Analisi di LINE-1 retrotrasposizione al Nucleo livello singolo

Riepilogo

Qui ci avvaliamo di una metodologia per monitorare FISH LINE-1 retrotrasposizione a livello di nuclei singolo degli spread dei cromosomi di linee cellulari HepG2 esprimono stabilmente sintetica LINE-1.

Abstract

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Introduzione

Umana Lungo intersperse nucleare Element-1 (Linea-1 o L1) è un elemento mobili ed autonome che si propaga all'interno del genoma attraverso un "copia e incolla" meccanismo di retrotrasposizione. Un tipico L1 umano è lunga ~ 6 kb e consiste di un 5'UTR (Regione Untranslated) che serve come un promotore, due telai di lettura aperti (ORF): L1 -ORF1 e L1 -ORF2, e un 3'UTR con polyA . coda L1 proteina -ORF1 ha tre ambiti distinti: un dominio della bobina a bobina, RNA riconoscimento Motif e dominio C-terminale, mentre la proteina L1 -ORF2 ha endonucleasi, trascrittasi inversa e cisteina domini ricchi ^1,2,3,4,5. L1 -ORF1 presenta attività chaperone acidi nucleici, mentre L1 -ORF2 fornisce attività enzimatiche, con entrambe le proteine ​​necessarie per la retrotrasposizione ^1,2,6.

Un ciclo di L1 retrotransposition inizia con la trascrizione dal 5'UTR di L1 mRNA bicistronico dalla RNA polimerasi II, traslocazione nel citoplasma, e la traduzione. Nel citoplasma, L1 -ORF1 mostre sia -Binding cis dove si confeziona il proprio RNA o -Binding trans dove confeziona altri RNA (vale a dire, seno / SVAS / pseudogeni) per formare una particella ribonucleoproteina (RNP) con L1 -ORF2p ^{7, 8.} RNP traslocano nel nucleo dove l'attività endonucleasi di L1 -ORF2p nick DNA genomico (gDNA) per esporre un OH ^- gruppo ^9, che è a sua volta utilizzato per la trascrittasi inversa per innescare e invertire RNA sintetizzare il DNA dalla fine del 3 '. Durante la sintesi inverso, il secondo filamento di DNA viene scalfito 7-20 bp dal sito originale nick per creare interruzioni sfalsati che sono riempiti per formare le firme sequenza di inserzione L1 (per esempio, TTTTAA) chiamati duplicazioni del sito di destinazione (TSD) ^9,10. Questo processo è noto come primo obiettivo trascrizione inversa (TPRT) e porta a Insertisu di copie complete o tronco di L1 / altri DNA con TSDS a entrambe le estremità della sequenza inserita. L1 retrotrasposizione ha anche dimostrato di essere mediata attraverso TPRT come non omologa end-joining in alcuni tipi di cellule ^11.

Il vettore L1 retrotransposition impiegato nei nostri studi è non-episomiale e consiste contrassegnati L1 -ORF1 e 2p guidata da promotori CMV-L1-5'UTR combinate (Figura 1) ^12. Le versioni precedenti di questo costrutto sono stati descritti in studi utilizzando lievito e colture di cellule umane ^13,14,15. Due promotori CMV distinti situati al 5 'e 3' estremità del vettore, con estremità 3 'collocato in orientamento inverso per guidare l'espressione di neomicina dopo splicing e integrazione. L'indicatore retrotransposition cassette all'estremità 3 'è costituito da un neomicina gene inserito antisenso per L1 -ORFs e reso inattivo mediante separazione in due metà da una globin introni con donatore impiombato (SD) e siti accettore impiombato (SA) (Figura 1). Dopo integrazione in un cromosoma, L1 è trascritto dal promotore comune per produrre un mRNA che consiste di un mRNA bicistronico e inattiva mRNA neomicina. Durante l'elaborazione RNA, l'introne globina è impiombato dal gene neomicina per ripristinare un gene neomicina completamente funzionale. L'mRNA ibrido è confezionato in un RNP in cis e traslocato nel nucleo dove è integrato nel genoma sia come lunghezza totale o troncate inserimenti utilizzando TPRT.

