Tek Çekirdek Düzeyde HAT-1 Retrotransposition Analizi

Özet

Burada stabil sentetik LINE-1 ifade eden HepG2 hücre hatlarının kromozom yayılır tek çekirdek düzeyinde HAT-1 retrotransposition izlemek için FISH metodolojisini kullanır.

Özet

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Giriş

İnsan Uzun Interspersed Nükleer Element-1 (Hat-1 veya L1) retrotransposition mekanizmasını bir geçiş genomu içinde yayılır "kopya ve yapıştır" özerk mobil unsurdur. Tipik bir insan L1 ~ 6 kb uzunluğundadır ve bir promoter olarak hizmet veren bir 5'UTR (çevrilmemiş bölgesinin) oluşur, iki açık okuma çerçevesi (ORF): L1 -ORF1 L1 -ORF2 ve polyA bir 3'UTR . bobin bobin alanı, bir RNA tanıma motif ve C-terminal sahası, L1 -ORF2 proteini endonükleaz sahipken, transkriptaz ve sistin zengin alanları ^1,2,3,4,5 tersine: yükleme L1 -ORF1 proteini üç farklı etki vardır. L1 -ORF2 retrotransposition ^1,2,6 için gerekli iki proteinler ile, enzimatik aktiviteleri sağladığına; L1 -ORF1, nükleik asit şaperon aktivitelerini sergiler.

L1 retrotransposition bir döngü L1 5'UTR transkripsiyon ile başlar RNA polimeraz II, translokasyon sitoplazmaya ve çeviri tarafından bicistronic mRNA. Sitoplazma L1 -ORF1 sergiler, ya diğer RNA paketleri kendi RNA paketleri sis bağlayıcı eksojen veya trans bağlayıcı eksojen (örneğin, sinüs / SVAS / sözde genlerin) L1 -ORF2p ⁷ olan bir ribonükleoprotein parçacık (RNP) oluşturmak ^{için, 8.} Bu ana ters transkriptaz tarafından kullanılan da gruptur, ⁹ ve 3 'ucundan DNA sentez RNA ters ^- RNP L1 -ORF2p çentik genomik DNA (gDNA) arasında endonükleaz aktivitesi, OH ortaya çıkarmak için çekirdek içine. Ters sentezi sırasında, DNA'nın ikinci şerit imzası L1 ekleme dizileri (örneğin, TTTTAA) olarak adlandırılan hedef site duplikasyonları (TSD) ^9,10 oluşturmak için doldurulur sendeleyerek kesmeleri oluşturmak için orijinal nick sitesinden 7-20 bp nicked edilir. Bu işlem, hedef ana ters transkripsiyon (TPRT) olarak bilinir ve inserti neden olduğueklenen dizinin her iki ucunda TSDs L1 / diğer DNA'lar tam ya da tepe bölümü kesik kopya ile. L1 retrotransposition aracılığıyla da aracılık ettiği gösterilmiştir homolog olmayan uç birleştirme bazı hücre tiplerinde ¹¹ TPRT benzeri.

Çalışmalarımızda kullanılan L1 retrotransposition vektör epizomal olmayan ve etiketli L1 -ORF1 ve 2p Birleştirilen CMV L1-5'UTR promoterler tarafından tahrik (şekil 1) ¹² oluşur. Bu yapının önceki versiyonları maya ve insan hücre kültürleri ^13,14,15 kullanıldığı çalışmalarda tarif edilmiştir. 3 'ucu yapıştırma ve entegrasyon sonrasında neomisin ekspresyonunu tahrik etmek için ters yönde yerleştirilmiş olan 5' ve 3 'yer alan iki ayrı CMV promoterler, vektörün sona erer. 3 'ucunda retrotransposition göstergesi kaseti L1 -ORFs bir neomisin geni yerleştirilmiş antisens oluşur ve topak iki parçaya ayrılması ile aktif olmayan haleeklenmiş verici (SD) ve eklenmiş alıcı (SA) siteleri (Şekil 1) introna, uygun olarak. Bir kromozom içine entegrasyon üzerine, L1 bir bicistronic mRNA ve inaktif neomisin mRNA oluşan bir mRNA üretmek için ortak promotör transkripsiyonu. RNA işlenmesi sırasında, globin intron tamamen işlevsel bir neomisin geni geri neomisin genin dışında birleştirilir. Hibrid mRNA cis bir RNP içine paketlenmiş ve TPRT kullanılarak tam uzunluklu ya da kesilmiş ya da sokulmasını genomuna entegre edilir çekirdeğe transloke edilmiştir.

