تحليل الخط-1 Retrotransposition في واحدة نواة مستوى

Summary

نحن هنا توظيف منهجية FISH لتتبع الخط 1 retrotransposition على مستوى نواة واحدة في هوامش كروموسوم من خطوط الخلايا HepG2 التعبير عن ثابت خط 1 الاصطناعية.

Abstract

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Introduction

الإنسان طويل تتخللها النووية العنصر 1 (الخط 1 أو L1) هو عنصر المنتقلة والمستقلة التي تنتشر داخل الجينوم من خلال "نسخ ولصق" آلية retrotransposition. وL1 الإنسان النموذجي هو ~ 6 كيلو بايت طويلة ويتكون من 5'UTR (منطقة غير مترجمة) التي هي بمثابة المروج، إطارين القراءة المفتوحة (ORFS): L1 -ORF1 وL1 -ORF2، و3'UTR مع بوليا . ذيل L1 البروتين -ORF1 ثلاثة مجالات مختلفة هي: مجال لفائف لفائف، RNA الاعتراف الحافز ونطاق C-محطة، بينما بروتين L1 -ORF2 ديه نوكلياز داخلية، عكس الناسخ والسيستين المجالات الغنية ^{1،2،3،4،5.} L1 -ORF1 يسلك أنشطة حمض كوصي النووية، في حين يوفر L1 -ORF2 الأنشطة الإنزيمية، مع كل من البروتينات اللازمة لretrotransposition ^1،2،6.

دورة من L1 retrotransposition يبدأ النسخ من 5'UTR من L1 مرنا bicistronic التي كتبها RNA البلمرة الثاني، النبات إلى السيتوبلازم، والترجمة. في السيتوبلازم، L1 -ORF1 المعارض إما -binding رابطة الدول المستقلة حيث حزم RNA الخاص بها أو -binding العابرة حيث حزم الرنا الأخرى (أي، جيب / SVAS / الكاذبة) لتشكيل الجسيمات بروتين نووي ريبوزي (RNP) مع L1 -ORF2p ^{7، 8.} RNPs نقل من داخل النواة حيث النشاط نوكلياز داخلية من النكات L1 -ORF2p الحمض النووي الجيني (gDNA) للكشف على OH ^- مجموعة ^9، التي هي بدورها تستخدم من قبل الناسخ العكسي لرئيس الوزراء وعكس توليف الحمض النووي الريبي على الحمض النووي من نهاية 3 '. خلال التوليف العكسي، ورصدت في الشق الثاني من الحمض النووي 7-20 سنة مضت من موقع نيك الأصلي لإنشاء فواصل متداخلة التي تمتلئ لتشكيل توقيع تسلسل L1 الإدراج (على سبيل المثال، TTTTAA) دعا الازدواجية الموقع المستهدف (TSD) ^9،10. وتعرف هذه العملية باسم هدفا رئيسيا عكس النسخ (TPRT) ويؤدي إلى insertiعلى النسخ الكاملة أو اقتطاع من L1 / السلطات الوطنية المعينة الأخرى مع TSDs على طرفي تسلسل المدرجة. كما ثبت L1 retrotransposition أن تتم من خلال TPRT مثل غير المتجانسة نهاية الانضمام في بعض الخلايا أنواع ^11.

متجه L1 retrotransposition العاملين في دراستنا هو غير episomal ويتكون من الموسومة L1 -ORF1 و2P يقودها المروجين-CMV L1-5'UTR جنبا إلى جنب (الشكل 1) ^12. وقد وصفت الإصدارات السابقة من هذا البناء في الدراسات التي تستخدم الخميرة والثقافات الخلية البشرية ^13،14،15. اثنين من المروجين CMV متميز يقع في 5 'و 3' تنتهي من ناقلات، مع نهاية 3 'وضعت في اتجاه عكسي لدفع التعبير من النيوميسين بعد الربط والتكامل. الكاسيت مؤشر retrotransposition في نهاية 3 'يتكون من الجين إدراج العقاقير بالنيوميسين إلى L1 -ORFs وتقديم نشط من فصل إلى نصفين بواسطة غلوبفي إنترون مع الجهات المانحة تقسم (SD) ومواقع تقسم متقبل (SA) (الشكل 1). على الاندماج في كروموسوم، وكتب L1 من المروج مشترك لإنتاج الرنا المرسال الذي يتكون من مرنا bicistronic ومرنا بالنيوميسين غير نشط. أثناء معالجة RNA، وتقسم على إنترون الغلوبين من الجين بالنيوميسين لاستعادة جين بالنيوميسين تعمل بكامل طاقتها. يتم حزم مرنا الهجين في الأداء الملاحي المطلوب في رابطة الدول المستقلة وtranslocated الى نواة حيث يتم دمجها في الجينوم إما كامل طول أو اقتطاع الإدراج باستخدام TPRT.