Qui si descrive un metodo che utilizza ibridazione in situ fluorescente (FISH) con sonde specificamente dirette al gene neomicina impiombato (Sneo) per monitorare i modelli -retrotransposiition L1 e tassi di inserimento a livello di nucleo singolo. L'efficienza e la specificità di rilevazione è stata confermata usando retrotrasposizione competente e costrutti incompetenti e sonde per detect Sneo o la neomicina e globina giunzione introne ^16. Questa metodologia rappresenta per alcune delle carenze di analisi retrotrasposizione a base di coltura cellulare, ad esempio più inserimenti, resistenza colonia e l'espansione del clone favorevole.

Protocollo

NOTA: Tutte le fasi deve essere effettuata a temperatura ambiente a meno che diversamente specificato. Si prega di fare riferimento alla sezione Reagenti per i dettagli su come preparare i singoli reagenti.

1. Etichettatura L1 Sonde

NOTA: Le sonde possono essere etichettati, mediante l'etichettatura chimica o PCR.

1. etichettatura chimica
   1. Rendere 0,7-1% gel di agarosio in tampone Tris-acetato-EDTA (TAE), il calore in un forno a microonde fino a fuso, permettono il gel raffreddare, quindi aggiungere etidio bromuro (0,5 mg / ml). Versare in vassoio gel, aggiungere pettini e consentire il gel solidificare a temperatura ambiente.
   2. Etichettare la sonda Sneo (1-2 mg) con CY3 o FITC a 37 ° C per 1 ora secondo il protocollo del produttore.
      NOTA: Sneo indica la S pliced ​​gene mycin Neo espresso dopo un ciclo completo di retrotrasposizione. La sonda è ~ 1000 bp in termini di dimensioni. Sneo può essere PCR amplificato da qualsiasi vettore o da genomic DNA. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su streptavidina-CY3 / FITC reagenti di etichettatura.
   3. Mescolare la soluzione della sonda Sneo etichettato con il tampone 1x DNA di carico, carico in ciascun pozzetto e correre a 75-100 volt per 15-20 minuti.
   4. Visualizza la banda sonda con una viola Ultra-(UV) Illuminatore. Si noti che le dimensioni della sonda Sneo può essere regolato e che serratura nuclei acido (LNA) può anche essere aggiunto (Figura 2).
   5. Cut etichettato sonda Sneo dal gel con una lama pulita, solubilizzare e purificare la sonda Sneo dal gel utilizzando un kit PCR Clean-Up secondo il protocollo del produttore.
      ATTENZIONE: coprire ogni parte esposta del corpo con schermi di protezione (ad esempio, camici da laboratorio e UV chiaro maschera) durante la visualizzazione e il taglio del gel. Vedere la Tabella di materiali e reagenti per le informazioni di gel purificare prodotti di PCR.
   6. Re-run 5 pl di Sneo etichettati sonda con una sonda Sneo non-marcato su un gel di agarosio 0,7% (vedi 1.1.1) per Conaumento dimensione aziendale e perdita di intensità del segnale (figura 2).
   7. Quantificare la quantità di sonda Sneo etichettato misurando l'assorbanza a 260 nm e diluire la sonda Sneo a 10 ng / aliquote microlitri di nucleasi libero H ₂ O. aliquote conservare a -20 ° C.
2. PCR Labeling (metodo alternativo per l'etichettatura sonda)
   1. Combinare primer specifici Sneo (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'e 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') con PCR reagenti in un unico tubo: 13,6 ml nucleasi libero H ₂ O; 0,1 microlitri dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 ml dTTP (10 nM); 0.05 ml dUTP-biotina / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ml Vai Tag 5x tampone; 0,4 ml Vai Tag polimerasi; 1 ml modello Sneo (10 ng). Vedere la Tabella dei materiali e reagenti per informazioni sui reagenti PCR.
   2. Regolare la quantità di ciascun reagente moltiplicando per il numero totale di campioni.
   3. Utilizzare il seguente parametro ciclismo PCRs per amplificare ed etichette Sneo sonde: 95 ° C per 2 min; 35 cicli di 95 ° C per 30 sec, 62 ° C per 30 sec, 72 ° C per 60 sec; 72 ° C per 2 min; Tenere a 4 ° C a tempo indeterminato.
      NOTA: La temperatura di ricottura può essere regolato o gradiente di PCR può essere completata per determinare temperature di ricottura ottimali per altre sonde.
   4. Fare gel 0,7-1% come nella sezione 1.1.1, carico e visualizzare la band sonda come nella sezione 1.1.4.
   5. Tagliare e purificare la sonda Sneo etichettato come nella sezione 1.1.5.
   6. Re-run 5 pl di Sneo etichettati sonda con Sneo sonda di un marcato aumento di confermare le dimensioni e la perdita di intensità del segnale (vedi figura 2).
   7. Quantificare la quantità di sonda Sneo etichettati da assorbanza misurando a 260 nm e diluire la sonda Sneo a 10 ng / aliquote microlitri di nucleasi libero H ₂ O.

