChR.
5. fette di montaggio su vetrini e vetrino con mezzi di montaggio. Siti di iniezione Immagine e, se desiderato, anche le porzioni di immagine contenenti fibre nelle aree di proiezione usando un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale a scansione laser (Figura 2A-C).

Risultati

Questa sezione mostra il flusso di lavoro di un approccio optogenetic ex vivo e risultati rappresentativi di diverse strategie sperimentali per studiare le proprietà fisiologiche delle proiezioni sensoriali e modulatorie a lungo raggio a BLA e neuroni mpITC così come le proprietà di connettività locale fra mpITC e BLA.

Dopo l'iniezione stereotassica del vettore virale selezionato le coordinate desiderate nel c...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo per ex vivo indagini optogenetic dei circuiti neurali e la connettività locale che può essere facilmente implementato sulla maggior parte, se non tutti, in posizione verticale fetta configurazioni di registrazione patch-clamp dotandoli di un ~ 470 LED al porto luce epifluorescenza nm. Uno dei principali vantaggi della stimolazione optogenetic di proiezioni assonale in fette è che permette l'attivazione e ricerca di proprietà di connessioni non accessibili con stimola...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgery
Stereotactic frame	Stoelting, USA	51670	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor	Stoelting, USA	51625	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice	Stoelting, USA	50264	no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer	Toohey Company, USA	T25-2-900	other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries	World Precision Instruments, Germany	1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo	Eickemeyer, Germany	213261
DC Temperature Controler and heating pad	FHC, USA	40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000	Sutter Instruments, USA	P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75	Melag, Germany	08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)	Penn Vector Core, USA	AV-1-20298P
fast green	Roth, Germany	0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)	CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine)	Purdure Products, USA	BSOL32	can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)	Boehringer Ingelheim, Germany		can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment	Bayer, Germany	0191	can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)	Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle	Fine Science Tools, Germany	12050-01
Braided Silk Suture	Fine Science Tools, Germany	18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	for composition see references #16 and #23
internal patch solutions	for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate	Roth, Germany	P027.1	prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V	Fisher Scientific, Germany	920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65	Fisher Scientific, Germany	770180
Sapphire blade	Delaware Diamond Knives		custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16	Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Canada	2012-12699
Patch microscope, BX51WI	Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier	Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A	Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10	Molecular Devices, USA		used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05	Luigs & Neumann, Germany	200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25	Luigs & Neumann, Germany	210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7	Luigs & Neumann, Germany	200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes	World Precision Instruments, Germany	GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber	Satorius Stedim Biotech, Germany	13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE	CoolLED, UK	244-1400	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, UK	pE-ADAPTOR-50E	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470	Rapp Optoelectronic	L70-000	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter	Rapp Optoelectronic	inquire with company	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation)	AHF, Germany	F49-560	Filters can be bought as set F46-008
(beamsplitter)	AHF, Germany	F48-585	Filters can be bought as set F46-008
(emission)	AHF, Germany	F47-630	Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation)	AHF, Germany	F39-472	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(beamsplitter)	AHF, Germany	F43-495W	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(emission)	AHF, Germany	F76-490	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter	Coherent, USA	1098293
IgorPro Software, Version 6	Wavemetrics, USA		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Neuromatic suite of macros for IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA)	Roth, Germany	0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain	Invitrogen	N-21479
agar-agar for embedding and resectioning	Roth, Germany	5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding	SPL Life Sciences		alternatives can be used
Slides, Super Frost	R. Langenbrinck, Germany	61303802	alternatives can be used
cover slips	R. Langenbrinck, Germany	3000302	alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium	Vector Laboratories, USA	H-1000	alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation	Satorius Stedim Biotech, Germany	11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710	Zeiss, Germany