نحن هنا وصف المنهجية التي تستخدم مضان في الموقع التهجين (FISH) مع تحقيقات موجهة تحديدا في الجين بالنيوميسين تقسم (SNeo) لتتبع أنماط -retrotransposiition L1 ومعدلات الإدراج في مستوى نواة واحدة. وأكد كفاءة وخصوصية كشف باستخدام retrotransposition المختصة وبنيات غير كفء وتحقيقات لديتإلخ SNeo أو النيومايسين وغلوبين إنترون تقاطع ^16. حسابات هذه المنهجية لبعض من أوجه القصور في المقايسات retrotransposition ثقافة خلية مقرها، مثل الإدراج متعددة، ومقاومة مستعمرة والتوسع استنساخ مواتية.

Protocol

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. يرجى الرجوع إلى قسم الكواشف حصول على تفاصيل حول كيفية تحضير الكواشف الفردية.

1. التعريف L1 تحقيقات

ملاحظة: المسابر يمكن أن توصف بوصف الكيميائي أو PCR.

1. وضع العلامات الكيميائية
   1. جعل جل الاغاروز 0،7-1٪ في تريس، خلات-EDTA (تاي) العازلة، الحرارة في الميكروويف حتى يذوب، والسماح للهلام لتبرد ثم قم بإضافة إيثيديوم بروميد (0.5 ميكروغرام / مل). تصب في صينية هلام، إضافة أمشاط، والسماح للهلام ليصلب في درجة حرارة الغرفة.
   2. تسمية التحقيق SNeo (1-2 ميكروغرام) مع CY3 أو FITC عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: SNeo يدل على S pliced ​​الجدد الجينات mycin أعرب بعد دورة كاملة من retrotransposition. وهذا التحقيق هو ~ 1000 BP في الحجم. SNeo يمكن PCR تضخيمها من أي ناقل أو من genomجيم الحمض النووي. انظر الجدول المواد والكواشف لمعلومات عن Streptavidin-CY3 / FITC الكواشف وضع العلامات.
   3. خلط SNeo حل المسبار المسمى العازلة مع 1X الحمض النووي تحميل، تحميل في كل بئر وتشغيلها في 75-100 فولت لمدة 15-20 دقيقة.
   4. تصور الفرقة التحقيق باستخدام-الأشعة فوق البنفسجية (UV) المنور. لاحظ أن حجم التحقيق SNeo يمكن تعديلها وقفل نوى حمض (LNA) ويمكن أيضا أن تضاف (الشكل 2).
   5. قطع صفت SNeo المسبار من هلام بشفرة نظيفة، إذابة وتنقية التحقيق SNeo من الجل باستخدام مجموعة PCR تنظيف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      تنبيه: تغطية كل جزء المكشوفة من الجسم مع الدروع الواقية (أي، معاطف المختبر والأشعة فوق البنفسجية واضح قناع الوجه) عند عرض وقطع هلام. انظر الجدول من المواد والكواشف للمعلومات إلى هلام تنقية المنتجات PCR.
   6. إعادة تشغيل 5 ميكرولتر من SNeo صفت التحقيق مع SNeo التحقيق وصفت الامم المتحدة على هلام الاغاروز 0.7٪ (انظر 1.1.1) لخداعزيادة حجم الشركة وفقدان كثافة إشارة (الشكل 2).
   7. تحديد كمية وصفت التحقيق SNeo عن طريق قياس الامتصاصية في 260 نانومتر، وتمييع التحقيق SNeo إلى 10 نانوغرام / مكل في نوكلياز H مجانا ₂ O. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية.
2. PCR وصفها (طريقة بديلة لوضع العلامات التحقيق)
   1. الجمع بين SNeo الاشعال محددة (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 "و 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3 ') مع الكواشف PCR في أنبوب واحد: 13.6 ميكرولتر نوكلياز مجانا H ₂ O؛ 0.1 dATP ميكرولتر، dCTP، dGTP (10 نانومتر)؛ 0.05 ميكرولتر dTTP (10 نانومتر)؛ 0.05 ميكرولتر dUTP البيوتين / dUTP-FITC / CY3 (10 نانومتر)؛ 4 ميكرولتر العودة الكلمات الدلالية 5X العازلة؛ 0.4 ميكرولتر العودة الكلمات الدلالية البلمرة. قالب SNeo 1 ميكرولتر (10 نانوغرام). انظر الجدول المواد والكواشف لمعلومات عن الكواشف PCR.
   2. ضبط كمية من كل كاشف عن طريق ضرب من قبل عدد من العينات.
   3. استخدام المعلمة الدراجات PCR التاليةالصورة لتضخيم والتسمية SNeo تحقيقات: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 62 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
      ملاحظة: درجة الحرارة الصلب يمكن تعديلها أو يمكن الانتهاء التدرج PCR لتحديد درجات الحرارة الصلب المثلى لتحقيقات أخرى.
   4. جعل جل 0،7-1٪ كما في القسم 1.1.1، تحميل ووضع تصور لفرقة التحقيق كما هو الحال في القسم 1.1.4.
   5. قطع وتنقية SNeo التحقيق المسمى كما هو الحال في القسم 1.1.5.
   6. إعادة تشغيل 5 ميكرولتر من SNeo صفت التحقيق مع المسمى الامم المتحدة SNeo التحقيق لتأكيد زيادة حجم وفقدان كثافة إشارة (انظر الشكل 2).
   7. تحديد كمية وصفت التحقيق SNeo التي كتبها الامتصاصية قياس في 260 نانومتر، وتمييع SNeo التحقيق إلى 10 نانوغرام / مكل في نوكلياز H مجانا ₂ O.

