تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em

Summary

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Abstract

الكوكسيلا البورنيتية، وكيل يسبب حمى Q، هو البكتيريا داخل الخلايا إلزام. وقد وضعت PCR المقايسات التشخيص للكشف عن C. الحمض النووي البورنيتية في مزارع الخلايا والعينات السريرية. PCR يتطلب معدات متخصصة وتدريب المستخدمين واسعة نهاية، وبالتالي، فإنه ليس مناسبة للعمل الروتيني وخصوصا في منطقة محدودة الموارد. لقد قمنا بتطوير فحص بوساطة حلقة متساوي الحرارة التضخيم (LAMP) للكشف عن وجود C. البورنيتية في عينات من المرضى. يتم تنفيذ هذه الطريقة في درجة حرارة واحدة نحو 60 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة التدفئة. حساسية هذا الاختبار LAMP هي مشابهة جدا لPCR مع حد الكشف عن حوالي 25 نسخة في رد الفعل. ويصف هذا التقرير إعداد رد فعل باستخدام الكواشف مجفف بالتجميد وتصور النتائج باستخدام اللون الأزرق hydroxynaphthol (HNB) أو مصباح الأشعة فوق البنفسجية مع صبغة الإقحام الفلورسنت في رد الفعل. كانت الكواشف LAMP lyophiliزيد وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة شهر واحد دون فقدان للحساسية الكشف. هذا الاختبار مصباح قوي بشكل خاص لإعداد خليط التفاعل لا ينطوي على خطوات معقدة. هذه الطريقة مثالية للاستخدام في المناطق ذات الموارد المحدودة حيث حمى Q متوطن.

Introduction

وسلبية الغرام بكتيريا صغيرة الكوكسيلا البورنيتية هو العامل المسبب للحمى Q، وهو مرض حيواني المصدر في جميع أنحاء العالم. نظرا للتوزيع في جميع أنحاء العالم س حمى في والعدوى عالية من C. البورنيتية والموظفين العسكريين والمدنيين الأمريكيين المنتشرين في الخارج معرضون لخطر الإصابة بالعدوى في المناطق الموبوءة.

يظهر حمى Q في شكلين: الالتهابات الحادة والمزمنة. يعرض الحاد Q-حمى نفسه من أعراض تشبه أعراض الأنفلونزا، والتهاب الكبد، أو الالتهاب الرئوي، وعادة ما يكون المرض الذاتي الحد مع معدل وفيات منخفض. المزمنة حمى Q، في حين أن أقل انتشارا، وغالبا ما يؤدي إلى التهاب الشغاف، والتي لديها معدل وفيات أعلى من ذلك بكثير إذا تركت دون علاج ^1،2. لذلك فإن التشخيص المبكر لتوجيه العلاج المناسب هو أمر حاسم لرعاية المرضى. وقد وضعت تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي الكمي PCR (QPCR) فحوصات للكشف عن C. الحمض النووي البورنيتية في مزارع الخلايا وعينات سريرية ^{3-5 <}/ سوب>. كلا PCR وQPCR مكلفة وغالبا ما تكون غير متاحة بسهولة في المناطق ذات الموارد المحدودة للعمل الروتيني.

وصف الأصلية كتبت بواسطة Notomi ^6، بوساطة حلقة التضخيم متساوي الحرارة (LAMP) يوفر طريقة الحمض النووي التضخيم بديل. يستخدم مصباح البلمرة بتوقيت جرينتش الحمض النووي حبلا النزوح توليف الحمض النووي جنبا إلى جنب مع مجموعات التمهيدي مصممة خصيصا تعترف لا يقل عن ستة أقاليم مستقلة عن الجينات المستهدفة. أهم ميزة من مصباح هو أن التضخيم يحدث في ظل ظروف متساوي الحرارة. لذلك، فقط مطلوب حمام مائي، كتلة التدفئة أو حاضنة. وقد استخدمت هذه الطريقة للكشف عن عدة مسببات الأمراض ريكيتسي ^7-9. التصور منتجات تضخيم الحمض النووي من قبل الكهربائي للهلام هو الأسلوب الأكثر دقة التي يمكن أن تفرق ايجابيات الحقيقية من ايجابيات كاذبة بسبب التضخيم غير محددة. ومع ذلك الإجراءات المتعلقة الكهربائي للهلام ليست عملية لع ذات الموارد المحدودةقمة شرق آسيا. وقد وضعت عدة طرق بديلة للكشف عن منتجات التفاعل. هذه البدائل، مثل تعكر المستمدة من تشكيل بيروفوسفات المغنيسيوم ¹⁰ أو باستخدام صبغة الفلورسنت الإقحام أن تصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ^11،12 هم أكثر ملاءمة من تشغيل هلام. كانت الكواشف LAMP مستقرة لمدة شهر واحد عند تخزينها في درجة حرارة 25 درجة مئوية و 37 درجة مئوية، وهي درجة حرارة الجو المحيط في البلدان الاستوائية وشبه الاستوائية حيث حمى Q متوطن ^13.

