Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene

Zusammenfassung

Hier beschäftigen wir FISH - Methodik LINE-1 - Retrotransposition an der einzelnen Kerne Ebene in Chromosom Spreads von HepG2 - Zelllinien stabil synthetischen LINE-1 exprimieren , zu verfolgen.

Zusammenfassung

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Einleitung

Menschliche Lange streute Kern Element-1 (Linie-1 oder L1) ist eine autonome mobile Element , das durch eine im Genom ausbreitet "Kopieren und Einfügen" Retrotransposition Mechanismus. Ein typisches menschliches L1 ~ 6 kb lang und besteht aus einer 5' - UTR (untranslatierte Region), die als Promotor dient, zwei offene Leserahmen (ORFs): L1 -ORF1 und L1 -ORF2 und eine 3'UTR mit einem polyA . Schwanz L1 -ORF1 Protein hat drei verschiedene Bereiche: eine Spule-Coil - Domäne, RNA - Erkennungsmotiv und C-terminale Domäne, während L1 -ORF2 Protein Endonuklease hat, reverse Transkriptase und Cystein reiche Domänen ^1.2.3.4.5. L1 -ORF1 zeigt Nukleinsäure Chaperon - Aktivitäten, während L1 -ORF2 enzymatischen Aktivitäten bietet, wobei beide für Retrotransposition benötigten Proteine ^​​1,2,6.

Ein Zyklus von L1 Retrotransposition beginnt mit der Transkription von der 5'UTR von L1 bicistronischen mRNA durch RNA-Polymerase II, Translokation in das Cytoplasma und Translation. Im Zytoplasma, L1 -ORF1 weist entweder cis -Bindung , wo es seine eigene RNA oder trans -Bindung Pakete , wo es andere RNAs Pakete (dh Sinus- / SVAS / pseudogenes) ⁷ ein Ribonukleoprotein Partikel (RNP) mit L1 -ORF2p zu ^{bilden, 8.} RNPs Translokation in den Zellkern , wo die Endonuklease - Aktivität von L1 -ORF2p Scharten genomische DNA (gDNA) eine OH zu belichten ^- Gruppe ^9, die wiederum durch die reverse Transkriptase zu primen verwendet wird und synthesize RNA zu DNA vom 3' - Ende umzukehren. Während der Rückwärts Synthese wird der zweite DNA - Strang 7-20 bp von der ursprünglichen nick Website geklaut zu versetzten Pausen schaffen , die die Signatur L1 Insertionssequenzen (zB TTTTAA) genannt Zielstelle Vervielfältigungen (TSD) ^9,10 zu bilden , gefüllt sind. Dieser Vorgang wird als Ziel prime reverse Transkription (TPRT) bekannt und führt zu insertiauf der vollständigen oder abgeschnittene Kopien von L1 / andere DNAs mit TSD an beiden Enden der eingefügten Sequenz. L1 Retrotransposition auch durch TPRT artigen nicht-homologe end-joining in einigen Zelltypen ¹¹ vermittelt zu werden hat sich gezeigt.

Der L1 - Vektor Retrotransposition in unseren Studien verwendeten nicht-episomale und besteht aus getaggt L1 -ORF1 & 2p angetrieben durch kombinierte CMV-Promotoren L1-5'UTR (Abbildung 1) ^12. Frühere Versionen dieses Konstrukts wurden ^13,14,15 in Studien unter Verwendung von Hefe und menschlichen Zellkulturen beschrieben. Zwei verschiedene CMV-Promotoren in der 5 'angeordnet und 3'-Enden des Vektors, mit dem 3'-Ende in umgekehrter Ausrichtung angeordnet Expression von Neomycin nach dem Spleißen und Integration zu fahren. Der Retrotransposition Indikator Kassette an dem 3' - Ende besteht aus einem Neomycin - Gen insertiert Antisense zu L1 -ORFs und durch eine glob inaktiver durch Trennung in zwei Hälften gemachtin Intron mit gespleißten Donor (SD) und gespleißt Akzeptor (SA) -Stellen (Abbildung 1). Bei der Integration in ein Chromosom, wird L1 von dem gemeinsamen Promotor transkribiert , um eine mRNA produzieren , die von einer bicistronischen mRNA und inaktive Neomycin mRNA besteht. Während RNA Verarbeitung wird das Globin-Intron aus dem Neomycin-Gen gespleißt eine voll funktionsfähige Neomycin-Gen wiederherzustellen. Die Hybrid - mRNA wird in ein RNP in cis verpackt und in den Zellkern transloziert , wo es in das Genom entweder in voller Länge oder abgeschnittene Einfügungen Verwendung TPRT integriert ist.

