単核レベルでのLINE-1レトロ転位の分析

要約

ここでは、安定的に合成LINE-1を発現したHepG2細胞株の染色体スプレッドの単核レベルでのLINE-1レトロ転位を追跡するためにFISH法を採用しています。

要約

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

概要

人間の長い散在要素-1（ ライン1またはL1）は 、「コピー＆ペースト」レトロ転位機構を介してゲノム内を伝播する自律移動要素です。典型的なヒトL1は 〜6キロバイトの長さであり、プロモーターとして機能5'UTR（非翻訳領域）で構成され、2つのオープンリーディングフレーム（ORF）：L1 -ORF1とL1 -ORF2、およびポリAとの3'UTR 。コイルコイルドメイン、RNA認識モチーフとC末端ドメイン、L1 -ORF2タンパク質はエンドヌクレアーゼを持っていながら、転写酵素およびシステインリッチドメイン^{1,2,3,4,5リバース} ：尾L1 -ORF1タンパク質は、3つの異なるドメインを持っています。 L1 -ORF2はレトロ転位^1,2,6-に必要な両方のタンパク質と、酵素活性を提供しつつ、L1 -ORF1は、核酸シャペロン活性を示します。

L1のレトロ転位のサイクルは、L1の5'UTRからの転写で始まりますの二シストロン性mRNAを。細胞質では、L1 -ORF1展示どちらかそれは独自のRNAまたはそれがL1 -ORF2p ⁷とリボ核タンパク質粒子（RNP）を形成するために他のRNA（ すなわち、SINE / SVAS /偽）をパッケージ化し、トランス -結合をパッケージ化シス -結合^{、 8。} RNPはOHを露出させるために、L1 -ORF2pニックのエンドヌクレアーゼ活性ゲノムDNA（gDNAを）核内に移行^-グループ^9、それが素数に逆転写酵素によって使用される順番で、3 '末端からDNAにRNAを合成する逆。逆合成の間、DNAの第二鎖は、署名のL1挿入配列（ 例えば 、TTTTAA）と呼ばれる標的部位の重複^{（TSD）9,10を}形成するために充填されている互い違いの休憩を作成するために、オリジナルのニック部位7から20塩基対をニックが入っています。このプロセスは、ターゲットプライム逆転写（TPRT）として知られており、insertiにつながります挿入配列の両端にTSDSとL1 /他のDNAの完全または切断型コピーの上。L1のレトロ転位はまた、いくつかの細胞型¹¹にTPRT状の非相同末端結合を介して媒介されることが示されています。

私たちの研究で採用さL1のレトロ転位ベクターは、非エピソームであるとタグ付けされたL1 -ORF1＆2P組み合わせたCMV-L1-5'UTRプロモーターによって駆動される（ 図^1）12から構成されています。この構築物の以前のバージョンでは、酵母とヒトの細胞培養物^13,14,15を用い^た研究に記載されています。スプライシングおよび統合後ネオマイシンの発現を駆動するために逆方向に配置された3 '末端を有する、ベクターの5'および3 '末端に位置する2つの別個のCMVプロモーター。 3 '末端のレトロトランスポジションインジケーターカセットは、L1 -ORFsにネオマイシン遺伝子挿入アンチセンスで構成され、グロブによって半分に分離することによって不活性化さスプライスドナー（SD）およびスプライスさアクセプター（SA）部位（ 図1）とイントロンインチ染色体への組み込みの際に、L1はシストロン性mRNAおよび非アクティブネオマイシンのmRNAから構成されてmRNAを生成するために、共通のプロモーターから転写されます。 RNAプロセシングの間に、グロビンイントロンは完全に機能するネオマイシン遺伝子を復元するために、ネオマイシン遺伝子の外にスプライスされます。ハイブリッドmRNAはシスでRNPにパッケージ化し、それがTPRTを使用して、完全長または切断のいずれかの挿入などゲノムに組み込まれている核内に移行されます。

ここでは、単一の核レベルでのL1 -retrotransposiitionパターンと挿入率を追跡するために、具体的スプライシングされたネオマイシン遺伝子（SNeo）に向けプローブを用いたin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光を使用する方法について説明します。検出の効率と特異性は、DETにレトロ転位有能と無能な構築物およびプローブを用いて確認しました電気ショック療法SNeoまたはネオマイシンおよびイントロン接合部^16をグロビン。この方法論は、このような複数の挿入、コロニー抵抗、良好なクローンの拡大などの細胞培養ベースのレトロ転位アッセイの欠点のいくつかを占めます。

