Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Özet

Optogenetic yaklaşımlar yaygın nöral aktiviteyi işlemek ve beyin fonksiyonu için sonuçlarını değerlendirmek için kullanılır. Burada, bir teknik optik aktivatör channelrhodopsin in vivo tanımlanması üzerine, korku ile ilgili devreler özel uzun menzilli ve yerel sinirsel bağlantılar sinaptik özellikleri ex vivo analiz için izin verdiği gösterilmiştir.

Özet

Optogenetic yaklaşımlar günümüzde yaygın ışığı ışık ile aktive olan protein ve nöral etkinlik sonraki manipülasyon hedeflenen ifade birleştirerek nöral popülasyonları ve devrelerin işlevini incelemek için kullanılır. Channelrhodopsins (CHRS) ışık geçişli katyon-kanal ve bir flüoresan proteinine olduğunda ekspresyon görselleştirme ve özel hücre tipleri aynı anda harekete geçirmek ve beynin belirli bölgelerde aksonal projeksiyonlar sağlar. Viral vektörlerin stereotaktik enjeksiyon yoluyla, CHR füzyon proteinleri yapısal olarak ya da koşullu tanımlanmış bir beyin bölgesi spesifik hücrelerde eksprese edilebilir, ve aksonal çıkıntılar daha sonra beyin kesitleri ex vivo Optogenetic aktivasyonu yoluyla anatomik ve fonksiyonel olarak incelenebilir. Geleneksel elektriksel stimülasyon yaklaşımlarla ele edilemeyen bağlantılarının sinaptik özelliklerini anlamak amacıyla bu, ya da roman AFFE belirlenmesinde özel bir öneme sahiptirkira ve daha önce çok az anlaşılmış oldu efferent bağlantısı. İşte bir kaç örnek bu teknik amigdala korku ile ilgili devreleri açıklık bu soruları araştırmak için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir. amigdala korku ve duygusal anılar edinilmesi ve korku ifadesi ve depolama için bir anahtar bölgedir. kanıt kaç satır medial prefrontal korteks (MPFC) korku edinimi ve nesli farklı yönlerini katılır, ancak amigdala ile hassas bağlantı sadece anlaşılmalıdır başlıyor düşündürmektedir. Ex vivo Optogenetic aktivasyon bazolateral amigdala (bla) 'de MPFC afferent ve hedef hücreler arasındaki sinaptik iletişim yönlerini incelemek için nasıl kullanılabileceğini İlk olarak, gösterilmiştir. Bundan başka, bu ex vivo Optogenetic yaklaşım, amigdala GABAerjik nöronlar bir grup ile yeni bir bağlantı boyutlarını ölçen uygulanabilir kadar gösterilmiş olup, bir örnek olarak paracapsular birleştirilmiş zigot (mpITC).

Giriş

görselleştirme ve beyin bölgeleri ve nöronların belirli türleri arasında belirli bağlantı eşzamanlı aktivasyonu için hassas aletleri fonksiyonel bağlantı altta yatan sağlıklı beyin fonksiyonu ve hastalık durumları anlamada daha önemli hale gelmektedir. İdeal olarak, bu nöronlar iletişim tespit hangi hassas sinaptik özellikleri fizyolojik soruşturma gerektirir. Bu, tek bir akut beyin diliminde korunamaz beyin alanları arasında bağlantı için geçerlidir. Geçmişte, bu büyük ölçüde ayrı deneylerde elde edilmiştir. Bir yandan, nöral izleyiciler enjekte in vivo daha sonra ışık veya ön ve postsinaptik mümkün elektron mikroskopik analizi ile bir arada kullanılmıştır. Kalkış bölgesinden lif yollarının korunması ve dilim hazırlanmasında erişilebilir Diğer taraftan, elektrik stimülasyonu hedef bölgede hücrelerin sinaptik iletişim mekanizması değerlendirmek için kullanılmıştır.