Hier beschreiben wir eine Methode , die Fluoreszenz - in - situ - Hybridisierung (FISH) mit Sonden verwendet speziell auf die gespleißten Neomycin - Gen gerichtet (Sneo) an der einzigen Kern Ebene L1 -retrotransposiition Muster und Einbringungsraten zu verfolgen. Die Effizienz und Spezifität des Nachweises wurde unter Verwendung von Retrotransposition kompetenten und inkompetenten Konstrukte und Sonden bestätigt detect Sneo oder das Neomycin und Intron - Übergang Globin - ^16. Diese Methodologie macht einige der Mängel der Zellkultur-Assays Retrotransposition, beispielsweise mehrere Einfügungen, kolonieBeständigkeit und günstige clone Expansion.

Protokoll

HINWEIS: Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wenn nicht anders angegeben. Bitte beachten Sie Reagenzien für Details auf, wie einzelne Reagenzien herzustellen.

1. Kennzeichnung L1 Probes

HINWEIS: Die Sonden können durch chemische oder PCR-Kennzeichnung versehen werden.

1. chemische Markierung
   1. Machen 0,7-1% Agarosegel in Tris-Acetat-EDTA (TAE) -Puffer, Wärme in einer Mikrowelle, bis sie geschmolzen, erlauben das Gel abkühlen, und fügen Ethidiumbromid (0,5 ug / ml). Gießen Sie in Gelträger, fügen Sie Kämme und lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu verfestigen.
   2. Beschriften der Sneo Sonde (1-2 ug) mit CY3 oder FITC bei 37 ° C für 1 Stunde nach dem Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Sneo bezeichnet die S nach einem vollen Zyklus der Retrotransposition ausgedrückt Neo mycin Gen pliced. Die Sonde ist ~ 1000 bp groß. Sneo kann PCR von jedem Vektor verstärkt werden oder von genomic-DNA. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen über Streptavidin-Cy3 / FITC-Markierungsreagenzien.
   3. Mischen Sie die markierten Sneo Sondenlösung mit 1x DNA-Ladepuffer, Last in jede Vertiefung und laufen bei 75-100 Volt für 15-20 min.
   4. Visualisieren Sie die Sonde Band eine Ultraviolett (UV) Illuminator verwenden. Man beachte , dass die Größe der Sneo Sonde eingestellt werden kann , und dass Lock - Kerne Säure (LNA) können ebenfalls hinzugefügt werden (Abbildung 2).
   5. Cut Sneo Sonde aus dem Gel mit einem sauberen Messer markiert, löslich zu machen und die Sneo Sonde aus dem Gel unter Verwendung eines PCR-Clean-Up-Kit reinigen dem Protokoll des Herstellers nach.
      VORSICHT: Abdeckung jeder exponierten Teil des Körpers mit Schutzschilden (dh Laborkittel und UV - Klargesichtsmaske) beim Betrachten und das Gel zu schneiden. Siehe Tabelle Material- und Reagenzien für die Informationen zu Gel reinigen PCR-Produkte.
   6. Re-run 5 ul Sneo markierten Sonde mit einem nicht-markierten Sneo Sonde auf einem 0,7% Agarose-Gel (siehe 1.1.1) conUnternehmensgröße zu erhöhen und Verlust der Signalintensität (Abbildung 2).
   7. Quantifizierung der Menge an markiertem Sneo Sonde durch die Absorption bei 260 nm zu messen und verdünnt das Sneo Sonde 10 ng / & mgr; l Aliquots in Nuklease freiem H ₂ O. Store Aliquots bei -20 ° C.
2. PCR - Labeling (Alternatives Verfahren zur Sondenmarkierung)
   1. Kombinieren Sie Sneo spezifische Primer (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'und 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') mit PCR - Reagenzien in einem einzigen Rohr: 13,6 ul nukleasefreiem H ₂ O; 0,1 ul dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 ul dTTP (10 nM); 0,05 & mgr; l dUTP-Biotin / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ul gehen Tag 5x Puffer; 0,4 ul gehen Tag Polymerase; 1 ul Sneo-Vorlage (10 ng). Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen über die PCR-Reagenzien.
   2. Stellen Sie die Menge jedes Reagens durch durch die Gesamtzahl der Proben multipliziert wird.
   3. Verwenden Sie das folgende PCR-Zyklen Parameters zu amplifizieren und Etiketten Sneo Sonden: 95 ° C für 2 min; 35 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 62 ° C für 30 sec, 72 ° C für 60 sec; 72 ° C für 2 min; Halten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit.
      HINWEIS: Die Glühtemperatur eingestellt werden kann oder Gradienten PCR kann optimal Glühtemperaturen für andere Sonden zu bestimmen, durchgeführt werden.
   4. Machen Sie 0,7-1% Gel, wie in Abschnitt 1.1.1, Last und visualisieren die Sonde Band, wie in Abschnitt 1.1.4.
   5. Schneiden Sie und reinigen die markierten Sneo Sonde, wie in Abschnitt 1.1.5.
   6. Re-run 5 ul Sneo markierten Sonde mit un-markierten Sneo Sonde Größenzunahme und Verlust der Signalintensität zu bestätigen (siehe Abbildung 2).
   7. Quantifizierung der Menge an markiertem Sneo Sonde durch Messung der Absorption bei 260 nm und verdünnter Sneo Sonde 10 ng / & mgr; l Aliquots in Nuklease freiem H ₂ O.

