Analyse de LINE-1 Rétrotransposition au Nucleus Simple Level

Résumé

Ici , nous utilisons la méthodologie FISH pour suivre LINE-1 retrotransposition au niveau des noyaux unique étalements de chromosomes de lignées cellulaires HepG2 exprimant de façon stable LINE-1 synthétique.

Résumé

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Introduction

Human long Interspersed nucléaire Element-1 (Line-1 ou L1) est un élément mobile autonome qui se propage dans le génome par un "copier-coller" mécanisme de retrotransposition. A L1 humain typique est environ 6 kb et consiste en un 5'UTR (région non traduite) qui sert de promoteur, deux cadres de lecture ouverts (ORF): L1 et L1 -ORF1 -ORF2, et un 3'UTR avec un polyA . queue L1 protéine -ORF1 a trois domaines distincts: un domaine bobine-bobine, ARN reconnaissance Motif et domaine C-terminal, alors que la protéine L1 -ORF2 a endonucléase, la transcriptase inverse et cystéine riches domaines ^1,2,3,4,5. L1 -ORF1 présente des activités chaperonnes d'acide nucléique, tandis que L1 -ORF2 fournit des activités enzymatiques, avec les protéines nécessaires à la rétrotransposition ^1,2,6.

Un cycle de L1 retrotransposition commence par la transcription de la 5'UTR de L1 ARNm bicistronique par l'ARN polymérase II, translocation dans le cytoplasme, et la traduction. Dans le cytoplasme, L1 -ORF1 présente soit cis de liaison d' où elle conditionne son propre ARN ou trans liaison d' où elle emballe les autres ARN (c. -à- SINE / SVA / pseudogènes) pour former une particule de ribonucléoprotéine (RNP) avec L1 -ORF2p ^{7, 8.} RNP translocation dans le noyau où l'activité d'endonucléase de L1 -ORF2p pseudos ADN génomique (ADNg) pour exposer un groupe OH ^- groupe ^9, qui est à son tour utilisé par la transcriptase inverse pour amorcer et inverse l' ARN synthétisent l'ADN de l' extrémité 3 '. Lors de la synthèse inverse, le second brin d'ADN est entaillé 7-20 pb à partir du site nick d' origine pour créer des pauses décalées qui sont remplis pour former les signatures insertion L1 séquences (par exemple, TTTTAA) appelés duplications site cible (DNT) ^9,10. Ce processus est connu comme cible principale transcription inverse (TPRT) et conduit à Insertisur des copies complètes ou tronquées de L1 / DNT avec d' autres ADN aux deux extrémités de la séquence insérée L1 rétrotransposition a également été démontré. médié par TPRT analogue à la fin de jonction non homologue dans certains types de cellules ^11.

Le vecteur L1 rétrotransposition utilisé dans nos études est non épisomiques et se compose de tagged L1 -ORF1 & 2p commandés par des promoteurs CMV L1-5'UTR combinés (figure 1) ^12. Les versions antérieures de cette construction ont été décrits dans des études utilisant des levures et des cultures de cellules humaines ^13,14,15. Deux promoteurs CMV distincts situés aux extrémités 5 'et 3' du vecteur, à l'extrémité 3 'placé dans une orientation inverse pour diriger l'expression de la néomycine après épissage et d'intégration. La cassette d'indicateur de rétrotransposition à l' extrémité 3 ' se compose d'un gène inséré anti - sens à la néomycine L1 -ORFs et rendu inactif par séparation en deux moitiés par une bouledans l' intron avec le donateur épissage (SD) et accepteur épissage (SA) sites (figure 1). Lors de l' intégration dans un chromosome, L1 est transcrit à partir du promoteur commun pour produire un ARNm qui est constitué d'un ARNm bicistronique et de l' ARNm néomycine inactif. Au cours du traitement de l'ARN, l'intron de globine est épissé du gène de la néomycine pour restaurer un gène de néomycine complètement fonctionnel. L'ARNm hybride est emballé dans un RNP en cis et translocation dans le noyau où il est intégré dans le génome comme étant soit pleine longueur ou tronquées insertions en utilisant TPRT.