وقد تم تطوير فحص مصباح في مختبرنا للكشف عن وجود C. البورنيتية في عينات البلازما ^14. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لإعداد خليط التفاعل مصباح من الكواشف مجفف بالتجميد. الكواشف مجفف بالتجميد مستقرة لمدة شهر واحد عند تخزينها في RT. عندما جنبا إلى جنب مع وسيلة سهلة التصور، وهذا هو الأسلوب الأمثل لاستخدام للكشف عن C. البورنيتية في إعداد محدودة الموارد.

Protocol

1. إعداد البلازميد الحمض النووي التخفيفات وفقا لمعايير رد الفعل LAMP

1. استخدام معمل لقياس الكثافة الضوئية (OD) في 260 نانومتر لتحديد البلازميد (التي تحتوي على IS1111a الجين المستهدف من جيم البورنيتية RSA 493) تركيز الحمض النووي. وOD ₂₆₀ من 1 يساوي 50 ميكروغرام / ميكرولتر من الحمض النووي.
2. تحويل مبلغ من البلازميد في عدد النسخ. منذ حجم البلازميد هو 6330 سنة مضت، والوزن الجزيئي لهذا البلازميد هو 4.1 × 10 ⁶ ز (6330 بي بي س 649 ز / بي بي). تركيز الحمض النووي البلازميد هو 34.2 نانوغرام / ميكرولتر (كما هو محدد من الخطوة 1.1). 1 ميكرولتر من هذه عينة من الحمض النووي يحتوي على 34.2 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد، ما يعادل 5 × 10 ⁹ نسخ (34.2 × 10 ^-9 ز / 4.1 × 10 ⁶ GX 6.02 × 10 ²³⁾ من الحمض النووي.
3. إضافة 10 ميكرولتر من البلازميد (5 × 10 ⁹ نسخ / ميكرولتر) إلى 90 ميكرولتر من الماء لتخفيف 10 أضعاف لتقديم عينة من الحمض النووي من 5 × 10 ⁸ نسخ / ميكرولتر.
4. كرر الخطوة 1.3 لإعداد عينات من الحمض النووي من 5 × 10 ^7، 5 × 10 ^6، 5 × 10 ^5، 5 × 10 ^4، 5 × 10 ^3، 5 × 10 ^2، 5 × 10 ^1، و 5 × 10 ⁰ نسخة / ميكرولتر.

2. إعداد قالب الحمض النووي من عينات لرد الفعل LAMP

1. أداء استخراج الحمض النووي من عينات البلازما البشرية باستخدام طقم الحمض النووي مصغرة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام ما مجموعه 200 عينة ميكرولتر لاستخراج وأزل الحمض النووي المستخرج في حجم 20 ميكرولتر.

3. إعداد 2X العازلة LAMP رد الفعل

1. مزيج 200 ميكرولتر من 10X بول العازلة، 320 ميكرولتر من 5 M trimethylglycine، 12 ميكرولتر من 1 M MgSO _4، 280 ميكرولتر من خليط dNTP (10 ملم لكل منهما) و 188 ميكرولتر من الماء لجعل 1 مل من العازلة 2X مصباح. مزيج من قبل نبض vortexing لمدة 10 ثانية.

4. تنفيذ ستاندرد LAMP رد الفعل

1. مزيج 12.5 ميكرولتر من 2X LAعازلة النائب (كما أعدت في الخطوة 3 و 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.8)، 20 ملي بوكل، 16 ملي MgSO _4، 20 ملم (NH _{4) 2} SO _4، 0.2٪ تريتون X-100، 1.6 M trimethylglycine، 1.4 ملي خليط dNTP)، و 1.2 ميكرولتر من مزيج التمهيدي، 1 ميكرولتر من بوليميريز بتوقيت جرينتش الحمض النووي (8 U / ميكرولتر)، و 5.3 ميكرولتر من الماء لجعل خليط التفاعل (20 ميكرولتر) في 0.2 مل أنبوب PCR.
2. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي (من الخطوة 1 أو 2) إلى خليط التفاعل 20 ميكرولتر وتخلط جيدا.
3. انهيار أنبوب واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حمام مائي أو كتلة التدفئة. هذا هو أفضل درجة حرارة التفاعل التي سبق تحديدها.
4. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة 10X هلام تحميل لإنهاء رد فعل.
5. تحميل 5 ميكرولتر من المنتجات رد فعل على هلام الاغاروز 2٪ ملطخة الإقحام وصمة عار الحمض النووي.
6. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 35 دقيقة في المخزن 1X TBE.
7. تصور النتائج وفقا لضوء الأشعة فوق البنفسجية.

