在单核级LINE-1逆转录转座子分析

摘要

在这里，我们采用FISH方法在单核级跟踪LINE-1逆转录转座子在肝癌细胞系稳定表达合成LINE-1的染色体价差 ​​。

摘要

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

引言

人长散布核元件-1（ 行1或L1）是通过基因组内传播"复制和粘贴"反转录机制的自主移动元素。一个典型的人类L1是〜6 kb的，由充当启动子的5'UTR（非翻译区）的，两个开放阅读框（ORF）:L1 -ORF1和L1 -ORf2，并与聚腺苷酸一个3'UTR 。尾巴L1 -ORF1蛋白质具有三个不同的区域:一个线圈螺旋结构域，RNA识别基序和C末端结构域，而L1 -ORf2蛋白质具有核酸内切酶，逆转录酶和富含半胱氨酸的结构域^1,2,3,4,5。 L1 -ORF1表现出的核酸分子伴侣的活动，而L1 -ORf2提供酶活性，与逆转录转座子^1,2,6所需的两种蛋白。

L1逆转录转座子的周期从L1的5'UTR转录启动由RNA聚合酶II，易位进入细胞质和翻译表达双顺反子。在细胞质中，L1 -ORF1展品无论是顺式结合位它打包了自己的RNA或反式结合位它打包其他的RNA（ 即 SINE / SVAS /假）与L1 -ORF2p ⁷形成核糖核蛋白颗粒^{（RNP） 8。}的RNP易位进入细胞核其中L1 -ORF2p刻痕基因组DNA（gDNA的）的核酸内切酶活以暴露的OH ^-基团^9，即轮流使用逆转录酶素和反向合成的RNA，从3'末端的DNA。期间反转的合成，DNA的第二链被缺口从原始切口部位7-20碱基创建交错符它们填充以形成签名L1插入序列（ 例如 ，TTTTAA）称为目标部位重复^{（TSD）9,10。}这个过程被称为目标素逆转录（TPRT）并导致inserti上在插入序列的两端的L1 /与TSDS其他DNA的完整或截短的副本。L1反转录也已经显示，通过介导TPRT状非同源末端接合在一些细胞类型^11。

在我们的研究中所用的L 1反转录载体是非附加型和由标签L1 -ORF1＆2P通过组合CMV-L1-5'UTR启动子驱动（ 图^1）12的。这种结构的早期版本已在使用酵母和人类细胞培养^13,14,15研究进行了描述。位于5'和3'两个不同的CMV启动子的载体的结束时，用3'末端放置在反向方向，剪接和融合后带动新霉素的表达。在3'末端的反转录指示符盒由一个新霉素基因插入的反义到L1 -ORFs的和的glob呈现由分离非活性成两半在与拼接供体（SD）和剪接受体（SA）位点（ 图1）的内含子。一旦整合到染色体中，L1是从共同的启动子转录产生，它由一个双顺反子mRNA的和不活动的新霉素基因的mRNA。期间RNA加工，球蛋白内含子剪接出来的新霉素基因的恢复一个全功能的新霉素基因。该混合的mRNA包装成在顺一个RNP和易位进入它被整合到基因组作为使用TPRT任全长或截短的插入的核。

在这里，我们描述了使用荧光原位杂交（FISH）用专门针对拼接新霉素基因（SNeo）探针在单核水平来跟踪L1 -retrotransposiition型态和插入率的方法。效率和检测的特异性是使用反转录称职和不称职的结构和探针DET证实等SNeo或新霉素和珠蛋白内含子交界处^16。这种方法占一些细胞培养基于反转录测定法，如多次插入，菌落电阻和有利的克隆扩充的缺点。

