Análisis de retrotransposition LINE-1 en el Núcleo Un piso

Resumen

Aquí empleamos la metodología FISH para realizar un seguimiento de retrotransposition LINE-1 a nivel individual en el cromosoma núcleos diferenciales de líneas de células HepG2 que expresan de forma estable LINE-1 sintético.

Resumen

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Introducción

Humana largos períodos de actividad nuclear Elemento-1 (Line-1 o L1) es un elemento móvil autónomo que se propaga dentro del genoma a través de un "copiar y pegar" mecanismo de retrotransposition. A L1 humana típica es ~ 6 kb de largo y consiste en una 5'UTR (región no traducida) que sirve como un promotor, dos marcos de lectura abierta (ORFs): L1 y L1 -ORF1 -ORF2, y una 3'UTR con un polyA . cola de la proteína L1 -ORF1 tiene tres dominios distintos: un dominio de bobina de la bobina, el reconocimiento de ARN motivo y dominio C-terminal, mientras que la proteína L1 -ORF2 tiene endonucleasa, la transcriptasa inversa y la cisteína dominios ricos en ^1.2.3.4.5. L1 -ORF1 exhibe actividad chaperona de ácidos nucleicos, mientras que L1 -ORF2 ofrece actividades enzimáticas, con las dos proteínas necesarias para retrotransposition ^1,2,6.

Un ciclo de L1 retrotransposition comienza con la transcripción de la 5'UTR de L1 mRNA bicistrónico por la ARN polimerasa II, la translocación en el citoplasma, y ​​la traducción. En el citoplasma, L1 -ORF1 exposiciones cualquiera de unión a cis donde los paquetes de su propio ARN o unión a trans donde los paquetes de otros ARN (es decir, de seno / EASV / pseudogenes) para formar una partícula de ribonucleoproteína (RNP) con L1 -ORF2p ^{7, 8.} RNPs translocan en el núcleo donde la actividad de endonucleasa de nicks L1 -ORF2p DNA genómico (gDNA) para exponer un OH ^- grupo ^9, que es a su vez usada por la transcriptasa inversa para cebar y revertir RNA sintetizar al ADN a partir del extremo 3 '. Durante la síntesis inversa, la segunda cadena de ADN se mella 7-20 pb desde el sitio original nick para crear pausas escalonadas que están llenos para formar las secuencias de inserción L1 de firma (por ejemplo, TTTTAA) llamados objetivo sitio duplicaciones (TSD) ^9,10. Este proceso se conoce como la transcripción inversa objetivo prioritario (TPRT) y conduce a insertien de copias completas o truncadas de L1 / otros ADN con DTE en ambos extremos de la secuencia insertada. L1 retrotransposition También se ha demostrado que es mediado a través de TPRT-como unión de extremos en algunos tipos de células ¹¹ no homóloga.

El vector de L1 retrotransposition empleado en nuestros estudios es no episomales y consta de etiquetado L1 -ORF1 y 2p impulsada por los promotores de CMV-L1-5'UTR combinados (Figura 1) ^12. Las versiones anteriores de esta construcción se han descrito en los estudios que utilizan levadura y cultivos de células humanas ^13,14,15. Dos promotores CMV distintos situados en el 5 'y 3' del vector, con el extremo 3 'colocado en orientación inversa para conducir la expresión de la neomicina después de empalme y la integración. El casete indicador de retrotransposición en el extremo 3 'se compone de un gen insertado antisentido neomicina a L1 -ORFs y vuelve inactivo por separación en dos mitades por una globen el intrón con donante empalmado (SD) y sitios aceptores de corte y empalme (SA) (Figura 1). Tras la integración en un cromosoma, L1 es transcrito a partir del promotor común para producir un mRNA que consiste en un mRNA bicistrónico y mRNA neomicina inactivo. Durante el procesamiento del ARN, el intrón de globina se empalma fuera del gen de la neomicina para restaurar un gen de la neomicina totalmente funcional. El ARNm híbrido se empaqueta en un RNP en cis y transloca en el núcleo cuando se integre en el genoma, ya sea como de longitud completa o truncadas inserciones utilizando TPRT.