プロトコル

注：特に指定のない限り、すべてのステップは室温で実施されるべきです。個々の試薬を準備する方法の詳細については、試薬のセクションを参照してください。

1.ラベリングL1プローブ

注：プローブは、化学的またはPCRの標識によって標識することができます。

1. 化学的標識
   1. 臭化エチジウム（0.5μgの/ ml）を追加し溶融するまで、電子レンジでトリス - 酢酸-EDTA（TAE）バッファー、暑さの中で0.7から1パーセントアガロースゲルを作成したゲルを冷却することを可能にする、と。ゲルトレイに注ぎ、コームを追加し、ゲルは室温で固化することができます。
   2. 製造者のプロトコルに従って、37℃で1時間Cy3またはFITCでSNeoプローブ（1-2μgのを）ラベルを付けます。
      注：SNeo Sは ネオマイシン遺伝子は、レトロ転位の完全なサイクル後に発現pliced ​​意味します。プローブのサイズは〜千塩基対です。 SNeoは、任意のベクターから、またはGENOMからPCR増幅することができますIC DNA。ストレプトアビジンCY3 / FITC標識試薬の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。
   3. 各ウェルに1×DNAローディング緩衝液、負荷とラベルされたSNeoプローブ溶液を混合し、15〜20分間75-100ボルトで実行します。
   4. ウルトラバイオレット（UV）照明装置を用いたプローブバンドを可視化します。 SNeoプローブの大きさを調整し、ロック核酸（LNA）も（ 図2）を加えることができることができることに留意されたいです。
   5. きれいな刃でゲルからSNeoの標識プローブの切断は、製造業者のプロトコルに従ってPCRクリーンアップキットを用いてゲルからSNeoプローブを可溶化し、精製します。
      注意：カバー保護シールド（ すなわち、実験室のコートとUVクリアなフェイスマスク）との体のあらゆる露出部分のゲルを表示して切断。 PCR産物を精製したゲルへの情報のための材料および試薬の表を参照してください。
   6. 再実行SNeoの5μlを0.7％アガロースゲル上の未標識SNeoプローブで標識プローブコンする（1.1.1を参照）企業規模の増大や信号強度の損失（ 図2）。
   7. 260nmの吸光度を測定することにより、標識SNeoプローブの量を定量し、ヌクレアーゼフリーのH ₂ O中に10ng /μlのアリコートにSNeoプローブを希釈分注して-20℃で保管。
2. PCRラベリング（プローブ標識のための代替方法）
   1. 単一のチューブにPCR試薬とSNeo特異的プライマー（5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'および5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3'）を組み合わせる：13.6μlのヌクレアーゼフリーのH ₂ O; 0.1μlののdATP、dCTPを、dGTPを（10 nM）を、 0.05μlのdTTPの（10 nM）を、 0.05μlのdUTPをビオチン/ dUTPを-FITC / CY3（10 nM）を、 4μlのバッファ5倍タグを移動します。 0.4μlのタグポリメラーゼを行きます。 1μlのSNeoテンプレート（10 NG）。 PCR試薬の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。
   2. サンプルの総数を乗じて各試薬の量を調整します。
   3. 以下のPCRサイクルパラメータを使用しますsが増幅し、ラベルSNeoプローブする：2分、95℃; 30秒、30秒、62℃、60秒間72℃、95℃の35サイクル; 2分間72°C;無期限に4℃で保持します。
      注：アニーリング温度を調整することができるか、勾配PCRは、他のプローブのための最適なアニーリング温度を決定するために完成させることができます。
   4. セクション1.1.1、負荷のように0.7から1パーセントゲルを作成し、セクション1.1.4のようにプローブのバンドを可視化します。
   5. セクション1.1.5のようにラベルされたSNeoプローブをカットし、精製します。
   6. SNeoの再ラン5μlを（ 図2を参照）信号強度の大きさが増加し、損失を確認するために、未標識SNeoプローブで標識プローブ。
   7. 260nmの吸光度を測定することにより、標識SNeoプローブの量を定量し、ヌクレアーゼフリーのH ₂ O中に10ng /μlのアリコートにSNeoプローブを希釈