Kendi görselleştirme ve post-hoc anatomik analiz ^1- için izin verirken optogenetics gelişine, bu tür floresan proteinleri kaynaşmış Channelrhodopsins (Chrs) olarak ışık kapılı katyon kanalları, hedeflenen ifadesi, artık nöronlar ve onların aksonal yörüngeleri aktivasyonunu sağlar ^4. Lif yolları belirli yörünge ayrılabilir olmadığı veya nedeni, 1) geleneksel elektrik stimülasyonu ile erişilebilir değildi beyin bölgelerinden girişleri değerlendirmek: Üst somata ⁵ kopmuş zaman CHR-ifade aksonlar bile teşvik edilebilir, çünkü beyin dilimleri mümkündür bilinmemektedir; 2) tümden öne ama eksik anlaşılmıştır belirli girdiler için menşe bölgeyi tanımlamak; ve 3) hem yerel hem de uzun menzilli projeksiyonlar, tanımlanan hücre tipleri arasında işlevsel bağlantı araştırmak. Çünkü avantajları bir dizi, beyin dilimleri devre Bu Optogenetic eşleme çapında olmuşturly son yıllarda kullanılan ve floresan etiketli CHRS ekspresyonu için viral vektörler, çeşitli ticari satıcılardan kolayca temin edilebilir. elektriksel stimülasyon da geçit veya diğer yakın hücrelerden ve eşit derecede hızlı ve zamansal hassas stimülasyon lifleri işe çünkü geleneksel elektrik stimülasyonu üzerinde optogenetic aktivasyonu bazı önemli avantajları nedeniyle stimülasyon elektrotları, fiber stimülasyon özgüllüğü yerleştirme dokuya hiçbir zarar vardır. Buna ek olarak, viral vektörlerin stereotaktik enjeksiyon kolayca Kre-bağımlı ekspresyonunu ve / veya özel promoterler ⁷ kullanılarak elde edilebilir, belirli beyin bölgelerinde ⁶ ve koşullu veya hücre tipi özel ifadesine hedeflenebilir. İşte, bu teknik korku sisteminde uzun menzilli haritalanması ve yerel devreleri için uygulanır.

Amigdala korku ve duygusal anıları ^8,9 edinimi ve korku ifadesi ve depolama için bir anahtar bölgedir. Apart froamigdala m, medial prefrontal korteks (MPFC) ve hipokampus (HC), karşılıklı olarak amigdala bağlı yapılar, korku ve yok oluş anı ^10,11 edinimi, konsolidasyon ve alma yönleri sorumlu tutulmaktadır. MPFC alt bölümleri aktivite ^12,13 devletler, yüksek ve düşük hem de korku kontrolünde bir çift rol oynadığı düşünülmektedir. Bu kısmen amigdala aktivitesi ve çıkışını kontrol ediyorum amigdala için MPFC doğrudan bağlantıları aracılık olabilir. Bu nedenle, son yıllarda, bazı çalışmalar amigdala ^14-17 yılında MPFC afferentleri ve belirli hedef hücreleri arasındaki sinaptik etkileşimlerini araştırmak için ex-vivo dilim deneyler başladı.

korku öğrenme sırasında, klimalı ve koşulsuz uyaranlara ilgili duyusal bilgiler belirli talamik ve kortikal bölgelerden projeksiyonlar aracılığıyla amigdala ulaşır. Başol lateral (LA) nöronlara bu girdilerin Plastisiteateral amigdala (BLA) korku klima ^9,18 altında yatan önemli bir mekanizmadır. Artan kanıtlar amigdala paralel plastik süreçleri korku bellek ¹⁹ kontrol etmek için inhibitör unsurlar içerdiğini göstermektedir. Kümelenmiş inhibitör nöronların bir grup GABAerjik medial paracapsular enterkale hücreler (mpITCs) vardır, ama bunların kesin bağlantı ve fonksiyon tam olarak ^20-22 anlaşılmaktadır. Burada, optogenetic devre haritalama mpITCs talamik ve kortikal röle istasyonları ²³ doğrudan duyusal girdileri almak olduğunu gösteren, afferent ve efferent bu hücrelerin bağlantı ve amigdala hedef nöronlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılır. mpITCs veya BLA nöronlarda CHR spesifik ifadesi etkili bir BLA aktivitesini kontrol roman ileri beslemeli ve geri bildirim inhibitör devrelerde yerleştirerek, mpITCs engellediğini ortaya, yerel etkileşimlerin haritalama sağlar, aynı zamanda karşılıklı BLA ana nöronlar tarafından aktive edilir23.