Aquí se describe una metodología que utiliza hibridación in situ fluorescente (FISH) con sondas dirigidas específicamente al gen de la neomicina empalmado (SNEO) para rastrear los patrones -retrotransposiition L1 y las tasas de inserción a nivel de núcleo único. La eficiencia y la especificidad de la detección se confirmó usando retrotransposition competente y construcciones incompetentes y sondas para detect SNEO o la neomicina y globina intrón ^16. Esto explica la metodología para algunas de las deficiencias de los ensayos de retrotransposición base de cultivo de células, tales como inserciones múltiples, resistencia a la colonia y la expansión clon favorable.

Protocolo

NOTA: Todas las etapas debe llevarse a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Por favor refiérase a la sección Reactivos para obtener más información sobre cómo preparar reactivos individuales.

1. Etiquetado L1 Sondas

NOTA: Las sondas pueden marcarse mediante marcaje químico o PCR.

1. etiquetado químico
   1. Hacer 0,7-1% en gel de agarosa en tampón Tris-acetato-EDTA (TAE), el calor en el microondas hasta que se derrita, permita que el gel se enfríe, y luego añadir bromuro de etidio (0,5 mg / ml). Vierta la mezcla en la bandeja de gel, añadir peines y permitir que el gel se solidifique a temperatura ambiente.
   2. Marcar la sonda SNEO (1-2 mg) con Cy3 o FITC a 37 ° C durante 1 hora, según el protocolo del fabricante.
      NOTA: SNEO denota el gen S pliced ​​micina Neo expresado después de un ciclo completo de retrotransposition. La sonda es de ~ 1000 pb de tamaño. SNEO puede PCR amplificado a partir de cualquier vector o genoma deADN ic. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre estreptavidina con Cy3 / FITC reactivos de marcaje.
   3. Mezclar la solución de la sonda marcada con SNEO tampón de carga de ADN 1x, la carga en cada pocillo y se ejecutan a 75-100 voltios durante 15-20 min.
   4. Visualizar la banda sonda usando un Ultra Violeta-iluminador (UV). Tenga en cuenta que el tamaño de la sonda SNEO se puede ajustar y que el ácido núcleos Lock (LNA) también se puede añadir (Figura 2).
   5. Cut sonda marcada SNEO a partir del gel con una hoja limpia, solubilizar y purificar la sonda SNEO del gel usando un kit de PCR Clean-Up de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      PRECAUCIÓN: Cubierta de todas las partes expuestas del cuerpo con escudos de protección (es decir, batas de laboratorio y mascarilla clara UV) durante la visualización y cortando el gel. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para la información de gel de purificar los productos de PCR.
   6. Vuelva a ejecutar 5 l de SNEO sonda marcada con una sonda marcada con SNEO ONU en un gel de agarosa al 0,7% (véase el punto 1.1.1) para conaumento de tamaño de la empresa y la pérdida de intensidad de la señal (Figura 2).
   7. Cuantificar la cantidad de sonda marcada SNEO midiendo la absorbancia a 260 nm y se diluye la sonda SNEO a 10 ng / ml de alícuotas en nucleasa libre de H ₂ O. almacenar alícuotas a -20 ° C.
2. Etiquetado PCR (método alternativo para el marcaje de la sonda)
   1. Combinar cebadores específicos SNEO (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'y 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') con reactivos de PCR en un solo tubo: 13,6 l de nucleasa libre de H ₂ O; 0.1 dATP l, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 l dTTP (10 nM); 0,05 l dUTP-biotina / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 l Ir Tag 5x tampón; 0,4 l Ir Tag polimerasa; 1 l plantilla SNEO (10 ng). Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre los reactivos de PCR.
   2. Ajustar la cantidad de cada reactivo mediante la multiplicación por el número total de muestras.
   3. Utilice el siguiente parámetro ciclo de PCRs para amplificar y etiquetas SNEO sondas: 95 ° C durante 2 min; 35 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 62 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 60 seg; 72 ° C durante 2 min; Mantener a 4 ° C por tiempo indefinido.
      NOTA: La temperatura de recocido se puede ajustar o PCR gradiente puede ser completado para determinar la temperatura óptima de recocido para otras sondas.
   4. Hacer gel de 0,7-1% que en la sección 1.1.1, la carga y visualizar la banda de la sonda como en la sección 1.1.4.
   5. Cortar y purificar la sonda SNEO etiquetada como en la sección 1.1.5.
   6. Vuelva a ejecutar 5 l de SNEO etiquetados sonda con sonda SNEO ONU marcado aumento para confirmar el tamaño y la pérdida de intensidad de la señal (ver Figura 2).
   7. Cuantificar la cantidad de sonda marcada SNEO por absorbancia a 260 nm medir y diluir la sonda SNEO a 10 ng / ml de alícuotas en nucleasa libre de H ₂ O.