Burada tek çekirdek düzeyinde L1 -retrotransposiition desen ve yerleştirme oranlarını izlemek için özel olarak eklenmiş neomisin geni (sneo) yönelik problar ile in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanan bir metodoloji tarif eder. verimlilik ve algılama özgüllüğü det yetkili retrotransposition ve beceriksiz yapıları ve problar kullanılarak teyit edildiEKT sneo veya intron kavşağı ¹⁶ globin neomisin ve. Bu metodoloji, çoklu eklemeler, koloni direnci ve olumlu klon genişleme olarak hücre kültürü temelli retrotransposition deneyleri, eksikliklerin bazıları oluşturmaktadır.

Protokol

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Bireysel reaktifler nasıl hazırlanacağını ilgili ayrıntılar için Reaktifler bölümüne bakın.

1. Etiketleme L1 Probları

NOT: Sondalar kimyasal veya PCR etiketleme etiketli olabilir.

1. kimyasal etiketleme
   1. etidyum bromür (0.5 ug / ml) ekleyin, sonra eriyene kadar, bir mikrodalga Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu, ısı 0.7-1% agaroz jeli yapmak jeli soğumasına izin verin ve. Jel tepsiye dökülür tarak ekleyin ve jel, oda sıcaklığında katılaşmaya sağlar.
   2. üreticinin protokolüne uygun olarak, 1 saat boyunca 37 ° C'de CY3 ya FITC ile sneo probu (1-2 ug) etiketleyin.
      Not: sneo S retrotransposition tam bir döngüsünden sonra ifade Neo Vankomisine geni pliced ​​gösterir. prob boyutu ~ 1000 bp. Sneo PCR herhangi bir vektöre veya genom büyütülmüş edilebiliric DNA. Streptavidin-CY3 / FITC etiketleme reaktif hakkında bilgi almak için Malzemeler ve Reaktifler Tablo bakınız.
   3. her kuyuya 1x DNA yükleme tamponu, yük ile etiketlenmiş sneo prob çözüm karıştırın ve 15-20 dakika boyunca 75-100 voltta çalışır.
   4. Ultra-Violet (UV) Aydınlatıcı kullanarak prob bandı gözünüzde canlandırın. Sneo prob boyutu ayarlanabilir olduğu ve Kilit çekirdekler asit (LNA) de (Şekil 2) eklenebilir kullanılabileceğine dikkat ediniz.
   5. Kesme çözündürülmesi ve imalatçının protokolüne göre, bir PCR Temizleme kiti kullanılarak jelden sneo prob saflaştırılması, temiz bir bıçak ile jelden sneo etiketlenmiş prob.
      DİKKAT: Kapak koruma kalkanları (yani, laboratuvar mont ve UV şeffaf yüz maskesi) ile vücudun her maruz parçası görüntüleme ve jel keserken. PCR ürünleri arındırmak jel bilgi için Malzeme Tablosu ve Reaktifler bakın.
   6. Yeniden çalışma sneo 5 ul% 0.7 agaroz jeli üzerinde un etiketli sneo probu ile etiketlenmiş prob con (1.1.1 bakınız)firma büyüklüğü artışı ve sinyal yoğunluğu kaybı (Şekil 2).
   7. Nükleaz bilgilerini _H2O içinde 260 nm'de absorbans ölçümü ile etiketlenmiş sneo prob miktarını ölçmek ve 10 ng sneo prob seyreltik / ul alikotları -20 ° C'de saklayın alikotları.
2. PCR Etiketleme (prob etiketleme için alternatif yöntem)
   1. Sneo spesifik primerler birleştirin (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 've 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3'), tek bir tüp içine PCR ile: 13.6 ul nükleaz bilgilerini _H2O; 0.1 ul dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0.05 ul dTTP (10 nM); 0.05 ul dUTP-biyotin / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ul tampon 5x Tag git; 0.4 ul Etiket Polymerase git; 1 ul sneo şablonu (10 ng). PCR ile ilgili bilgi için Malzeme ve Reaktifler Tablo bakınız.
   2. Numunelerin toplam sayısı ile çarpılarak her reaktif maddenin miktarını ayarlayın.
   3. Aşağıdaki PCR bisiklet parametresini kullanıns amplifiye ve etiket sneo Probes: 2 dakika boyunca 95 ° C; 30 saniye, 30 saniye için 62 ° C, 60 sn için 72 ° C, 95 ° C 35 döngü; 2 dakika 72 ° C; belirsiz bir süre 4 ° C'de tutun.
      Not: bağlanma sıcaklığı ayarlanabilir veya degrade PCR diğer problar için en uygun tavlama belirlemek için tamamlanabilir.
   4. bölüm 1.1.1, yük gibi 0,7-1% jel yapmak ve bölüm 1.1.4 gibi sonda bandı görselleştirmek.
   5. Kes ve bölüm 1.1.5 gibi etiketlenmiş sneo probu arındırmak.
   6. Yeniden çalışma sneo 5 ul (bakınız Şekil 2) boyut artışı ve sinyal yoğunluğu kaybını doğrulamak için un etiketli sneo probu ile etiketlenmiş prob.
   7. Nükleaz bilgilerini _H2O içinde 260 nm'de absorbans ölçebilecek etiketli sneo prob miktarını ölçmek ve 10 ng sneo prob seyreltik / ul alikotları