Nous décrivons ici une méthode qui utilise l' hybridation fluorescente in situ (FISH) avec des sondes spécifiquement dirigés au gène de la néomycine épissé (Sneo) pour suivre les habitudes de -retrotransposiition L1 et les taux d'insertion au niveau du noyau unique. L'efficacité et la spécificité de la détection a été confirmée en utilisant retrotransposition compétent et constructions incompétents et sondes pour detect Sneo ou la néomycine et globine intron jonction ^16. Cette méthodologie représente pour certaines des lacunes des tests de rétrotransposition à base de culture cellulaire, tels que des insertions multiples, la résistance des colonies et l'expansion du clone favorable.

Protocole

Remarque: Toutes les étapes doit être effectuée à la température ambiante, sauf indication contraire. S'il vous plaît se référer à la section Réactifs pour plus de détails sur la façon de préparer des réactifs individuels.

1. Étiquetage L1 Sondes

REMARQUE: Les sondes peuvent être marquées par un marquage chimique ou PCR.

1. Marquage chimique
   1. Faire gel d'agarose à 0,7-1% dans le tampon Tris-acétate-EDTA (TAE) du tampon, de la chaleur dans un four micro-ondes jusqu'à ce que fondu, laisser refroidir le gel, puis ajouter du bromure d'éthidium (0,5 pg / ml). Verser dans le bac de gel, ajouter des peignes et laisser le gel se solidifier à la température ambiante.
   2. Marquer la sonde Sneo (1-2 pg) avec ou CY3 FITC à 37 ° C pendant 1 heure selon le protocole du fabricant.
      NOTE: Sneo désigne le S pliced ​​gène mycin Neo exprimé après un cycle complet de retrotransposition. La sonde est de ~ 1000 pb. Sneo peut être amplifié par PCR de tout vecteur ou de genomic ADN. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour des informations sur streptavidine CY3 / FITC réactifs de marquage.
   3. Mélanger la solution de sonde Sneo marquée avec un tampon d'ADN 1x de chargement, charge dans chaque puits et exécuter à 75-100 volts pendant 15-20 min.
   4. Visualiser la bande de sonde en utilisant un Ultra Violet (UV) Illuminateur. Notez que la taille de la sonde Sneo peut être ajustée et que les noyaux de verrouillage d' acide (LNA) peut également être ajoutée (figure 2).
   5. Cut sonde marquée Sneo du gel avec une lame propre, solubiliser et purifier la sonde Sneo du gel en utilisant un kit Clean-Up PCR selon le protocole du fabricant.
      ATTENTION: Couvrir chaque de partie exposée du corps avec des boucliers de protection (c. -à- manteaux de laboratoire et UV masque clair) lors de la visualisation et la coupe du gel. Voir le tableau des matières et réactifs pour information au gel purifier les produits de PCR.
   6. Re-run 5 pi de Sneo étiquetés sonde avec une sonde Sneo non marqué sur un gel d'agarose à 0,7% (voir 1.1.1) pour conAugmenter la taille de l' entreprise et la perte d'intensité du signal (figure 2).
   7. Quantifier la quantité de sonde Sneo marqué en mesurant l'absorbance à 260 nm et diluer la sonde Sneo à 10 ng / ul aliquotes dans nucléase libre H ₂ O. aliquotes de conserver à -20 ° C.
2. Étiquetage PCR (méthode alternative pour l' étiquetage de la sonde)
   1. Combiner des amorces spécifiques (5'-Sneo ggatagcattgggagatatacct-3 'et 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') avec des réactifs de PCR dans un seul tube: 13,6 ul de nuclease libre H ₂ O; 0,1 pi de dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 ul dTTP (10 nM); 0,05 ul dUTP-biotine / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 pi Go Tag 5x tampon; 0,4 ul Go Tag Polymerase; 1 pl Sneo gabarit (10 ng). Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour des informations sur les réactifs de PCR.
   2. Ajuster la quantité de chaque réactif en multipliant par le nombre total d'échantillons.
   3. Utilisez le paramètre vélo PCR suivants pour amplifier et d'étiquettes Sneo sondes: 95 ° C pendant 2 minutes; 35 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 62 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 60 secondes; 72 ° C pendant 2 min; Tenir à 4 ° C indéfiniment.
      REMARQUE: La température de recuit peut être ajustée ou PCR gradient peut être effectuée pour déterminer des températures de recuit optimales pour d'autres sondes.
   4. Faire gel 0,7-1% comme dans la section 1.1.1, la charge et de visualiser la bande de sonde dans la section 1.1.4.
   5. Couper et purifier la sonde Sneo étiquetés comme dans la section 1.1.5.
   6. Re-run 5 pi de Sneo étiquetés sonde avec Sneo sonde non marqué pour confirmer l' augmentation de la taille et la perte d'intensité du signal (voir la figure 2).
   7. Quantifier la quantité de sonde Sneo marquée par mesure de l' absorbance à 260 nm et diluer la sonde Sneo à 10 ng / ul aliquotes dans nucléase libre H ₂ O.