2. Preparar las extensiones de cromosomas

1. Generar clones estables que expresan cadena principal del vector (control) o retrotransposition L1 competente utilizando metodologías de selección estándar. ^12,16 Aunque se utilizaron reporteros no episomales para correlacionar los resultados con los estudios de la transcripción, también se podrían utilizar vectores episomales. Se cultivan las células que expresan de forma estable el control vectorial o L1 (1 x 10 ⁶ células por placa de 10 cm, con ajustes en el tamaño de la placa hechas según sea necesario) en medio de crecimiento completo. Para las células HepG2, utilice RPMI-1600, 10% de FBS y 200 g / ml de higromicina. Los cultivos deben mantenerse a 70% de confluencia a 37 ° C y 5% de _CO2.
   NOTA: La elección del medio de crecimiento depende del tipo de célula. Dado que los plásmidos usados ​​aquí llevan casetes de selección tanto para higromicina y neomicina, la selección de clones estables también se podría hacer con neomicina después de la selección en higromicina, pero la cantidad de neomicina necesita ser optimizado para establecer los niveles de tolerancia para cada tipo de célula.
2. Añadir colcemida (0,4 g / ml) al medio de cultivo y se incuba durante 90 minutos para detener las células en metaphPlaza bursátil norteamericana. Si el uso de diferentes tipos de células, determinar la concentración óptima de colcemid y tiempo de exposición (60, 90, y 120 min) para la detención de la metafase óptima empíricamente.
3. Lavar las células 2 veces con 10 ml de PBS de Dulbecco 1x (DPBS), trypsinize mediante la adición de 3 a 5 ml de 0,25% de solución de tripsina a las células y se incuba durante 5 min para separar las células. Inactivar tripsina con una cantidad igual de medio que contiene 10% de FBS.
4. Centrifugar las células durante 2 min a 1000 xg a 4 ° C, aspirar el medio del sedimento celular y se lavan las células con DPBS. Aspirar todos DPBS, dejando 200 l de DPBS para volver a suspender las células. Asegurar células se mezclan bien y que todos los grumos se dispersan. Utilice el parpadeo o pipeteo suave para mezclar y dispersar aglomeraciones y evitar vórtex.
5. Añadir 5 ml de solución hipotónica (es decir, 75 mM KCl) que se pre-calienta a 37 ° C gota a gota mientras se gira el tubo de 15 ml en horizontal y se incuba a 37 ° C durante 20 min. Véase la Tabla de Materiales y Reagenct para obtener información sobre cómo obtener y hacer una solución hipotónica.
6. centrifugar las células a 120 xg durante 5 min a 4 ° C y repita los pasos 2.4 hasta 2.5 3x dejando aproximadamente 200 l de solución hipotónica para volver a suspender las células después de cada lavado. Asegúrese de que al final de los 3 lavados, el sedimento es visiblemente blanco e hinchado.
7. Vuelva a suspender el precipitado en 200 l de solución de fijador Carnoy y hacer 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 diluciones en solución de Carnoy fijador. Caída de 10 l de cada dilución en un portaobjetos limpio y seco de aproximadamente 1 cm por encima y exponer inmediatamente el lado libre de la propagación de vapor caliente de agua hirviendo durante 30 segundos. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo obtener una solución de fijador Carnoy.
8. Secar los diferenciales a temperatura ambiente, mancha con 0,1 mg / ml Hoechst-33342 por inmersión durante 15-20 min en Coplin Jar y lavar 3 veces con DPBS. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo hacer que la solución Hoechst-33342.
9. Ver extiende en microscopio de fluorescencia / contraste de fase en un aumento de 40X. Después de optimizar la preparación de propagación, los diferenciales no necesitan ser teñidas con Hoechst-33342. Ver extiende en el microscopio de contraste de fase en un aumento de 10X para determinar la calidad de la propagación y la separación como se indica en la sección Resultados (ver Figura 3).
10. Seleccione y el círculo buenos para untar con un punto de rotulador diamante en el lado opuesto de la corredera (es decir, difundir libre lateral).
11. Tienda se extiende a -20 ° C durante un máximo de un mes. Evitar la exposición a la humedad.