研究方案

注意:所有步骤应在室温下进行，除非另有规定。请参考试剂部分如何准备单独的试剂的详细信息。

1.标签L1探头

注:探头可以通过化学或PCR标记进行标记。

1. 化学标记
   1. 使在Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液，热0.7-1％琼脂糖凝胶在微波直到熔融，使凝胶冷却，然后加入溴化乙啶（0.5微克/毫升）。倒入凝胶托盘，添加梳子和使凝胶在室温下固化。
   2. 根据制造商的协议标签用Cy3或FITC的SNeo探针（1-2微克），在37℃1小时。
      注:SNeo表示在S pliced ​​逆转录转座子的完整周期之后表达新霉素基因。探头的尺寸〜1000 bp之间。 SNeo可以从任何载体或从染色体组进行PCR扩增IC DNA。见材料和试剂表上链霉亲和CY3 / FITC标记试剂的信息。
   3. 混合用1×DNA上样缓冲液，负载标记SNeo探针溶液导入各孔中，并在75-100伏运行15-20分钟。
   4. 使用紫外（UV）照明形象化探头频带。注意，SNeo探针的大小可以调整，并且锁核酸（LNA）也可以被添加（ 图2）。
   5. 切从凝胶标记SNeo探针用干净的刀片，溶解，并且使用按照制造商的方案在PCR清理试剂盒从凝胶中纯化SNeo探针。
      注意:查看和切割凝胶时盖在身上与防护盾（即实验室外套和UV明确面罩）的每一个暴露的部分。见材料表和试剂的信息，凝胶纯化PCR产物。
   6. 重新运行5微升SNeo的标记探针在0.7％琼​​脂糖凝胶一个未标记探针SNeo（参见1.1.1）精读企业规模的增加和信号强度的损失（ 图2）。
   7. 在无核酸酶的H ₂ O，通过测量260nm处的吸光度定量标记SNeo探针的量和稀释SNeo探针10毫微克/微升等份商店等分于-20℃。
2. PCR标记（探针标记的另一种方法）
   1. 结合SNeo特异性引物（5'-ggatagcattgggagatatacct-3'和5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3'）与PCR试 ​​剂成一个单一的管:13.6微升不含核酸酶_的 H ₂ O; 0.1微升的dATP，dCTP，dGTP（10纳米）; 0.05微升的dTTP（10纳米）; 0.05微升的dUTP / dUTP的-FITC / CY3（10纳米）; 4微升去标签5×缓冲; 0.4微升去标签聚合酶; 1微升SNeo模板（10毫微克）。见材料与试剂的表上的PCR试剂的信息。
   2. 通过样品的总数乘以调整各试剂的量。
   3. 使用以下PCR循环参数s至放大和标签SNeo探针:95℃，2分钟; 95℃35个循环，30秒，62℃，30秒，72℃60秒; 72℃，2分钟;在4℃保持下去。
      注:退火温度可以调节或梯度PCR就可以完成，以确定最佳退火温度为其他探针。
   4. 让0.7-1％凝胶如第1.1.1节，加载和可视化探测波段，如第1.1.4。
   5. 剪切和净化标记SNeo探针在第1.1.5。
   6. 重新运行5微升SNeo标有联合国标记的SNeo探针来确认大小的增加和信号强度的损失探针（ 见图2）。
   7. 在无核酸酶的H ₂ O，通过测量260nm处的吸光度定量标记SNeo探针的量和稀释SNeo探针10毫微克/微升等份