2.準備染色体スプレッド

1. ベクター骨格を発現する安定なクローンを生成します（制御L）または標準的な選択方法を使用してレトロ転位コンピ^L1。12,16非エピソームレポーターは、転写の研究で結果を関連付けるために使用されたが、エピソームベクターを使用することもできます。安定的に制御またはL1ベクトル完全増殖培地中で（必要に応じて作られたプレートサイズの調整と10cmプレートあたり1×10 ⁶個^の細胞を、）を発現する細胞を増殖させます。 HepG2細胞は、RPMI-1600、10％FBSおよびハイグロマイシン200μg/ mlのを使用します。 37℃で70％コンフルエンスに培養を成長させ、5％のCO _2。
   注：成長培地の選択は、細胞型に依存します。ここで使用されるプラスミドは、ハイグロマイシンおよびネオマイシン両方の選択カセットを運ぶことを指定された、クローンの安定した選択はまた、ハイグロマイシンでの選択の後にネオマイシンを用いて行うことができるが、ネオマイシンの量は、各細胞型のための許容レベルを確立するために最適化する必要があります。
2. 培養培地にコルセミド（0.4μgの/ ml）を追加し、metaphで細胞を停止させるために90分間インキュベートASE。異なる種類の細胞を使用している場合は、経験的に最適な中期停止のためのコルセミドと露光時（60、90、および120分）の最適濃度を決定します。
3. 洗浄細胞は、細胞に0.25％トリプシン溶液を3-5 mlで添加することによりトリプシン処理し、細胞を分離するために5分間インキュベートし、1×ダルベッコPBS（DPBS）10mlで2倍。 10％FBSを含む培地の等量とトリプシンを不活性化します。
4. 4℃、1,000×gで2分間遠心分離細胞は、細胞ペレットから培地を吸引し、DPBSで細胞を洗浄します。細胞を再懸濁するためにDPBSの200μLを残して吸引し、すべてのDPBS、。確認した細胞を十分に混合され、すべての塊が分散していること。ミックスと塊を分散し、ボルテックスを回避するために、ちらつきや穏やかなピペッティングを使用してください。
5. 低張溶液5mlを加える（ すなわち、75 mMの塩化カリウム）で水平15mlチューブを回転させながら37℃滴下する前に温め、20分間37℃でインキュベートします。材料とReagenの表を参照してください。取得し、低張液を作成する方法の詳細については、TS。
6. 各洗浄後の細胞を再懸濁するために低張液の約200μLを残して2.5 3X - 5 4℃で分間繰り返し、120×gで遠心分離した細胞は、2.4を繰り返します。 3回の洗浄の最後に、ペレットは目に見えて白と腫れであることを確認してください。
7. カルノア固定液溶液200μlでペレットを再懸濁し、1にする：2、1：4、1：8を、カルノア固定液溶液中で1：16の希釈。上記の約1cmからドライクリーンスライド上に各希釈液10μlを削除し、すぐに30秒を沸騰水から熱い蒸気に広がりのない側を露出させます。カルノア固定剤溶液を作成する方法については、材料および試薬の表を参照してください。
8. 、室温でスプレッドを乾燥コプリンジャーで15-20分間の浸漬によっては0.1μg/ mlのヘキスト33342で染色し、DPBSで3回洗浄します。ヘキスト33342溶液を作製する方法については、材料および試薬の表を参照してください。
<李>表示は40倍の倍率で蛍光/位相差顕微鏡に広がります。スプレッドの準備を最適化した後、スプレッドはヘキスト33342で染色する必要はありません 。ビューは、結果セクションで概説されるように広がり、品質と分離を決定するために10倍の倍率で位相差顕微鏡に広がる（ 図3を参照）。
9. スライド（ すなわち、広がりのない側）とは反対側のダイヤモンドポイントマーカーとの良好なスプレッドを選択し、円。
10. ストアは月まで-20℃で広がります。湿気への暴露を避けます。