3. La hibridación in situ con fluorescencia (FISH)

1. La estabilización de los diferenciales y deshidratando
   NOTA: Equilibrar el cromosoma en metafase se propaga a temperatura ambiente si se almacena a -20 ° C. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo obtener y hacer que los reactivos.
   1. Incubar cromosoma en metafase se extiende con 200 l de RNasa A para1 hora a 37 ° C.
   2. Lavar los portaobjetos en tampón 2x-SSC dos veces durante 5 minutos cada una, seguidas de un enjuague con una solución de HCl 10 mM.
   3. Incubar diferenciales con 1% de pepsina durante 10 min a 37 ° C, enjuague con _H2O desionizada y se lava dos veces con tampón 2x-SSC durante 5 minutos cada uno.
   4. Incubar diferenciales con 4% de paraformaldehído durante 10 min y se lava en tampón SSC 2x dos veces durante 5 min cada uno.
   5. Deshidratar extendido por incubación durante 2 min en serie de etanol: 70%, 80% y 95% de etanol.
   6. diapositivas secar al aire.
2. La hibridación se propaga con sondas L1 retrotransposition marcada con (es decir, SNEO)
   PRECAUCIÓN: Para sondas directas marcado, mantenga lejos de la luz en todo momento. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo obtener y hacer que los reactivos.
   1. Añadir 30 ng de SNEO a tampón de hibridación, el calor a 72 ° C durante 10 min y enfriar durante 2 min a temperatura ambiente.
   2. Añadir 30 l de solución de sonda SNEO aeada propagación, cubrir con cubreobjetos y sellar los bordes con cemento de goma. Asegurar que no la formación de burbujas.
   3. Calentar el portaobjetos a 72 ° C durante 5 minutos en un bloque de calor, deje caer gradualmente la temperatura hasta 37 ° C, y de incubar durante la noche en una cámara húmeda oscuridad a 37 ° C.
3. Lavado y Visualización (o adición de anticuerpo secundario)
   PRECAUCIÓN: Para sondas directas marcado, mantenga lejos de la luz en todo momento.
   NOTA: Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo prepararse. Se recomienda el uso de un volumen suficiente para cubrir toda la extensión de cromosomas. Recuerde que el exceso de volumen se pierde cuando se añade cubreobjetos.
   1. Sumerja los portaobjetos en tampón SSC 2x para eliminar cubreobjetos.
   2. Lavar los portaobjetos por inmersión en tampón 2x-SSC a 45 ° C durante 5 min.
   3. Lavar los portaobjetos por inmersión en tampón de lavado a 45 ° C durante 5 minutos, 2 veces.
   4. Lavado de los portaobjetos por inmersión en tampón 0,1 x SSC a 45 ° C durante 10 min.
   5. Lavar los portaobjetos por inmersión en tampón SSC 2x a 45ºC durante 10 min.
      NOTA: Coloque un vaso de Coplin que contiene tampón recomendado en un baño de agua, ajustar la temperatura a 45 ° C.
   6. Super diapositivas a temperatura ambiente y se equilibran los portaobjetos en tampón de detección.
   7. Para sondas marcadas directos, vaya al paso 3.4.10.
   8. Para sondas marcadas indirectos, bloque en tampón de bloqueo durante 20-30 minutos y lavar 3 veces en DPBS.
   9. Incubar con 50 l de anticuerpo secundario (por ejemplo, 5 mg / ml de estreptavidina-FITC, o αCY3 en tampón de bloqueo) durante 1 hr.
   10. Lavar los portaobjetos en 2x SSC durante 5 minutos dos veces.
   11. Contratinción con solución de Hoechst-33342 (0,1 mg / ml) durante 10 min.
       NOTA: esta tinción se realiza para teñir cromosomas para co-localización con la sonda.
   12. Lavar 3 veces en DPBS, añadir una gota de medio de montaje, colocar un cubreobjetos y sellar los bordes con esmalte de uñas.
   13. Analizar L1 retrotransposition usando microscopio de fluorescencia a 40X magnification.