2. Préparation des étalements chromosomiques

1. Générer des clones stables exprimant le squelette du vecteur (control) ou rétrotransposition L1 compétent en utilisant des méthodes classiques de sélection. ^12,16 Bien que les reporters non épisomiques ont été utilisés pour mettre en corrélation les résultats avec les études de transcription, des vecteurs épisomiques peuvent également être utilisés. Cultiver des cellules exprimant de manière stable le contrôle ou L1 vecteur (1 x 10 ⁶ cellules par 10 cm plaque, avec des ajustements de la taille de la plaque réalisés selon les besoins) dans les milieux de croissance complet. Pour les cellules HepG2, en utilisant du RPMI-1600, 10% de SVF et 200 ug / ml d'hygromycine. Cultiver les cultures à 70% de confluence à 37 ° C et 5% de CO _2.
   NOTE: Le choix du milieu de croissance est dépendante du type de cellule. Etant donné que les plasmides utilisés ici comportent des cassettes de sélection à la fois pour l'hygromycine et la néomycine, la sélection stable de clones pourrait également être fait avec de la néomycine après sélection sur hygromycine, mais la quantité de néomycine doit être optimisé pour établir des seuils de tolérance pour chaque type de cellule.
2. Ajouter colcémide (0,4 pg / ml) au milieu de culture et incuber pendant 90 min pour arrêter les cellules à métaphase. Si l'on utilise différents types de cellules, déterminer la concentration optimale de la colcémide et le temps d'exposition (60, 90 et 120 min) pour optimiser arrêt de la métaphase de manière empirique.
3. Laver les cellules 2 fois avec 10 ml de PBS 1x Dulbecco (DPBS), trypsiniser en y ajoutant 5/3 ml d'une solution à 0,25% de trypsine aux cellules et incuber pendant 5 minutes pour détacher les cellules. Inactiver trypsine avec une quantité égale de milieux contenant 10% de FBS.
4. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 1000 x g à 4 ° C, aspirer le milieu à partir du culot cellulaire et laver les cellules avec du DPBS. Aspirer tous les DPBS, laissant 200 pi de DPBS pour remettre en suspension les cellules. cellules Veiller sont bien mélangés et que tous les bouquets sont dispersés. Utilisez le scintillement ou pipetage doux pour mélanger et disperser des touffes et éviter tourbillonnement.
5. Ajouter 5 ml de solution hypotonique (ie, 75 mM KCl) qui est pré-chauffé à 37 ° C goutte à goutte tout en faisant tourner le tube de 15 ml horizontalement et incuber à 37 ° C pendant 20 min. Voir le tableau des matériaux et Reagents pour obtenir des informations sur la façon d'obtenir et de faire une solution hypotonique.
6. Centrifuger les cellules à 120 g pendant 5 min à 4 ° C et répétez les étapes 02.04 à 02.05 3x laissant environ 200 pi de solution hypotonique pour remettre en suspension les cellules après chaque lavage. Faire en sorte que, à la fin des 3 lavages, le culot est visiblement blanc et gonflé.
7. Re-suspendre le culot dans 200 ul de solution Carnoy fixatif et faire 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 dilutions en solution Carnoy fixatif. Déposer 10 ul de chaque dilution sur une lame propre et sec à partir d'environ 1 cm au-dessus et d'exposer immédiatement le côté libre diffusion à la vapeur chaude de l'eau bouillante pendant 30 secondes. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour des informations sur la façon de rendre la solution Carnoy fixatif.
8. Sécher les écarts à la température ambiante, tache avec 0,1 pg / ml de Hoechst-33342 par immersion pendant 15-20 min en Coplin Jar et laver 3x avec du DPBS. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon de rendre la solution Hoechst-33342.
9. Voir se propage sur la fluorescence / contraste de phase microscope au grossissement 40X. Après l' optimisation de la préparation de la propagation, les écarts ne doivent pas être colorées avec Hoechst-33342. Voir se propage sur le contraste de phase microscope au grossissement 10X pour déterminer la qualité et la propagation de séparation tel que décrit dans la section des résultats (voir Figure 3).
10. Sélectionnez et encerclez bons spreads avec un Marqueur de diamant sur ​​le côté opposé de la glissière (c. -à- diffuser sans côté).
11. Magasin se propage à -20 ° C pendant jusqu'à un mois. Eviter l'exposition à l'humidité.