2. إعداد ينتشر كروموسوم

1. توليد الحيوانات المستنسخة مستقرة التعبير عن ناقلات العمود الفقري (كنترولل) أو retrotransposition L1 المختصة باستخدام منهجيات اختيار القياسية. ^12،16 بينما استخدمت للصحفيين غير episomal لربط النتائج مع دراسات من النسخ، ويمكن أيضا أن تستخدم ناقلات episomal. تنمو الخلايا معربا عن ستابلي السيطرة أو ناقل L1 (1 × 10 ⁶ خلايا في 10 سم لوحة، مع تعديلات في حجم لوحة مصنوعة حسب الحاجة) في وسائل الاعلام النمو الكامل. لخلايا HepG2، استخدم RPMI-1600، و 10٪ FBS و 200 ميكروغرام / مل من هيغروميسين. تنمو الثقافات إلى 70٪ التقاء عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
   ملاحظة: إن اختيار المتوسطة النمو يعتمد على نوع من الخلايا. وبالنظر إلى أن البلازميدات المستخدمة هنا تحمل أشرطة اختيار كل من هيغروميسين والنيوميسين، ويمكن أيضا أن يتم اختيار مستقرة من الحيوانات المستنسخة مع النيومايسين بعد اختيارهم على هيغروميسين، ولكن المبلغ من النيوميسين يحتاج إلى أن يكون الأمثل لتحديد مستويات التسامح مع كل نوع من الخلايا.
2. إضافة colcemid (0.4 ميكروغرام / مل) إلى مستنبت واحتضان لمدة 90 دقيقة لاعتقال الخلايا في metaphبورصة عمان. في حالة استخدام أنواع مختلفة من الخلايا، تحديد تركيز الأمثل للcolcemid ووقت التعرض (60، 90، و 120 دقيقة) لاعتقال الطورية الأمثل تجريبيا.
3. غسل الخلايا 2X مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X Dulbecco و(DPBS)، ويعرض للتريبسين بإضافة 3-5 مل من 0.25٪ التربسين حل للخلايا واحتضان لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا. تعطيل التربسين مع مبلغ مساو من وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FBS.
4. الطرد المركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، ونضح المتوسطة من الخلية بيليه وغسل الخلايا مع DPBS. نضح كل DPBS، وترك 200 ميكرولتر من DPBS لاعادة تعليق الخلايا. يتم خلط ضمان الخلايا بشكل جيد وأن جميع كتل متفرقة. استخدام الخفقان أو pipetting لطيف لخلط وتفريق كتل وتجنب vortexing ل.
5. إضافة 5 مل من محلول منخفض التوتر (أي 75 ملي بوكل) التي هي قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية قطرة من الحكمة في حين تناوب أنبوب 15 مل أفقيا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انظر الجدول المواد وReagenالخبر للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل حل ناقص التوتر.
6. خلايا الطرد المركزي في 120 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وكرر الخطوات من 2،4-2،5 3X ترك ما يقرب من 200 ميكرولتر من محلول منخفض التوتر لاعادة تعليق الخلايا بعد كل غسل. ضمان أنه في نهاية 3 يغسل، بيليه الأبيض بشكل واضح ومنتفخة.
7. إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من حل Carnoy تثبيتي، وجعل 1: 2، 1: 4، 1: 8، 01:16 التخفيفات في حل Carnoy مثبت. إسقاط 10 ميكرولتر من كل تخفيف على شريحة نظيفة وجافة من حوالي 1 سم فوق وفضح فورا الجانب خالية من انتشار لالبخار الساخن من الماء المغلي لمدة 30 ثانية. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية جعل حل Carnoy مثبت.
8. تجفيف فروق في درجة حرارة الغرفة، وصمة عار مع 0.1 ميكروغرام / مل هويشت-33342 عن طريق الغمر لمدة 15-20 دقيقة في Coplin جرة وغسل 3X مع DPBS. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية جعل حل هويشت-33342.
<لى> مشاهدة ينتشر في مضان المجهر / المرحلة على النقيض في 40X التكبير. بعد تحسين إعداد انتشار، ليس من الضروري أن تكون ملطخة ينتشر مع هويشت-33342. رأي ينتشر على المجهر مرحلة التباين في 10X التكبير لتحديد نوعية انتشار والانفصال كما هو موضح في قسم النتائج (انظر الشكل 3).
9. اختيار ودائرة هوامش جيدة مع نقطة علامة الماس على الجانب الآخر من الشريحة (أي نشر خالية من الجانب).
10. متجر ينتشر في -20 درجة مئوية لمدة تصل الى شهر واحد. تجنب التعرض للرطوبة.