2. Preparazione spread cromosomiche

1. Generare cloni stabili che esprimono vettore backbone (Control) o retrotransposition L1 competente utilizzando metodologie di selezione standard. ^12,16 Mentre reporter non episomiale stati usati per correlare risultati con studi di trascrizione, potrebbero anche essere utilizzati vettori episomiale. Crescere cellule che esprimono stabilmente il controllo o L1 vettore (1 x 10 ⁶ cellule per 10 cm piastra, con regolazioni in formato piatto fatte in base alle esigenze) in terreni di crescita completa. Per le cellule HepG2, utilizzare RPMI-1600, 10% FBS e 200 ug / ml di igromicina. Grow culture al 70% di confluenza a 37 ° C e 5% CO _2.
   NOTA: La scelta del mezzo di crescita dipende dal tipo di cellula. Dato che i plasmidi usati qui portano cassette di selezione sia per igromicina e neomicina, la selezione dei cloni stabili potrebbe essere fatto anche con neomicina dopo scelta su igromicina, ma la quantità di neomicina deve essere ottimizzato per stabilire livelli di tolleranza per ciascun tipo di cellula.
2. Aggiungere Colcemid (0,4 mg / ml) per mezzo di coltura e incubare per 90 minuti per arrestare le cellule al Metase. Se utilizzando diversi tipi cellulari, determinare la concentrazione ottimale di Colcemid e del tempo di esposizione (60, 90, e 120 min) per metafase arresto ottimale empiricamente.
3. Lavare le cellule 2x con 10 ml di PBS 1x Dulbecco (DPBS), trypsinize aggiungendo 3-5 ml di 0,25% tripsina soluzione alle cellule e incubare per 5 minuti per staccare le cellule. Inattivare la tripsina con una pari quantità di supporti contenenti il ​​10% FBS.
4. Centrifugare le cellule per 2 min a 1000 xga 4 ° C, aspirare il terreno dal pellet cellulare e lavare le cellule con DPBS. Aspirare tutti DPBS, lasciando 200 ml di DPBS per risospendere le cellule. Assicurarsi che le cellule sono mescolate bene e che tutti i grumi sono disperse. Utilizzare sfarfallio o delicato pipettaggio di mescolare e disperdere grumi ed evitare vortex.
5. Aggiungere 5 ml di soluzione ipotonica (cioè, 75 mM KCl) che è pre-riscaldato a 37 ° C e goccia a goccia durante la rotazione del tubo 15 ml orizzontale e incubare a 37 ° C per 20 min. Vedere la Tabella dei materiali e Reagents per informazioni su come ottenere e rendere soluzione ipotonica.
6. cellule centrifugare a 120 xg per 5 minuti a 4 ° C e ripetere i passaggi 2,4-2,5 3x lasciando circa 200 ml di soluzione ipotonica per risospendere le cellule dopo ogni lavaggio. Assicurarsi che al termine dei 3 lavaggi, il pellet è visibilmente bianca e gonfia.
7. Risospendere il pellet in 200 ml di soluzione di Carnoy fissativo e fare 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 diluizioni in soluzione Carnoy fissativo. Goccia 10 ml di ciascuna diluizione su un vetrino pulito e asciutto da circa 1 cm sopra ed esporre immediatamente il lato libero-diffusione di vapore caldo da acqua bollente per 30 sec. Vedi tabella dei materiali e reagenti per le informazioni su come fare soluzione Carnoy fissativo.
8. Asciugare gli spread a temperatura ambiente, macchia con 0,1 mg / ml Hoechst-33342 per immersione per 15-20 minuti in Coplin vaso e lavare 3x con DPBS. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come rendere la soluzione Hoechst-33342.
9. Visualizza estende su microscopio a fluorescenza / contrasto di fase a 40X di ingrandimento. Dopo l'ottimizzazione preparazione diffusione, spread non devono essere colorati con Hoechst-33342. Vedi estende su microscopio a contrasto di fase a 10X di ingrandimento per determinare la qualità diffusione e la separazione come indicato nella sezione Risultati (vedi figura 3).
10. Selezionare e cerchio buone spread con Diamond Point Marker sul lato opposto della slitta (cioè, si sviluppa senza side).
11. Conservare diffonde a -20 ° C per un massimo di un mese. Evitare l'esposizione all'umidità.