3. Fluorescence In Situ Hybridation (FISH)

1. Stabiliser et déshydratant spreads
   NOTE: Equilibrer métaphase chromosome se propage à la température ambiante si elle est conservée à -20 ° C. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon d'obtenir et de faire des réactifs.
   1. Incuber métaphase chromosome se propage avec 200 pi RNase A pour1 heure à 37 ° C.
   2. Laver les lames dans du tampon SSC 2x deux fois pendant 5 min à chaque fois suivi d'un rinçage avec une solution 10 mM de HCl.
   3. Incuber spreads avec 1% de pepsine pendant 10 min à 37 ° C, rincer avec de l' H ₂ O désionisée et laver deux fois avec un tampon de 2x-SSC pendant 5 minutes chacun.
   4. Incuber spreads avec 4% de paraformaldehyde pendant 10 minutes et laver dans un tampon SSC 2x deux fois pendant 5 min chacun.
   5. Déshydrater se propager par incubation pendant 2 min dans une série d'éthanol: 70%, 80% et 95% d'éthanol.
   6. diapositives Air sec.
2. Hybridation Spreads avec L1 sondes rétrotransposition marqué au (ie, Sneo)
   ATTENTION: Pour les sondes directes marqué, tenir à l'écart de la lumière à tout moment. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon d'obtenir et de faire des réactifs.
   1. Ajouter 30 ng d'Sneo à un tampon d'hybridation, de la chaleur à 72 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir pendant 2 minutes à la température ambiante.
   2. Ajouter 30 pl de solution de sonde Sneo à each propagation, couvrir avec lamelle et sceller les bords avec du ciment en caoutchouc. Assurez-vous qu'aucune formation de bulles.
   3. Chauffer la lame à 72 ° C pendant 5 minutes sur un bloc de chaleur, baisse progressive de la température à 37 ° C, et incuber pendant une nuit dans une chambre humidifiée obscurité à 37 ° C.
3. Lavage et Affichage (ou adjonction d'anticorps secondaire)
   ATTENTION: Pour les sondes directes marqué, tenir à l'écart de la lumière à tout moment.
   NOTE: Voir le tableau des matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon de se préparer. Utilisation d'un volume suffisant pour couvrir la totalité de la propagation des chromosomes est recommandé. Rappelez-vous que le volume excédentaire sera perdue lorsque la lamelle est ajouté.
   1. Immerger les lames dans un tampon SSC 2x pour enlever des lamelles.
   2. Laver les lames par immersion dans un tampon de SSC 2x à 45 ° C pendant 5 min.
   3. Laver les lames par immersion dans un tampon de lavage à 45 ° C pendant 5 minutes, 2x.
   4. Laver les lames par immersion dans du tampon SSC 0,1x à 45 ° C pendant 10 min.
   5. Laver les lames par immersion dans un tampon SSC 2x à 45 ° C pendant 10 min.
      REMARQUE: Placez un pot Coplin contenant du tampon recommandé dans un bain d'eau, régler la température à 45 ° C.
   6. Refroidir les lames à température ambiante et équilibrer les lames dans le tampon de détection.
   7. Pour des sondes marquées directes, passez à l'étape 3.4.10.
   8. Pour des sondes marquées indirectes, bloc dans un tampon de blocage pendant 20-30 min et laver 3x dans DPBS.
   9. Incuber avec 50 pi d'anticorps secondaire (par exemple, 5 ug / ml de streptavidine-FITC, ou αCY3 dans un tampon de blocage) pendant 1 h.
   10. Laver les lames dans 2x SSC pendant 5 minutes deux fois.
   11. Counterstain avec Hoechst-33342 solution (0,1 pg / ml) pendant 10 min.
       NOTE: cette coloration est fait pour colorer les chromosomes pour la co-localisation avec sonde.
   12. Laver à DPBS 3x, ajouter une goutte de milieu de montage, placer une lamelle et sceller les bords avec du vernis à ongles.
   13. Analyser L1 retrotransposition en utilisant un microscope à fluorescence à 40X magnification.