3. الإسفار في الموقع التهجين (FISH)

1. استقرار والتجفيف ينتشر
   ينتشر يوازن الطورية كروموسوم إلى درجة حرارة الغرفة إذا المخزنة في -20 ° C: ملاحظة. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل الكواشف.
   1. ينتشر احتضان كروموسوم الطورية مع 200 ميكرولتر ريبونوكلياز ألف ل1 ساعة على 37 درجة مئوية.
   2. غسل الشرائح العازلة-2X SSC مرتين لمدة 5 دقائق كل تليها الشطف مع 10 ملي حل حمض الهيدروكلوريك.
   3. احتضان ينتشر بنسبة 1٪ البيبسين لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وشطف مع H ₂ O منزوع الأيونات ويغسل مرتين مع العازلة-2X SSC لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   4. احتضان ينتشر مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة ويغسل العازلة في SSC 2X مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   5. يذوى ينتشر عن طريق احتضان لمدة 2 دقيقة في سلسلة الايثانول: 70٪، 80٪، و 95٪ من الإيثانول.
   6. الشرائح الهواء الجاف.
2. التهجين ينتشر مع L1 تحقيقات retrotransposition -labeled (أي SNeo)
   تنبيه: للتحقيقات مباشرة المسمى، والابتعاد عن الضوء في جميع الأوقات. انظر الجدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على وجعل الكواشف.
   1. إضافة 30 نانوغرام من SNeo إلى عازلة التهجين، الحرارة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وبارد لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. إضافة 30 ميكرولتر من SNeo حل التحقيق إلى البريدانتشار منظمة العمل ضد الجوع، وتغطي مع ساترة وختم حواف مع الاسمنت والمطاط. ضمان عدم تشكيل فقاعة.
   3. حرارة الشريحة عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على كتلة الحرارة، وانخفاض تدريجي في درجات الحرارة إلى 37 درجة مئوية، واحتضان بين عشية وضحاها في غرفة ترطيب المظلمة عند 37 درجة مئوية.
3. غسل وعرضها (أو إضافة الجسم المضاد الثانوي)
   تنبيه: للتحقيقات مباشرة المسمى، والابتعاد عن الضوء في جميع الأوقات.
   ملاحظة: انظر جدول المواد والكواشف للحصول على معلومات حول كيفية إعداد. يوصى باستخدام كمية كافية لتغطية انتشار كروموسوم كامل. تذكر أن حجم الفائض سوف تضيع عند إضافة ساترة.
   1. تزج الشرائح العازلة في SSC 2X لإزالة coverslips.
   2. غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن-2X SSC في 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   3. غسل الشرائح عن طريق الغمر في غسل العازلة في 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 2X.
   4. غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن SSC 0.1X في 45 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   5. غسل الشرائح عن طريق الغمر في المخزن SSC 2X في 45 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: ضع جرة Coplin تحتوي عازلة الموصى بها في حمام مائي، وضبط درجة الحرارة إلى 45 درجة مئوية.
   6. الشرائح باردة لدرجة حرارة الغرفة ويوازن الشرائح العازلة في الكشف.
   7. لتحقيقات المسمى مباشرة، انتقل إلى الخطوة 3.4.10.
   8. لتحقيقات المسمى غير المباشرة، كتلة في عرقلة العازلة لمدة 20-30 دقيقة ويغسل 3X في DPBS.
   9. احتضان مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، 5 ميكروغرام / مل streptavidin-FITC، أو αCY3 في عرقلة العازلة) لمدة 1 ساعة.
   10. غسل الشرائح في 2X SSC لمدة 5 دقائق مرتين.
   11. مباين مع هويشت-33342 حل (0.1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقيقة.
       ملاحظة: يتم ذلك تلطيخ وصمة عار الكروموسومات للمشاركة في توطين مع التحقيق.
   12. يغسل في DPBS 3X، إضافة قطرة من المتوسطة المتزايدة، وضع ساترة وختم حواف مع طلاء الأظافر.
   13. تحليل L1 retrotransposition باستخدام المجهر مضان في 40X أماهgnification.