2. Hazırlama Kromozom Farkları

1. vektör omurgası ifade stabil klonlar oluşturmak (controStandart bir seçim yöntemleri kullanılarak L) veya retrotransposition yetkin L1. epizomal olmayan muhabir transkripsiyon çalışmaları ile bağlantısının kullanıldı birlikte ^12,16, epizomal vektörleri de kullanılabilir. Stabil kontrol veya L1 vektör tam büyüme ortamı (gerektiği gibi yapılmış plaka boyutu ayarlamaları ile 10 cm plaka başına 1 x 10 ⁶ hücre) ifade eden hücreleri büyür. HepG2 hücreleri, RPMI-1600,% 10 FBS ve higromisin 200 ug / ml,. 37 ° C'de% 70 ortak akışa kadar büyümeye ve kültürler% 5 _CO2.
   Not: büyüme ortamının seçimi, hücre tipine bağlıdır. Burada kullanılan plazmidler higromisin ve neomisin hem seçim kaseti taşıyan göz önüne alındığında, klonların stabil bir seçim higromisin seçimi neomisin ile yapılabilir, ancak neomisin miktarı, her hücre türü için tolerans seviyelerinin tutturulması için optimize edilmesi gerekmektedir.
2. Kültür ortamına colcemid (0.4 ug / ml) ilave edin ve 90 dakika metaph hücreleri yakalamak için inkübease. Farklı hücre tipleri kullanıldığında, deneysel olarak uygun metafaz tutuklama colcemid ve maruz kalma süresi (60, 90 ve 120 dakika) optimal konsantrasyonunu belirlemek.
3. Yıkama hücreleri, hücreler 3-5 mL% 0.25 tripsin solüsyonu eklenip hücreleri ayırmak için 5 dakika boyunca inkübe 1X Dulbecco PBS (DPBS), tripsinize 10 ml 2x. % 10 FBS ihtiva eden ortamın eşit miktarda tripsin inaktive.
4. , 4 ° C'de 1000 x g'de 2 dakika süre ile hücreler santrifüj hücre topağından orta aspire ve DPBS ile yıkama hücreleri. hücrelerin yeniden askıya DPBS 200 ul bırakarak aspire tüm DPBS. Sağlamak hücreler iyice karıştırılır ve kümeleri dağılmış olduğu. mix ve kümeleri dağıtmak ve vorteks önlemek için titrek ve nazik pipetleme kullanın.
5. Hipotonik çözelti 5 ml (yani, 75 mM KCI) yatay olarak 15 ml tüp dönerken 37 ° C'de damla damla önceden ısıtılmış ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Malzeme ve Reagen Tablosu görünelde edilir ve hipotonik bir çözüm nasıl yapılacağı hakkında bilgi almak için ts.
6. Her yıkamadan sonra hücrelerin yeniden askıya hipotonik solüsyon yaklaşık 200 ul bırakarak 2.5 3x - 5 4 ° C'de dakika ve yineleme için 120 xg'de Santrifüj hücreleri 2.4 adımları. 3 yıkar sonunda, pelet gözle görülür beyaz ve şişmiş olduğundan emin olun.
7. Carnoy Sabitleme çözeltisi 200 ul pelet yeniden askıya artı 1: Carnoy Sabitleme çözeltisi içinde 8, 1:16 seyreltme: 2, 1: 4, 1. üzerinde yaklaşık 1 cm bir kuru, temiz slayt üzerine her seyreltme 10 ul damla ve hemen 30 saniye süreyle kaynar su sıcak buhara yayılmış serbest tarafını ortaya çıkarmak. Carnoy Sabitleme çözüm yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.
8. 0.1 ug / ile, oda sıcaklığında, leke yayılır Kuru mi Hoechst-33342 Coplin kavanoza 15-20 dakika boyunca daldırma ile ve yıkama DPBS ile 3 kez. Hoechst-33342 çözüm yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.
9. Görünüm 40X büyütmede floresan / faz-kontrast mikroskop yayılır. Yayılma hazırlık optimize sonra, formalar Hoechst-33342 ile boyanmış olması gerekmez. Görünüm Sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi yayılmış kalite ve ayırma belirlemek için 10X büyütmede faz-kontrast mikroskop yayılır (Şekil 3).
10. Seçip sürgünün karşı tarafında bir elmas noktası Marker iyi yayılır daire (örneğin, yayılabilir içermeyen tarafı).
11. Mağaza bir aya kadar -20 ° C'de yayılır. neme maruz kalmaktan kaçının.