2. Vorbereitung Chromosome Aufstriche

1. Generieren stabile Klone Vektorgerüst exprimieren (control) oder Retrotransposition zuständigen L1 unter Verwendung von Standardauswahlmethoden. ^12,16 Während nicht-episomale Reporter wurden verwendet , um Ergebnisse mit Studien der Transkription, episomale Vektoren können auch verwendet werden zu korrelieren. Wachsen Zellen stabil exprimieren Kontrolle oder L1 - Vektor (1 x 10 ⁶ Zellen pro 10 cm Platte, mit Anpassungen in Plattengröße hergestellt nach Bedarf) in komplettem Wachstumsmedium. Für HepG2-Zellen verwenden RPMI-1600, 10% FBS und 200 & mgr; g / ml Hygromycin. Wachsen Kulturen zu 70% Konfluenz bei 37 ° C und 5% CO _2.
   HINWEIS: Die Wahl des Wachstumsmediums ist abhängig vom Zelltyp. Da die Plasmide tragen hier Selektionskassetten sowohl für Hygromycin und Neomycin, stabile Selektion von Klonen verwendet, könnte auch mit Neomycin nach Selektion auf Hygromycin durchgeführt werden, aber die Menge an Neomycin muss optimiert werden Toleranzwerte für jeden Zelltyp herzustellen.
2. In Colcemid (0,4 ug / ml) zu Kulturmedium und Inkubation für 90 min Zellen bei Metaph zu verhaftenase. Wenn verschiedene Zelltypen verwendet, bestimmen die optimale Konzentration von Colcemid und Zeit der Belichtung (60, 90 und 120 min) für eine optimale Verhaftung Metaphase empirisch.
3. Wasche die Zellen 2x mit 10 ml 1x Dulbecco-PBS (DPBS), trypsinize von 3-5 ml Zugabe von 0,25% Trypsin-Lösung zu den Zellen und inkubiere für 5 min, um die Zellen zu lösen. Inaktivieren Trypsin mit einer gleichen Menge an Medium 10% FBS enthielt.
4. Zentrifugation der Zellen für 2 min bei 1.000 × g bei 4 ° C absaugen Medium vom Zellpellet und wasche die Zellen mit DPBS. Absaugen alle DPBS, so dass 200 ul DPBS, um die Zellen erneut zu suspendieren. Stellen Sie sicher, Zellen sind gut gemischt, und dass alle Klumpen verteilt sind. Verwenden Sie Flackern oder vorsichtiges Pipettieren zu mischen und zu verteilen Klumpen und vermeiden Verwirbelung.
5. 5 ml hypotonischer Lösung (dh 75 mM KCl), die auf 37 ° C tropfenweise , während das Drehen des 15 - ml - Röhrchen horizontal und inkubieren bei 37 ° C für 20 min vorgewärmt wird. Siehe Tabelle der Materialien und Reagents für Informationen darüber, wie zu erhalten und hypotonischen Lösung zu machen.
6. Zentrifugen Zellen bei 120 xg für 5 min bei 4 ° C und wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5 3x etwa 200 ul hypotonischen Lösung verlassen, die Zellen nach jeder Wäsche zu resuspendieren. Stellen Sie sicher, dass das Pellet sichtbar ist weiß und geschwollen am Ende der 3 Wäschen.
7. Re-suspend das Pellet in 200 ul Carnoy Fixativ Lösung und machen 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1.16 Verdünnungen in Carnoy Fixativ Lösung. Drop-10 & mgr; l jeder Verdünnung auf einem trockenen, sauberen Objektträger von etwa 1 cm über und sofort die Ausbreitung freien Seite zu heißen Dampf aus Wasser für 30 Sekunden aus siedendem. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Carnoy Fixativ Lösung zu machen.
8. Trocknen Sie die Spreads bei Raumtemperatur, Fleck mit 0,1 ug / ml Hoechst-33342 durch Eintauchen für 15-20 min in Coplin Jar und waschen 3x mit DPBS. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie die Hoechst-33342-Lösung zu machen.
9. Ansicht verbreitet sich auf Fluoreszenz / Phasenkontrast-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Nach Ausbreitung Vorbereitung zu optimieren, braucht nicht Spreads mit Hoechst-33342 gefärbt werden. Ansicht breitet sich auf Phasenkontrast - Mikroskop bei 10 - facher Vergrößerung Ausbreitung Qualität und Trennung , um zu bestimmen , wie im Abschnitt Ergebnisse umrissen (siehe Abbildung 3).
10. Wählen und umkreisen gute Spreads mit einem Diamond Point Markierung auf der gegenüberliegenden Seite des Schiebers (dh verteilt freie Seite).
11. Store spreizt bei -20 ° C für bis zu einem Monat. Vermeiden Sie die Einwirkung von Feuchtigkeit.

3. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

1. Stabilisierende und Entwässern Spreads
   HINWEIS: Äquilibrieren Metaphasechromosom breitet sich auf Raumtemperatur gelagert, wenn bei -20 ° C. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Reagenzien zu erhalten und zu machen.
   1. Inkubieren Metaphasechromosom verbreitet mit 200 & mgr; l RNase A für1 h bei 37 ° C.
   2. Wasch gleitet in 2x SSC-Puffer zweimal für jeweils 5 min, gefolgt von 10 mM HCl-Lösung gespült wird.
   3. Inkubieren Spreads mit 1% Pepsin für 10 min bei 37 ° C, Spülen mit VE - H ₂ O und wäscht zweimal mit 2x-SSC - Puffer für jeweils 5 Minuten.
   4. Inkubieren Spreads mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten und waschen in 2x SSC-Puffer zweimal für jeweils 5 Minuten.
   5. Dehydrieren verbreiten, indem sie für 2 Minuten in Ethanol Serie Inkubation: 70%, 80% und 95% Ethanol.
   6. Lufttrockener Rutschen.
2. Hybridization Spreads mit L1 -markierten Sonden Retrotransposition (dh Sneo)
   ACHTUNG: Für den direkten markierten Sonden, halten weg von Licht zu allen Zeiten. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Reagenzien zu erhalten und zu machen.
   1. Werden 30 ng von Sneo zu Hybridisierungspuffer, Hitze bei 72 ° C für 10 min und kühl für 2 min bei Raumtemperatur.
   2. In 30 ul Sneo Sondenlösung bis eACH Ausbreitung, Deckel mit Deckglas und die Ränder mit Gummi-Zement. Achten Sie darauf, keine Blasenbildung.
   3. Erhitzen Sie die Folie bei 72 ° C für 5 min auf einem Wärmeblock, die Temperatur allmählich auf 37 ° C fallen, und Inkubation über Nacht in einer dunklen feuchten Kammer bei 37 ° C.
3. Waschen und Anzeigen (oder Addition von sekundären Antikörper)
   ACHTUNG: Für den direkten markierten Sonden, halten weg von Licht zu allen Zeiten.
   HINWEIS: Siehe Tabelle von Materialien und Reagenzien für Informationen darüber, wie vorzubereiten. Die Verwendung von genügend Volumen, um die gesamte Chromosomenspreitung abdecken wird empfohlen. Denken Sie daran, dass überschüssiges Volumen verloren gehen, wenn Deck hinzugefügt wird.
   1. Tauchen Sie Dias in 2x SSC-Puffer Deckgläser zu entfernen.
   2. Waschen Folien durch Eintauchen in 2 × SSC-Puffer bei 45 ° C für 5 min.
   3. Waschen Folien durch Eintauchen in Waschpuffer bei 45 ° C für 5 min, 2x.
   4. Waschen Folien durch Eintauchen in 0,1 x SSC-Puffer bei 45 ° C für 10 min.
   5. Waschen Folien durch Eintauchen in 2 × SSC-Puffer bei 45 ° C für 10 min.
      HINWEIS: Einen Coplin Jar enthält empfohlenen Puffer in einem Wasserbad, justieren Temperatur auf 45 ° C.
   6. Kühlen Folien auf Raumtemperatur äquilibrieren und gleitet in Detektionspuffer.
   7. Für die direkte markierten Sonden, überspringen 3.4.10 Schritt.
   8. Für die indirekte markierten Sonden, Blockpuffer für 20-30 min in Blockieren und Waschen 3x in DPBS.
   9. Inkubieren mit 50 & mgr; l sekundärem Antikörper (beispielsweise 5 & mgr; g / ml Streptavidin-FITC oder αCY3 in Blocking - Puffer) für 1 Stunde.
   10. Waschen Sie Folien in 2 × SSC für 5 min zweimal.
   11. Gegenfärbung mit Hoechst-33342-Lösung (0,1 ug / ml) für 10 min.
       HINWEIS: Diese Färbung erfolgt Chromosomen für die Co-Lokalisation mit der Sonde zu färben.
   12. Waschen Sie in DPBS 3x, fügen Sie einen Tropfen Eindeckmedium, legen Sie ein Deckglas und die Ränder mit Nagellack.
   13. Analysieren L1 Retrotransposition unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskop bei 40facher magnification.