Résultats

Un diagramme schématique du vecteur rétrotransposition L1 est présenté dans la figure 1. Le vecteur est constitué d'un gène de la néomycine dans l' orientation antisens par rapport à L1 ORFs qui est interrompu par un intron de globine dans l' orientation sens et pris en sandwich par les sites SD et SA. Quand intégré de façon stable dans un chromosome, L1 ARNm est transcrit à partir du promoteur CMV et le combiné L1-5...

Discussion

Des méthodologies telles que le séquençage du génome entier, PCR inverse et dans le sud - blot ont été utilisées pour étudier L1 retrotransposition. Bien que ces méthodes sont extrêmement utiles pour localiser où insertions L1 se produisent dans les génomes, un défi de confusion pour chacun d'eux est la nécessité pour la programmation in-silico pour réassembler des séquences. La méthodologie FISH décrite ici est conçue pour compléter ces méthodes, en particulier dans ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labeling Probes
Go Tag DNA polymerase	Promega	M3178
GO Tag 10x colorless buffer	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water.
dUTP-16-Biotin (0.5 mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0.5 mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0.5 mM)	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Labeling Kit	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up kit	Qiagen	1410/0030	Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR Machine			Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.
Agarose	Sigma	A9539
Preparing chromosome Spreads
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml
1 M KCl	Sigma	P9541	Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution
Carnoy Fixative Solution			Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.
Methanol	Sigma	322415
Acetic acid	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml.
Diamond Point Marker	Thermo Scientific	750
Frosted Slides	Thermo Scientific	2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	R001100	To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media.
Cover slides	VWR	48366067
Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Heat Block			Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.
Beaker (600 ml)	Sigma	CLS1003600	Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.
Nikon Microscope	Nikon	125690	Any microscope can be used to look at spread quality.
Reagents and Materials for FISH
Trisodium citrate	Sigma	S1804
Sodium Chroride	Sigma	S3014
Formamide	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfate	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Salmon Sperm DNA	Life Technologies	15632-011
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Ethyl Alcohol	Sigma	459844
Methanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml.
Rubber Cement/Cytobond Sealant		2020-00-1
Seven Coplin Jars	Thermo Scientific	107
Dark Humidified chamber	Sigma	CLS2551
Cover slides	VWR	48366067
Dry Digital Heat Block	VWR	13259
Fluorescence Microscope
20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC)			Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C.
1 mg/ml of Rnase A			Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time.
1% Pepsin			Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time.
4% Paraformaldehyde (4% PFA)			Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.
Wash Buffer			Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O.
Hybridization Buffer			Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount.
Detection Buffer			Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.
Blocking Buffer			Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer.
Dehydrating Solution			Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.