Protokol

Etik deyimi: Tüm deneysel prosedürleri araştırmalarda hayvanların kullanımına ilişkin AB direktifi uyarınca ve yerel Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (Regierungspräsidium Tuebingen, Baden-Württemberg, Almanya devlet) Tübingen Üniversitesi'nden sorumlu değildir.

1. Stereotaktik Enjeksiyon Yöntemi

1. Bir sterilizatör kullanılarak steril aletler (makas, neşter, kelepçeler, matkap, iğneler, dikiş malzemesi) hazırlayın. Örneğin steril bir cerrahi örtü steril pamuk swap, dezenfektan, steril fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.4) ve _{H2O 2} gibi steril araç ve diğer gerekli çözümler ve cerrahi malzemeleri düzenlemek.
2. Üreticinin talimatlarına göre yatay bir mikroelektrot çektirmenin bir 3 mm genişliğinde kutu filament kullanarak enjeksiyonlar için cam mikropipetler (Şekil 1A, ek) çekin.
   Not: Derin enjeksiyonları için, elektrot konik yeterince olmalıventral en koordinatları ulaşmak için uzun (yaklaşık 5 mm;. koordinatlar için, 1.10 bakınız).
3. Karışımlar virüsü çözeltisi 1 ul steril PBS içinde% 0.1 hızlı yeşil çözelti, 0.2 ul (cam pipet çözeltisi daha iyi görülmesi için). Ince ucu (Şekil 1A,) ile bir mikrolitre pipet kullanarak virüs çözümü ve hızlı yeşil karışımı ile cam pipetler doldurun.
   Not: rekombinant Adeno-ilişkili viral vektörler (rAAV) çalışma biyogüvenlik seviye 1 (BSL 1) çalışma olarak kabul edilir ve bir BSL 1 laboratuvarda yapılacak gerekiyor. Bu çalışmada, (Şekil 1C) kullanılan rAAVs vardı: 1) MPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotip 2/9) ^16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (serotip 2/9) ^23; 3) mpITC /: Bla, rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotip 2/1) ²³
4. küçük bir hayvan anestezi makinesi (: indüksiyon oksijen içinde% 3 İsofluranın) kullanarak bir fare anestezisi.
   Not: Bu çalışmada kullanılan Fare 4'ü -7 haftalık ve aşağıdaki suşlar ve genotiplerinin: (Şekil 2A ve 3A-D deney) C57BL6 / J yabani tip; GAD67-GFP ²⁴ (Şekil 2B ve 3E-H deney); Tac2-Cre ²⁵ (Şekil 2C ve 3I-J deney).
5. kulak ve gözler arasındaki başını tıraş. pamuklu çubuklarla kullanarak traş kafa dezenfektan (tabanlı providon-iyot) uygulayın.
6. anestezi sırasında gözlerin kurumasını önlemek için bir göz merhemi sürün. Deri altına analjezik ile (meloksikam göre 0.1 ml, 5 mg / ml solüsyon) fare enjekte edilir.