Ergebnisse

Ein schematisches Diagramm des L1 Retrotransposition Vektors ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Vektor besteht aus einem Neomycin - Gen in Antisense - Orientierung zu L1 ORFs , die durch ein Globin - Intron in Sense - Orientierung und sandwichartig von SD und SA Seiten unterbrochen ist. Wenn stabil in ein Chromosom integriert ist L1 mRNA aus dem kombinierten CMV transkribiert und L1-5'UTR Promotor (Abbildung 1). Während R...

Diskussion

Methodiken wie Sequenzierung ganzer Genome, inverse PCR und Southern - Blotting wurden zu studieren L1 Retrotransposition eingesetzt. Obwohl diese Methoden äußerst wertvoll sind , bei der Suche nach dem L1 Einfügungen treten innerhalb von Genomen, eine verwirrende Herausforderung für alle von ihnen ist die Notwendigkeit für die In-silico - Programmierung zu Sequenzen wieder zusammen. Die FISH - Methodik hier beschrieben entwickelt , um diese Methoden zu ergänzen, insbesondere im Fall von...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labeling Probes
Go Tag DNA polymerase	Promega	M3178
GO Tag 10X colorless buffer	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM  in nuclease free water.
dUTP-16-Biotin (0.5mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5mM)	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up kit	Qiagen	1410/0030	Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR Machine			Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.
Agarose	Sigma	A9539
Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparing chromosome Spreads.
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Add Colcemid directly to growth media  to a final concentration of 0.4 µg/mL
1M KCl	Sigma	P9541	Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution
Carnoy Fixative Solution			Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.
Methanol	Sigma	322415
Acetic acid	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.
Diamond Point Marker	Thermo Scientific	750
Frosted Slides	Thermo Scientific	2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	R001100	To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media
Cover slides	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.
Beaker (600ml)	Sigma	CLS1003600	Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.
Nikon Microscope	Nikon	125690	Any microscope can be used to look at spread quality.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials for FISH
Trisodium citrate	Sigma	S1804
Sodium Chroride	Sigma	S3014
Formamide	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfate	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Salmon Sperm DNA	Life Technologies	15632-011
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Ethyl Alcohol	Sigma	459844
Methanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL.
Rubber Cement/Cytobond Sealant		2020-00-1
Seven Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Dark Humidified chamber	Sigma	CLS2551
Cover slides	VWR	48366067
Dry Digital Heat Block	VWR	13259
Fluorescence Microscope
20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC)			Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C.
1mg/mL of Rnase A			Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time.
1% Pepsin			Dissolve  pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time.
4% Paraformaldehyde (4% PFA)			Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses.  Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.
Wash Buffer			Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O.
Hybridization Buffer			Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer.  Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount
Detection Buffer			Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.
Blocking Buffer			Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer.
Dehydrating Solution			Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.