5. تنفيذ رد فعل مصباح مع المعادالكواشف

1. مزيج 125 ميكرولتر من 10X بول العازلة، 200 ميكرولتر من 5 M trimethylglycine، 7.5 ميكرولتر من 1 M MgSO _4، 667.5 ميكرولتر من الماء لجعل 1 مل من العازلة إعادة. مزيج من قبل نبض vortexing لمدة 10 ثانية.
2. إزالة الأنابيب التي تحتوي على الكواشف مجفف بالتجميد من يختم كيس رقائق الألومنيوم. لا تستخدم الأنابيب إذا لم يتم ختم كيس من رقائق الألومنيوم أو إذا كان تالفا.
3. إضافة 20 ميكرولتر من العازلة إعادة في كل أنبوب لاعادة تعليق الكواشف مجفف بالتجميد.
4. مزيج من قبل pipetting عازلة صعودا وهبوطا 5 مرات. نلقي نظرة للتأكد من الانتهاء من إعادة وقف التنفيذ الكواشف مجفف بالتجميد. يجب أن تختفي مسحوق أبيض في الأنبوب.
5. إضافة 5 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (من الخطوة 1 أو 2) إلى الكواشف تشكيلها وتخلط جيدا.
6. انهيار أنبوب واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حمام مائي أو كتلة التدفئة.
7. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة 10X هلام تحميل لإنهاء رد فعل.
8. تحميل 5 ميكرولتر من رد فعلالمنتجات للهلام الاغاروز 2٪ ملطخة الإقحام وصمة عار الحمض النووي.
9. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 35 دقيقة في المخزن 1X TBE.
10. تصور النتائج وفقا لضوء الأشعة فوق البنفسجية.

6. تنفيذ LAMP رد الفعل مع إعادة إعماره العازلة التي تحتوي على HNB أو الفلورية الإقحام صبغ

1. مزيج 125 ميكرولتر من 10X بول العازلة، 200 ميكرولتر من 5 M trimethylglycine، 7.5 ميكرولتر من 1 M MgSO _4، 7.5 ميكرولتر من 20 ملي HNB (أو 12.5 ميكرولتر من 100X صبغة الفلورسنت الإقحام) و 660 ميكرولتر (أو 655 ميكرولتر) من الماء ل جعل 1 مل من العازلة إعادة. مزيج من قبل نبض vortexing لمدة 10 ثانية.
2. استخدام المخزن المؤقت أعيد أعدت في قسم 6 إلى تكرار الخطوات 5،2-5،6.
3. تصور النتائج وفقا لبالعين المجردة (رد فعل تحتوي على HNB) أو الأشعة فوق البنفسجية (رد فعل تحتوي على صبغة الفلورسنت الإقحام).

7. تنفيذ في الوقت الحقيقي LAMP رد الفعل مع الماسح الضوئي أنبوب

1. إضافة 5 ميكرولتر الحمض النووي للreconstitutالكواشف الطبعة تحتوي على صبغة الإقحام الفلورسنت، أنبوب الوثيق وأدخله إلى الماسح الضوئي أنبوب.
2. ضبط درجة الحرارة الحضانة عند 60 درجة مئوية. قياس مضان في 520 نانومتر لمدة 60 دقيقة.

النتائج

الكواشف LAMP مجفف بالتجميد داخل أنبوب 0.2 مل تحتوي على الحمض النووي بتوقيت جرينتش البلمرة، الاشعال، وdNTPs. ويستخدم 20 ميكرولتر من العازلة إعادة لإعادة تعليق الكواشف مجفف بالتجميد. ويبين الشكل 1 نتائج رد الفعل LAMP على المواد الهلامية الاغارو?...

Discussion

سابقا، وضعنا حساس ونوعي مصباح فحص استهداف عنصر الإدراج IS1111a ^14. وقد تم اختيار العنصر IS1111 لأنه حفظها للغاية بين سلالات مختلفة من C. البورنيتية ورقمه عالية النسخ (7-110) في البكتيريا (كلي 2006). وأظهرت النتائج التي توصلنا إليها مصباح يمكن الكشف عن 25 نسخة من ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP primers	Eurofins MWG operon	10 nmol, salt free	Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase	New England Biolabs	M0275L	8 units/ml
10x Thermo pol buffer	New England Biolabs	B9004S
dNTP mixture	New England Biolabs	N0447L	10 mM each
Betaine	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	gel loading buffer
SYBR green	Invitrogen	S7585	10,000x, visualize products in tubes
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents	Gene Reach
Hydroxynaphthol blue	Fluka	33936-10G
ESEQuant tube scanner	Qiagen		real-time detection