7. (: Bakım için oksijen% 2 İsofluranın) stereotaktik çerçeve (Şekil 1A) fare yerleştirin ve bir gaz anestezi maske ile anestezi korumak. Devam etmeden önce ekstremite çekme refleksi ile anestezi derinliğini kontrol edin.
   Not: tüm cerrahi prosedür sırasında steril olarak mümkün olduğu kadar iyi korumak; tek kullanımlık yüz maskesi giymek, cerrahi gitmekVe eldiven wn.
8. makas kullanarak başın üst deri kesi olun. Yavaşça H ₂ O ₂ ile kafatası yüzeyi ve temiz kafatası açığa çıkarmak için kelepçeler ile düzeltmek, künt forseps kullanarak tarafına cilt çekin.
9. Her iki yarımkürede (Şekil 1B) için iyi bir ipucu kalıcı marker ve matkap delikleri kullanarak kafatası Mark enjeksiyon siteleri. MPFC: Bu çalışmada enjeksiyon (Bregma (mm)) vardır koordinatları anterior 1.9, 0.3 ± yan, ventral 2.1; MGM / PIN: 1.8 ± yan, 3.0 arka ventral 3.8; mpITC /: Bla 3.35 ve 4.75 ventral ± yan, 1.45 posterior.
10. Bir basınçlı enjeksiyon cihazına bağlı stereotaktik çerçeve üzerine dolu cam pipet montaj ve Bregma pozisyonuna pipet getirmek.
11. ince düz uçlu forseps kullanarak cam pipet ucu kesiyorum. virüs çözümü aerosol oluşumunu önlemek için yavaşça yapın. Pipet birkaç basınç darbeleri uygulayarak ve Viru damlalarının ekstrüzyon gözlemleyerek açık olduğundan emin olunsolüsyonu.
12. İstenen enjeksiyon koordinatlarına gidin ve basınçlı enjeksiyon cihazda aşağıdaki ayarları kullanarak pipet içeriği (~ 0.5 ul) yarısı enjekte: Basınç: 20 psi, ortalama darbe uzunluğu: 30 ms, bakliyat ortalama sayısı: 50.
13. bu geri çekme yavaş (1 mm / dakika) önce yaklaşık 1 dakika boyunca yer pipet bırakın.
    Not: pipet diğer yarımkürede aynı pipetle işlemi tekrarlamadan önce bloke olmadığından emin olun. Engellenen ucu durumunda, temiz ya da tekrar bregma ucu ve sıfır pipet konumunu kesiyorum.
14. PBS (pH 7.4) ile temiz kafatası, yavaşça, kelepçeler kaldırmak birlikte cilt çekin ve bireysel düğme sütür ile kesi sütür (3-4 knot). yaranın etrafındaki dezenfektan (tabanlı providon-iyot) uygulayın.
15. anestezi durdurmak ve tamamen uyanık kadar gözetimsiz fareyi bırakmayın. Tek muhafaza tutmak ya da tamamen iyileşti sadece diğer hayvanların şirkete geri dönün. Ameliyat sonrası sağlık durumunun izlemeye devam ve administer analjezik gerekirse. Yerel Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından ileri sürülen kurallara göre prosedürlerini takip edin.