Resultados

Un diagrama esquemático del vector retrotransposition L1 se presenta en la Figura 1. El vector consiste en un gen de la neomicina en la orientación antisentido con respecto a L1 ORFs que está interrumpido por un intrón de globina en la orientación sentido y emparedada por SD y SA sitios. Cuando se integra de forma estable en un cromosoma, L1 mRNA se transcribe a partir del CMV y el promotor combinado L1-5'UTR (Figura 1).

Discusión

Metodologías como la secuenciación del genoma completo, PCR inversa y transferencia de Southern se han empleado para estudiar L1 retrotransposition. A pesar de estas metodologías son extremadamente valiosos en la localización donde se producen L1 inserciones dentro de los genomas, un desafío de confusión para todos ellos es la necesidad de la programación en silico para volver a montar secuencias. La metodología FISH aquí descrito está diseñado para complementar estos métodos, espe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labeling Probes
Go Tag DNA polymerase	Promega	M3178
GO Tag 10x colorless buffer	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water.
dUTP-16-Biotin (0.5 mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5 mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5 mM)	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up kit	Qiagen	1410/0030	Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR Machine			Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.
Agarose	Sigma	A9539
Preparing chromosome Spreads
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml
1 M KCl	Sigma	P9541	Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution
Carnoy Fixative Solution			Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.
Methanol	Sigma	322415
Acetic acid	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml.
Diamond Point Marker	Thermo Scientific	750
Frosted Slides	Thermo Scientific	2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	R001100	To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media.
Cover slides	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.
Beaker (600 ml)	Sigma	CLS1003600	Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.
Nikon Microscope	Nikon	125690	Any microscope can be used to look at spread quality.
Reagents and Materials for FISH
Trisodium citrate	Sigma	S1804
Sodium Chroride	Sigma	S3014
Formamide	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfate	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Salmon Sperm DNA	Life Technologies	15632-011
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Ethyl Alcohol	Sigma	459844
Methanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml.
Rubber Cement/Cytobond Sealant		2020-00-1
Seven Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Dark Humidified chamber	Sigma	CLS2551
Cover slides	VWR	48366067
Dry Digital Heat Block	VWR	13259
Fluorescence Microscope
20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC)			Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C.
1 mg/ml of Rnase A			Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time.
1% Pepsin			Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time.
4% Paraformaldehyde (4% PFA)			Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.
Wash Buffer			Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O.
Hybridization Buffer			Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount.
Detection Buffer			Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.
Blocking Buffer			Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer.
Dehydrating Solution			Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.