النتائج

ويرد رسم تخطيطي للناقلات retrotransposition L1 في الشكل 1. ويتكون ناقل الجين بالنيوميسين في اتجاه مضاد لL1 ORFS التي تقطعها إنترون الغلوبين في توجيه معنى وتقع بواسطة SD والمواقع SA. عند دمجها بشكل مستقر في كروموسوم، وكتب L1 مرنا من CMV جنبا إلى...

Discussion

وقد تم توظيف منهجيات مثل تسلسل الجينوم بأكمله، معكوس PCR والنشاف جنوب لدراسة L1 retrotransposition. على الرغم من أن هذه المنهجيات هي قيمة للغاية في تحديد مكان وقوع الإدراج L1 داخل الجينوم، تحديا الخلط لجميع من لهم هو الحاجة إلى برمجة في سيليكون لإعادة تجميع متوالي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labeling Probes
Go Tag DNA polymerase	Promega	M3178
GO Tag 10X colorless buffer	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM  in nuclease free water.
dUTP-16-Biotin (0.5mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5mM)	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up kit	Qiagen	1410/0030	Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR Machine			Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.
Agarose	Sigma	A9539
Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparing chromosome Spreads.
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Add Colcemid directly to growth media  to a final concentration of 0.4 µg/mL
1M KCl	Sigma	P9541	Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution
Carnoy Fixative Solution			Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.
Methanol	Sigma	322415
Acetic acid	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.
Diamond Point Marker	Thermo Scientific	750
Frosted Slides	Thermo Scientific	2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	R001100	To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media
Cover slides	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.
Beaker (600ml)	Sigma	CLS1003600	Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.
Nikon Microscope	Nikon	125690	Any microscope can be used to look at spread quality.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials for FISH
Trisodium citrate	Sigma	S1804
Sodium Chroride	Sigma	S3014
Formamide	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfate	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Salmon Sperm DNA	Life Technologies	15632-011
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Ethyl Alcohol	Sigma	459844
Methanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.
Rubber Cement/Cytobond Sealant		2020-00-1
Seven Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Dark Humidified chamber	Sigma	CLS2551
Cover slides	VWR	48366067
Dry Digital Heat Block	VWR	13259
Fluorescence Microscope
20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC)			Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C.
1mg/mL of Rnase A			Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time.
1% Pepsin			Dissolve  pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time.
4% Paraformaldehyde (4% PFA)			Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses.  Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.
Wash Buffer			Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O.
Hybridization Buffer			Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer.  Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount
Detection Buffer			Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.
Blocking Buffer			Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer.
Dehydrating Solution			Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.