Akut Dilimleri 2. Hazırlık

1. ACSF, kesme çözüm aletleri (makas, neşter, pens, spatula, Pasteur pipeti) ve agar blokları hazırlayın.
   Not: Yapay beyin-omurilik sıvısı (ACSF) 1 L deney başına gerekli olan ve daha önce ^16,23 yayınlanan iki kez damıtılmış _H2O kimyasallar çözülmesiyle hazırlanır. Kesme solüsyon 2 M MgSO ₄ stok çözeltisi 0.87 ml ACSF 200 ml ilave etmek suretiyle hazırlanır.
2. Oksijenat ACSF ve% 95 _O2 ve% 5 _CO2 ile deney boyunca kesme _çözeltisi.
3. Derin izofluran kullanarak küçük bir hayvan anestezi makinesi (oksijen% 3) kullanarak fare uyutmak. Devam etmeden önce ekstremite çekme refleksi ile anestezi derinliğini kontrol edin.
4. Büyük makas kullanarak fare başını kesmek ve hemen soğukbuz gibi soğuk kesim çözüm baş.
5. kaudal gelen rostralinde ve tek orta hat kesi açık kafatası hafifçe forseps kullanarak yanlara kafatası parçaları itin. Hızla hafifçe küçük bir yuvarlak spatula ile kafatasının dışında çekerek beyin kaldırmak. neşter ile beyincik kesti. buz gibi soğuk kesim çözüm beyin yerleştirin.
6. MPFC enjeksiyon siteleri için: (MPFC içeren) bir neşter kullanılarak beynin ön kısmı kesilmiş ve dilimleme kadar buz gibi soğuk kesim çözüm koymak.
7. Bir filtre kağıdı ile aşırı kesim çözüm çıkarın ve vibratome sahneye beynin posterior bölümünü tutkal.
8. Eğik amigdala dilimleri için, 35 ° açı (Şekil 1D, orta) bir agar bloğu (% 4) kesim üzerinde beyin tutkal. Koronal amigdala dilimleri, MGM / PIN enjeksiyon siteleri ve MPFC enjeksiyon siteleri için, (Şekil 1D, sol ve sağ) sahnede doğrudan beyin tutkal. dilimleme sırasında istikrar için beynin arkasındaki ek agar blok yerleştirin.
9. Placbir soğutma birimi ile, 4 ° C'de muhafaza edilir, buz soğukluğunda oksijenli kesme çözeltisi ile bölme kesme e aşaması. Bir safir bıçak kullanarak amigdala (320 mikron) akut dilimleri hazırlayın. Oda sıcaklığında oksijenli ACSF ile birlikte bir ara bölmesi dilimleri yerleştirin.
10. 45 dakika - Akut amigdala dilimleri hazırlanmasından sonra, 35 dilim kurtarmak için 36 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde ara yüz bölümü yerleştirin. Daha sonra, oda sıcaklığına ara yüz bölümü geri döner. Bu dilimler kayıt, adım 3.2 ile devam edin.
11. Akut amigdala dilimleri (- 2.9 2.8 adımları) için daha önce açıklandığı gibi adım 2.10 başlamasından sırasında, enjeksiyon siteleri dilim kesti. su banyosu dilimler geçmesi burada gerekli değildir. İsteğe bağlı: hızlı, enjeksiyon yeri konumunu tahmin floresan lamba ve uygun filtre setleri ile donatılmış bir Stereoskop dilimleri gözlemlemek.
12. iki filtre kağıtları ve Dalg arasına sandviç by-hoc sonrası analizi için enjeksiyon siteleri içeren dilimleri FixPBS çözeltisi O / N% 4 paraformaldehid (PFA) bunları dig. Enjeksiyon sitelerin analizi için adım 4.1 ile devam edin.