3. ibridazione in situ fluorescente (FISH)

1. Stabilizzazione e disidratazione spread
   NOTA: Equilibrare metafase cromosoma si diffonde a temperatura ambiente, se conservati a -20 ° C. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come ottenere e fare reagenti.
   1. Incubare metafase cromosoma si diffonde con 200 microlitri RNasi A per1 ora a 37 ° C.
   2. Lavare i vetrini in tampone 2x-SSC due volte per 5 minuti ciascuno seguito da risciacquo con 10 mM soluzione HCl.
   3. Incubare spread con 1% di pepsina per 10 minuti a 37 ° C, lavare con H ₂ O deionizzata e lavare due volte con tampone 2x-SSC per 5 minuti ciascuna.
   4. Incubare spread con 4% paraformaldeide per 10 minuti e lavare in tampone SSC 2x due volte per 5 minuti ciascuno.
   5. Disidratare diffondere incubando per 2 min in serie etanolo: 70%, 80% e 95% di etanolo.
   6. diapositive asciugare all'aria.
2. Ibridazione diffonde con L1 sonde -labeled retrotrasposizione (cioè, Sneo)
   ATTENZIONE: Per le sonde dirette marcato, tenere lontano dalla luce in ogni momento. Vedi tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come ottenere e fare reagenti.
   1. Aggiungere 30 ng di Sneo al tampone di ibridazione, di calore a 72 ° C per 10 minuti e raffreddare per 2 minuti a temperatura ambiente.
   2. Aggiungere 30 ml di soluzione della sonda Sneo all'each diffusione, coprire con coprioggetto e sigillare i bordi con mastice. Garantire l'assenza di formazione di bolle.
   3. Riscaldare il vetrino a 72 ° C per 5 min su un blocco di calore, gradualmente scendere la temperatura a 37 ° C, e incubare durante la notte in una camera umidificata al buio a 37 ° C.
3. Lavaggio e visualizzazione (o l'aggiunta di anticorpo secondario)
   ATTENZIONE: Per le sonde dirette marcato, tenere lontano dalla luce in ogni momento.
   NOTA: vedere tabella dei materiali e reagenti per informazioni su come preparare. Si consiglia l'uso di un volume sufficiente a coprire l'intero cromosoma diffusione. Si ricorda che il volume in eccesso sarà perso quando si aggiunge vetrino.
   1. Immergere i vetrini in tampone SSC 2x per rimuovere coprioggetto.
   2. Lavare i vetrini per immersione in tampone 2x-SSC a 45 ° C per 5 min.
   3. Lavare i vetrini per immersione in tampone di lavaggio a 45 ° C per 5 min, 2x.
   4. Lavare i vetrini per immersione in tampone SSC 0,1x a 45 ° C per 10 min.
   5. Lavare i vetrini per immersione in 2x SSC tampone a 45 ° C per 10 min.
      NOTA: Posizionare una vaschetta Coplin contenente tampone raccomandato in un bagno d'acqua, regolare la temperatura a 45 ° C.
   6. scivoli raffreddare a temperatura ambiente ed equilibrare i vetrini in tampone di rilevamento.
   7. Per le sonde marcate diretti, passare al punto 3.4.10.
   8. Per le sonde marcate indiretti, blocco nel tampone di bloccaggio per 20-30 min e lavare 3 volte in DPBS.
   9. Incubare con 50 ml di anticorpo secondario (ad esempio, 5 mg / ml di streptavidina-FITC, o αCY3 in tampone di bloccaggio) per 1 ora.
   10. Lavare i vetrini in 2x SSC per 5 minuti due volte.
   11. Controcolorare con Hoechst 33342-soluzione (0,1 mg / ml) per 10 min.
       NOTA: questa colorazione viene fatto per macchiare cromosomi di co-localizzazione con sonda.
   12. Lavare in DPBS 3x, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio, inserire un vetrino e sigillare i bordi con smalto.
   13. Analizzare L1 retrotrasposizione utilizzando microscopio a fluorescenza a 40X magnification.