Yerinde Hibridizasyon 3. Floresan (FISH)

1. Yayılır, stabilize edici ve dehidre
   Not: -20 ° C'de muhafaza edildiğinde dengeye metafaz kromozom, oda sıcaklığına kadar yayılır. elde etmek ve reaktifler yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.
   1. Inkübe metafaz kromozom 200 ul RNaz A ile yayılır37 ° C'de 1 saat.
   2. Yıkama her biri 10 mm HCI çözeltisi ile durulama, ardından 5 dakika boyunca iki kez 2 x SSC tamponu-slaytlar.
   3. Deiyonize _H2O ile yıkayın ve her biri 5 dakika için 2X-SSC tamponu ile iki kez yıkanır, 37 ° C'de 10 dakika süre ile% 1 pepsin ile yayılır inkübe edin.
   4. 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile yayılır inkübe ve her biri 5 dakika iki kez 2 x SSC tamponu içinde yıkayın.
   5. % 70,% 80 ve% 95 etanol: etanol seri 2 dakika süreyle inkübe edilerek yayılır dihidrat.
   6. Hava kuru slaytlar.
2. Melezleme L1 -etiketli retrotransposition probları ile yayılır (yani, sneo)
   DİKKAT: Doğrudan etiketli problar için, her zaman ışıktan uzak tutun. elde etmek ve reaktifler yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.
   1. 10 dakika süre ile 72 ° C'de hibridizasyon tamponuna sneo 30 ng, ısıtılır ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca soğutulur.
   2. e sneo prob çözeltisi 30 ul ekleach yaymak, lamel ile kaplayın ve kauçuk çimento ile kenarları mühür. hiçbir kabarcık oluşumunu sağlamak.
   3. yavaş yavaş 37 ° C'ye kadar sıcaklık düşüşü ve 37 ° C de karanlık bir nemlendirilmiş oda içinde bir gece boyunca inkübe bir sıcaklıkta bir blok üzerinde 5 dakika boyunca 72 ° C'de slayt ısıtın.
3. Yıkama ve Görüntüleme (veya İkincil Antikor ilavesi)
   DİKKAT: Doğrudan etiketli problar için, her zaman ışıktan uzak tutun.
   NOT: Malzeme ve nasıl hazırlanacağı konusunda bilgi almak için Reaktifler Tablo bakınız. tüm kromozom yayılmasını karşılamak için yeterli hacimde kullanılması tavsiye edilir. lamel eklendiğinde fazla hacim kaybolur unutmayın.
   1. lamelleri kaldırmak için 2x SSC tamponu slaytlar daldırın.
   2. 5 dakika boyunca 45 ° C'de 2x SSC tamponu-batırılarak slaytlar yıkayın.
   3. 5 dakika sonra 2x 45 ° C'de yıkama tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın.
   4. 10 dakika boyunca 45 ° C'de 0.1X SSC tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın.
   5. 10 dakika boyunca 45 ° C 'de 2X SSC tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın.
      Not: Talep bir su banyosu içinde önerilen tamponu ihtiva eden bir Coplin Kavanoz, 45 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlanır.
   6. Soğuk oda sıcaklığına kadar slaytlar ve algılama tampon slaytlar dengeye.
   7. direkt etiketli problar için, 3.4.10 adıma geçin.
   8. Dolaylı etiketli problar için, 20-30 dakika süreyle ve tampon engelleme blok DPBS 3x yıkayın.
   9. 1 saat boyunca (blokaj tamponu örneğin, 5 ug / ml streptavidin-FITC veya αCY3) ikincil antikor, 50 ul inkübe edin.
   10. iki kez 5 dakika süreyle 2x SSC slaytlar yıkayın.
   11. 10 dakika süre ile Hoechst-33342 solüsyonuna (0.1 ug / ml) ile karşıt.
       NOT: Bu boyama prob ile eş-lokalizasyonu için kromozom leke yapılır.
   12. , Montaj orta bir damla ekleyin, DPBS 3x yıkayın lamel yerleştirin ve tırnak cilası ile kenarları mühür.
   13. 40X ma floresan mikroskop kullanılarak L1 retrotransposition analizgnification.