2.准备染色体价差

1. 产生表达载体骨架稳定克隆（CONTRO升）或反转录主管L1使用标准选择方法^。12,16虽然非附加型记者被用于转录的研究的结果相互关联，也可以使用游离型载体。生长细胞稳定表达控制或L1载体（每10cm平板1×10 ^6个细胞，并在板尺寸所需调整。制造）在完全生长培养基。对HepG2细胞，用RPMI-1600，10％FBS和200微克/毫升潮霉素。生长培养至70％汇合，在37℃和5％的CO _2。
   注:生长培养基的选择是依赖于细胞类型。定，这里使用的质粒携带为潮霉素和新霉素选择盒，克隆的稳定的选择也可以与上潮霉素选择后新霉素进行，但需要进行优化，以建立公差水平对于每个小区类型新霉素的量。
2. 秋水仙胺增加（0.4微克/毫升），以培养和孵化90分钟以metaph逮捕细胞酶。如果使用不同类型的细胞，确定最佳中期阻滞凭经验秋水仙胺和曝光的时间（60，90，和120分钟）的最佳浓度。
3. 洗涤细胞，加入3-5毫升0.25％胰蛋白酶溶液至细胞，并孵育5分钟，以分离细胞用10ml 1×Dulbecco氏PBS（DPBS），trypsinize的2倍。灭活胰蛋白酶与等量的含10％FBS的介质。
4. 离心2分钟将细胞以1000 xg离心在4℃下，吸从细胞沉淀中的培养基并用DPBS洗涤细胞。吸出所有的DPBS，留下200微升DPBS来重新悬浮细胞。确保细胞充分混合，所有的团块分散。使用闪烁或轻柔吹打混合和分散团块，避免涡流。
5. 添加5毫升低渗溶液的（ 即，75毫米氯化钾），它是当水平旋转15毫升管预加热到37℃，逐滴，并在37℃下孵育20分钟。见材料和Reagen的表TS有关如何获取并低渗溶液信息。
6. 在120×g离心在4℃下5分钟，并重复离心细胞步骤2.4 - 2.5 3×留下约200μl的低渗溶液中重新悬浮每次洗涤后的细胞。保证在3次洗涤结束后，将沉淀是明显的白色和肿胀。
7. 重悬在200μl的卡诺固定液沉淀和使1:2,1:4,1:8 1:16稀释在卡诺固定液。从大约为1厘米以上下降10微升每个稀释到干干净的玻片，并立即从30秒沸水暴露自由传播，一边热蒸汽。见材料和试剂信息表就如何使卡诺固定液。
8. 用0.1微克/干差在室温下，污点毫升的Hoechst-33342通过浸渍在科普林罐15-20分钟，洗3次用DPBS。见材料和试剂信息表上如何使赫斯特-33342的解决方案。
9. 查看利差荧光/相差显微镜放大40倍。优化传播的准备后，利差不需要用Hoechst-33342 染色 。在放大10倍的相差显微镜查看利差来确定传播的质量和分离，在结果部分概述（ 见图3）。
10. 选择并在滑动的相对侧绕有钻石点标记好差（ 即，扩展自由侧）。
11. 商店价差在-20°C至一个月。避免接触水分。

3. 荧光原位杂交（FISH）

1. 稳定和脱水利差
   注意:如果储存在-20℃中平衡中期染色体扩散到室温。见材料和信息试剂的表如何获得和使试剂。
   1. 孵育中期染色体用200微升RNA酶A的传播在37℃下1小时。
   2. 洗涤在2×-SSC缓冲液滑动两次，每次5分钟，随后用10mM的HCl溶液漂洗。
   3. 在37℃下孵育，用1％的胃蛋白酶差为10分钟，用去离子水₂ O冲洗，并用2×-SSC缓冲液洗两次，每次5分钟。
   4. 孵育，用4％多聚甲醛涂抹10分钟，并在2×SSC缓冲液洗两次，每次5分钟。
   5. 70％，80％和95％的乙醇:脱水通过2分钟的乙醇系列孵育传播。
   6. 风干的幻灯片。
2. 杂交L1逆转录转座子标记的探针价差（即 SNeo）
   注意:对于直接标记探针，避免光线照射远在任何时候。见材料和信息试剂的表如何获得和使试剂。
   1. 加入30纳克SNeo的杂交缓冲液中，热在72℃10分钟并冷却，在室温下2分钟。
   2. 加入30微升SNeo探针溶液到eACH蔓延，盖上盖玻片和密封橡胶水泥的边缘。确保没有泡沫的形成。
   3. 加热在72℃的滑动用于热块上5分钟，温度逐渐下降至37℃，并在37℃的黑暗潮湿的腔室孵育过夜。
3. 洗涤和查看（或二次抗体中添加）
   注意:对于直接标记探针，避免光线照射远在任何时候。
   注:请参阅材料以及有关如何准备试剂信息表。建议足够的体积，以覆盖整个染色体扩散的用途。请记住，加盖玻片当过量体积都将丢失。
   1. 沉浸在幻灯片2X SSC缓冲液去除盖玻片。
   2. 在45℃下在2X-SSC缓冲液通过浸渍洗涤玻片5分钟。
   3. 在45℃在洗涤缓冲液中浸泡洗玻片5分钟，2次。
   4. 在45℃下在0.1×SSC缓冲液通过浸渍洗涤玻片10分钟。
   5. 在45℃下在2×SSC缓冲液通过浸渍洗涤玻片10分钟。
      注意:将包含建议缓冲区水浴科普林罐，调节温度至45℃。
   6. 凉爽的幻灯片到室温并平衡在检测缓冲幻灯片。
   7. 对于直接标记探针，跳到步骤3.4.10。
   8. 对于间接标记探针，在20-30分钟封闭液块DPBS洗3次。
   9. 用50μl二抗（ 例如 ，5微克/毫升的链霉-FITC或αCY3在封闭缓冲液）1小时孵育。
   10. 洗载玻片在2×SSC 5分钟两次。
   11. 染液用Hoechst-33342溶液（0.1微克/毫升）10分钟。
       注:此染色完成染色为共定位与探针的染色体。
   12. 洗在DPBS 3倍，增加安装介质一滴，放置盖玻片并密封用指甲油的边缘。
   13. 利用荧光显微镜在40倍均线分析L1逆转录转座子gnification。