Presinaptik Liflerin 3. Görselleştirme ve Uyarım

1. liflerin ve hücrelerin Optogenetic aktivasyonu için yama mikroskop hazırlanması:
   1. Işık teslimat yolunun üzerine monte ışık yayan diyot (LED) merkezi.
   2. arka odak düzlemi de ve 470 nm uygun dalga boyu seçiminde bir güç metre ile her bir amacın çıkışında LED ışık yoğunluğunu ölçün.
   3. MW / mm ² ışık yoğunluğunu hesaplamak ve 470 nm dalga boyundaki için ölçülen değerler için her hedef için (ışık çıkışı (mW / ^mm2) karşı LED yoğunluğu (%)) bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
2. Bir floresan lamba ile donatılmış dik mikroskop üzerine monte dilim odasında arayüz odası ve yerden akut amigdala dilim almak. dilim böyle dilim konumlandırmak için özenarayüz odasında yukarı bakacak e yüzeyi de kayıt odasında yukarı bakacak. ~ 31 ° C'lik bir sıcaklıkta, 2 ml / dak - 1 bir oranda taze oksijenli ASCF sahip dilim serpmek.
3. ifade spesifik floresan proteini için uygun filtre setleri ile birlikte floresan lamba kullanarak dilim presinaptik liflerin gözlemleyin. Bir genel (Şekil 1 E) ve hedef alanı içinde lif yoğunluğu değerlendirmesi için 60x objektif elde etmek için 5x amacı kullanın.
   GFP ve YFP için, kullanım Filtre belirtilen MCherry "kırmızı" (Uyarma 560/40, ışın ayıracı 585, Emisyon 630/70) set filtre kullanın için "yeşil" (Uyarma 472/20, ışın ayıracı 495, Emisyon 490 LP) ayarlayın: Not malzemeler / ekipman tabloda.
4. Aç veya deney (Şekil 2D) için arzu edildiği şekilde bir mikroskop ışık yolu diyaframı kısıtlar.
5. Bir yama kayıt elde etmek için, iç çözümü ile bir yama pipet doldurmak ve ben montajn-elektrotu tutucu. yama pipet pozitif basınç uygulayın ve yavaş yavaş mikromanipülatör kullanarak dilim içine görsel kontrol altında ilk banyo çözeltisi içine ve sonra indirin.
   1. yan ve üstten yama pipet ile ilgi nöron yaklaşın. Pipet (hücre yüzeyinde girinti görünür) hücrenin yüzeyi üzerinde olduğunda, pozitif basınç serbest bırakın ve negatif basınç uygulanarak, bir "gigaseal" elde edilir.
   2. tam hücreli kayıt elde etmek için membran yama rüptüre daha emiş uygulayın. Daha sonra, hücreden elektrik yanıtları kaydederken Chr (470 nm) aktive etmek için uygun dalga boyu kullanılarak bağlanan LED ile etiketlenmiş lifleri uyarır.
   3. sinaptik stimülasyonu için düşük LED yoğunluğu ile başlar ve istenen sinaptik akım genliği ulaşılana kadar artar. Zamanlama ve darbe uzunluğu Şekil (örnekler kontrol etmek için veri toplama yazılımı dijital çıkışları yapılandırarak LED tetik3).
      Not: diğer yazılım ve / veya TTL üreten cihazlar LED tetiklemek için kullanılabilir.
6. ve / veya belirli ilaçların mevcudiyetinde aşağıdaki kaydedilen hücre için arzu edildiği gibi mikroskop ışık yolu açılmış ya da sınırlı açıklığı (aşama 3.4) ile tekrar uyarılması.
7. Kayıttan sonra, iki filtre kağıtları arasına sandviç ve% 4 PFA O / N onları daldırarak-hoc sonrası analizi için dilimleri düzeltin.
8. elektrofizyolojik verileri analiz edin.
   Not: Uygun yazılım her uyarım çevrimdışı kaydedilen tarama verileri görselleştirmek için. ilaçların etkilerini analiz ederken, tüm bireysel tarama için sinaptik akım genlikleri uyuşturucu etkisinin zaman sürecini elde etmek için zirve algılama rutinleri kullanın. ilaç etkisi kararlı duruma ulaştığında belirleyin. Deneysel koşul başına ortalama ≥10 bireysel Piyango yazılım kullanın, rakamlar için temsili ortalama yanıtları hazırlamak için (cf Şekil 3B-D, FHJ sağ panel).
   Not: Birkaç alternatif yazılım paketleri veri analizi için kullanılabilir.

Enjeksiyon Siteleri 4. Post-hoc analizi

1. ve (yeniden görüntüleme adımı 3,7, arzu edildiği takdirde), PBS içinde üç kez sitesi kayıt (adım 2.12) enjeksiyon bölgesi dilimleri yıkayın. Bu arka arkaya 10 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde taze PBS ile üç kez çözelti değiştirerek yapılır.
2. PBS içinde% 2 agar-agar çözeltisi hazırlayın ve ~ 65 ° C'ye kadar soğumaya bırakın. Bir küçük 30 mm çaplı petri altındaki düz yer dilimleri, agar-agar dilimleri gömmek ve katı kadar soğumasını bekleyin.
3. Bir vibratome aşamasında gömülü dilim veya dilimleri ile bir agar bloğu Tutkal ve PBS ile odasını kesme sahne yerleştirin.
4. Rezeksiyon 70 mikron kalınlığında dilim gömülü. İsteğe bağlı: rezeksiyon sonra, dilimler, hücre mimarisini (Şekil 3A, C) ortaya çıkarmak için NeuroTrace ile, yani lekeli olabilir ve / veya bYFP veya mCherry için y immünofloresan boyama Chr füzyon proteininden sinyalini arttırmak için.
5. montaj medya ile slaytlar ve lamel üzerine monte dilimleri. Resim enjeksiyon bölgesi ve eğer istenirse, bir flüoresan mikroskop veya konfokal lazer tarama mikroskobu (Şekil 2A-C) projeksiyon alanlarda lifler ihtiva eden, aynı zamanda görüntü dilimleri.