in situハイブリダイゼーション（FISH）3.蛍光

1. スプレッドを安定化し、脱水
   注：-20℃で保存した場合に平衡化中期染色体を室温に広がります。試薬を入手して作成する方法の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。
   1. 中期染色体が200μlのRNase Aで広がるインキュベート37℃で1時間。
   2. 洗浄は、それぞれ10mMのHCl溶液ですすぎ、続いて5分間二回2×SSC、バッファにスライド。
   3. 脱イオンH ₂ Oで洗浄し、5分間ずつ2回-SSC緩衝液で2回洗浄し、37℃で10分間、1％ペプシンでスプレッドをインキュベートします。
   4. 10分間、4％パラホルムアルデヒドでスプレッドをインキュベートし、5分間ずつ二回2×SSC緩衝液で洗います。
   5. 70％、80％、および95％エタノール：エタノールシリーズ中で2分間インキュベートすることによって広がる脱水。
   6. 空気乾燥スライド。
2. ハイブリダイゼーションは、L1標識レトロ転位プローブ（ すなわち、SNeo）とスプレッド
   注意：直接標識プローブの場合は、すべての回で光から遠ざけます。試薬を入手して作成する方法の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。
   1. 10分間の72℃でのハイブリダイゼーション緩衝液にSNeo 30ngの、熱を加え、室温で2分間のクール。
   2. 電子にSNeoプローブ溶液の30μlのを追加ACHスプレッドは、カバーガラスで覆い、ゴムセメントでエッジを封印します。全く泡の形成を確認していません。
   3. 徐々に37℃まで温度をドロップし、37℃で暗所の加湿チャンバー内で一晩インキュベートし、ヒートブロック上で5分間、72℃でスライドを加熱します。
3. 洗濯と表示（または二次抗体の添加）
   注意：直接標識プローブの場合は、すべての回で光から遠ざけます。
   注：準備する方法については、材料および試薬の表を参照してください。染色体全体の広がりをカバーするのに十分な量の使用が推奨されます。カバーガラスを添加した場合、過剰なボリュームが失われることに注意してください。
   1. カバースリップを削除するには、2×SSC緩衝液でスライドを浸し。
   2. 洗浄は5分間、45℃で2×SSC、バッファー中に浸漬することによりスライド。
   3. 5分間、2×45℃で洗浄緩衝液に浸漬することによってスライドを洗浄します。
   4. 洗浄は、10分間、45℃で0.1×SSC緩衝液中に浸漬することによりスライド。
   5. 洗浄は、10分間、45℃で2×SSC緩衝液中に浸漬することによりスライド。
      注：場所水浴中で推奨される緩衝液を含むコプリンジャーは、45℃に温度を調整します。
   6. 室温にスライドを冷却し、検出緩衝液でスライドを平衡化します。
   7. 直接標識プローブの場合は、3.4.10に進みます。
   8. 間接的な標識プローブの場合は、20〜30分間、およびブロッキング緩衝液中のブロックは、DPBSで3回洗います。
   9. 1時間ブロッキング緩衝液（ 例えば 、5μg/ mlのストレプトアビジン-FITC、またはαCY3）二次抗体を50μlとインキュベートします。
   10. 洗浄は回5分間、2×SSC中でスライド。
   11. 10分間ヘキスト33342溶液（0.1μgの/ ml）で対比染色。
       注：この染色はプローブとの共局在化のための染色体を染色するために行われます。
   12. DPBS 3倍に洗って、マウンティング培地のドロップを追加し、カバースリップを置き、マニキュアとエッジを封印。
   13. 40Xミリアンペアで蛍光顕微鏡を用いて、L1のレトロ転位を分析gnification。

結果

L1のレトロ転位ベクターの模式図を図1に示されている。ベクターは、センス配向でグロビンイントロンによって中断され、SDおよびSA部位により挟まれているL1のORFに対してアンチセンス配向のネオマイシン遺伝子から成ります。安定して染色体に組み込まれた場合、L1 mRNAが組み合わさCMVおよびL1-5'UTRプロモーター（ 図1）

ディスカッション

このような全ゲノムシーケンシング、逆PCRおよびサザンブロッティングなどの方法論は、L1のレトロ転位を研究するために使用されてきました。これらの方法論は、L1の挿入がゲノム内で発生する場所位置で非常に貴重であるが、それらのすべてのための交絡課題は、シーケンスを再構成するためのインシリコプログラミングの必要性があります。ここで説明するFISH法は?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labeling Probes
Go Tag DNA polymerase	Promega	M3178
GO Tag 10x colorless buffer	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water.
dUTP-16-Biotin (0.5 mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5 mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5 mM)	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up kit	Qiagen	1410/0030	Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR Machine			Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.
Agarose	Sigma	A9539
Preparing chromosome Spreads
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml
1 M KCl	Sigma	P9541	Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution
Carnoy Fixative Solution			Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.
Methanol	Sigma	322415
Acetic acid	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml.
Diamond Point Marker	Thermo Scientific	750
Frosted Slides	Thermo Scientific	2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	R001100	To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media.
Cover slides	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.
Beaker (600 ml)	Sigma	CLS1003600	Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.
Nikon Microscope	Nikon	125690	Any microscope can be used to look at spread quality.
Reagents and Materials for FISH
Trisodium citrate	Sigma	S1804
Sodium Chroride	Sigma	S3014
Formamide	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfate	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Salmon Sperm DNA	Life Technologies	15632-011
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Ethyl Alcohol	Sigma	459844
Methanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml.
Rubber Cement/Cytobond Sealant		2020-00-1
Seven Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Dark Humidified chamber	Sigma	CLS2551
Cover slides	VWR	48366067
Dry Digital Heat Block	VWR	13259
Fluorescence Microscope
20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC)			Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C.
1 mg/ml of Rnase A			Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time.
1% Pepsin			Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time.
4% Paraformaldehyde (4% PFA)			Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.
Wash Buffer			Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O.
Hybridization Buffer			Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount.
Detection Buffer			Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.
Blocking Buffer			Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer.
Dehydrating Solution			Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.