结果

在L1反转录载体的示意图示于图1中 。该载体包括在反义方向的L1的ORF新霉素基因，该基因是通过在有义方向一个球蛋白内含子中断，由SD和SA位点夹持的。当稳定地整合入染色体中，L1基因是从组合CMV和L1-5'UTR启动子（ 图1）转录。在RNA加工，珠蛋白内含子拼接出新霉素基因。的新- L1 RNA被打包，易位和整合进基因组，?...

讨论

方法，如全基因组测序，反向PCR和Southern杂交已用于研究L1逆转录转座子。虽然这些方法是在基因组内发生L1插入定位极有价值，为所有这些混杂的挑战是需要在硅片编程进行重组序列。这里所描述的FISH方法被设计以补充这些方法，特别是在需要在培养细胞中的异位L1反转录的分析研究的情况。该方法可用于反转录事件的定量和定性评价和施加到间期核。这种方法拥有的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labeling Probes
Go Tag DNA polymerase	Promega	M3178
GO Tag 10x colorless buffer	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water.
dUTP-16-Biotin (0.5 mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5 mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5 mM)	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up kit	Qiagen	1410/0030	Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR Machine			Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.
Agarose	Sigma	A9539
Preparing chromosome Spreads
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml
1 M KCl	Sigma	P9541	Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution
Carnoy Fixative Solution			Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.
Methanol	Sigma	322415
Acetic acid	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml.
Diamond Point Marker	Thermo Scientific	750
Frosted Slides	Thermo Scientific	2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	R001100	To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media.
Cover slides	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.
Beaker (600 ml)	Sigma	CLS1003600	Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.
Nikon Microscope	Nikon	125690	Any microscope can be used to look at spread quality.
Reagents and Materials for FISH
Trisodium citrate	Sigma	S1804
Sodium Chroride	Sigma	S3014
Formamide	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfate	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Salmon Sperm DNA	Life Technologies	15632-011
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Ethyl Alcohol	Sigma	459844
Methanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml.
Rubber Cement/Cytobond Sealant		2020-00-1
Seven Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Dark Humidified chamber	Sigma	CLS2551
Cover slides	VWR	48366067
Dry Digital Heat Block	VWR	13259
Fluorescence Microscope
20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC)			Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C.
1 mg/ml of Rnase A			Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time.
1% Pepsin			Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time.
4% Paraformaldehyde (4% PFA)			Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.
Wash Buffer			Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O.
Hybridization Buffer			Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount.
Detection Buffer			Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.
Blocking Buffer			Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer.
Dehydrating Solution			Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.