Sonuçlar

Bu bölümde, duyusal ve modülatör BLA uzun menzilli projeksiyonlar ve mpITC nöronlar yanı sıra mpITC ve BLA arasında yerel bağlantı özelliklerinin fizyolojik özelliklerini araştırmak için bir ex vivo optogenetic yaklaşım ve farklı deneysel stratejiler temsili sonuçların akışını gösterir.

Fare beyin arzu edilen koordinatları için seçilen viral vektörün stereotaktik enjeksiyon sonrasında

Tartışmalar

Bu protokol değilse tüm kolayca çoğunda uygulanabilir nöral devreleri ve yerel bağlantı ex vivo optogenetic soruşturma için bir yöntem açıklanır, Epifloresans ışık limanda bir LED ~ 470 nm ile donatarak dik dilim patch-kelepçe kayıt kurulumları. dilimleri aksonal çıkıntıların Optogenetic uyarım önemli bir avantajı, mukabil lif yollarının bilinmemektedir açık bir şekilde tanımlanmış olup, ya da korunmuş değildi, çünkü belirli bir aktivasyonu ve konvansiyonel elektrik stim?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgery
Stereotactic frame	Stoelting, USA	51670	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor	Stoelting, USA	51625	can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice	Stoelting, USA	50264	no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer	Toohey Company, USA	T25-2-900	other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries	World Precision Instruments, Germany	1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo	Eickemeyer, Germany	213261
DC Temperature Controler and heating pad	FHC, USA	40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000	Sutter Instruments, USA	P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75	Melag, Germany	08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)	Penn Vector Core, USA	AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)	Penn Vector Core, USA	AV-1-20298P
fast green	Roth, Germany	0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)	CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine)	Purdure Products, USA	BSOL32	can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)	Boehringer Ingelheim, Germany		can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment	Bayer, Germany	0191	can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)	Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle	Fine Science Tools, Germany	12050-01
Braided Silk Suture	Fine Science Tools, Germany	18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	for composition see references #16 and #23
internal patch solutions	for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate	Roth, Germany	P027.1	prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V	Fisher Scientific, Germany	920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65	Fisher Scientific, Germany	770180
Sapphire blade	Delaware Diamond Knives		custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16	Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Canada	2012-12699
Patch microscope, BX51WI	Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier	Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A	Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10	Molecular Devices, USA		used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05	Luigs & Neumann, Germany	200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25	Luigs & Neumann, Germany	210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7	Luigs & Neumann, Germany	200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes	World Precision Instruments, Germany	GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber	Satorius Stedim Biotech, Germany	13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE	CoolLED, UK	244-1400	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, UK	pE-ADAPTOR-50E	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470	Rapp Optoelectronic	L70-000	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter	Rapp Optoelectronic	inquire with company	CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation)	AHF, Germany	F49-560	Filters can be bought as set F46-008
(beamsplitter)	AHF, Germany	F48-585	Filters can be bought as set F46-008
(emission)	AHF, Germany	F47-630	Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation)	AHF, Germany	F39-472	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(beamsplitter)	AHF, Germany	F43-495W	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
(emission)	AHF, Germany	F76-490	Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter	Coherent, USA	1098293
IgorPro Software, Version 6	Wavemetrics, USA		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Neuromatic suite of macros for IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com		for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA)	Roth, Germany	0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain	Invitrogen	N-21479
agar-agar for embedding and resectioning	Roth, Germany	5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding	SPL Life Sciences		alternatives can be used
Slides, Super Frost	R. Langenbrinck, Germany	61303802	alternatives can be used
cover slips	R. Langenbrinck, Germany	3000302	alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium	Vector Laboratories, USA	H-1000	alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation	Satorius Stedim Biotech, Germany	11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710	Zeiss, Germany