Sonuçlar

L1 retrotransposition vektörünün şematik bir diyagramıdır, Şekil 1 'de sunulmuştur. Vektörü sens yönlenmede bir globin intronu ile kesilmiş ve SD ve SA siteleri tarafından sandviç L1 ORF antisens yönlenmede bir neomisin geni içerir. Kararlı biçimde bir kromozomda entegre olduğunda, L1 mRNA Birleştirilen CMV ve L1-5'UTR promotörünün (Şekil 1) transkripsiyonu. RNA işlenmesi sırasında, globin int...

Tartışmalar

Böyle tüm genom dizileme, ters PCR ve güney blot olarak metodolojileri L1 retrotransposition incelemek için istihdam edilmiştir. Bu metodolojiler L1 eklemeleri genomları içinde meydana nerede yerini son derece değerli olmasına rağmen, hepsi için bir karıştırıcı zorluk dizileri yeniden birleştirmek için-siliko programlama için ihtiyaçtır. Burada açıklanan BALIK yöntemi, özellikle kültür hücrelerinde ektopik L1 retrotransposition analizleri gerektiren çalı?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labeling Probes
Go Tag DNA polymerase	Promega	M3178
GO Tag 10X colorless buffer	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM  in nuclease free water.
dUTP-16-Biotin (0.5mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5mM)	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up kit	Qiagen	1410/0030	Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR Machine			Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.
Agarose	Sigma	A9539
Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparing chromosome Spreads.
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Add Colcemid directly to growth media  to a final concentration of 0.4 µg/mL
1M KCl	Sigma	P9541	Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution
Carnoy Fixative Solution			Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.
Methanol	Sigma	322415
Acetic acid	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.
Diamond Point Marker	Thermo Scientific	750
Frosted Slides	Thermo Scientific	2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	R001100	To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media
Cover slides	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.
Beaker (600ml)	Sigma	CLS1003600	Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.
Nikon Microscope	Nikon	125690	Any microscope can be used to look at spread quality.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials for FISH
Trisodium citrate	Sigma	S1804
Sodium Chroride	Sigma	S3014
Formamide	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfate	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Salmon Sperm DNA	Life Technologies	15632-011
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Ethyl Alcohol	Sigma	459844
Methanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.
Rubber Cement/Cytobond Sealant		2020-00-1
Seven Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Dark Humidified chamber	Sigma	CLS2551
Cover slides	VWR	48366067
Dry Digital Heat Block	VWR	13259
Fluorescence Microscope
20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC)			Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C.
1mg/mL of Rnase A			Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time.
1% Pepsin			Dissolve  pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time.
4% Paraformaldehyde (4% PFA)			Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses.  Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.
Wash Buffer			Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O.
Hybridization Buffer			Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer.  Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount
Detection Buffer			Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.
Blocking Buffer			Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer.
Dehydrating Solution			Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.