Risultati

Un diagramma schematico del vettore retrotrasposizione L1 è presentato in Figura 1. Il vettore costituito da un gene neomicina in orientamento antisenso per L1 ORF che è interrotta da un introne globina in orientamento senso e intramezzato da SD e siti SA. Quando stabilmente integrato in un cromosoma, L1 mRNA è trascritto dal combinato CMV e promotore L1-5'UTR (Figura 1). Durante l'elaborazione RNA, l'introne glo...

Discussione

Metodologie come il sequenziamento dell'intero genoma, inversa PCR e Southern blotting sono stati impiegati per studiare L1 retrotrasposizione. Sebbene queste metodologie sono estremamente utili nel localizzare dove si verificano inserimenti L1 all'interno di genomi, una sfida confusione per tutti loro è la necessità per la programmazione in-silico per riassemblare sequenze. La metodologia FISH descritta qui è concepito per integrare questi metodi, soprattutto nel caso di studi che ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labeling Probes
Go Tag DNA polymerase	Promega	M3178
GO Tag 10X colorless buffer	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM  in nuclease free water.
dUTP-16-Biotin (0.5mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5mM)	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up kit	Qiagen	1410/0030	Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR Machine			Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.
Agarose	Sigma	A9539
Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparing chromosome Spreads.
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Add Colcemid directly to growth media  to a final concentration of 0.4 µg/mL
1M KCl	Sigma	P9541	Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution
Carnoy Fixative Solution			Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.
Methanol	Sigma	322415
Acetic acid	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.
Diamond Point Marker	Thermo Scientific	750
Frosted Slides	Thermo Scientific	2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	R001100	To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media
Cover slides	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.
Beaker (600ml)	Sigma	CLS1003600	Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.
Nikon Microscope	Nikon	125690	Any microscope can be used to look at spread quality.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials for FISH
Trisodium citrate	Sigma	S1804
Sodium Chroride	Sigma	S3014
Formamide	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfate	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Salmon Sperm DNA	Life Technologies	15632-011
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Ethyl Alcohol	Sigma	459844
Methanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.
Rubber Cement/Cytobond Sealant		2020-00-1
Seven Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Dark Humidified chamber	Sigma	CLS2551
Cover slides	VWR	48366067
Dry Digital Heat Block	VWR	13259
Fluorescence Microscope
20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC)			Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C.
1mg/mL of Rnase A			Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time.
1% Pepsin			Dissolve  pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time.
4% Paraformaldehyde (4% PFA)			Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses.  Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.
Wash Buffer			Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O.
Hybridization Buffer			Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer.  Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount
Detection Buffer			Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.
Blocking Buffer			Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer.
Dehydrating Solution			Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.