JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Аннотация

Coxiella burnetii, агент , вызывающий лихорадку Q, является облигатным внутриклеточным бактерии. ПЦР - диагностические анализы , основанные были разработаны для обнаружения C. burnetii ДНК в клеточных культурах и клинических образцах. ПЦР требует специального оборудования и обширный обучение пользователей, и, следовательно, он не подходит для рутинной работы, особенно в ограниченных ресурсов области. Мы разработали цикл опосредованной изотермические амплификации (LAMP) анализа для обнаружения присутствия C. burnetii в образцах пациентов. Этот способ осуществляют при одной температуре около 60 ° С на водяной бане или нагревательном блоке. Чувствительность этой лампы анализа очень похож на ПЦР с пределом обнаружения около 25 копий на реакцию. Этот отчет описывает получение реакции с использованием лиофилизованных реагентов и визуализации результатов с использованием hydroxynaphthol синего (HNB) или УФ-лампы с люминесцентным интеркалирующего красителя в реакции. Лампа реагенты lyophiliзет и хранили при комнатной температуре (КТ) в течение одного месяца без потери чувствительности обнаружения. Эта лампа анализ особенно эффективен потому, что препарат реакционной смеси не включает в себя сложные шаги. Этот метод идеально подходит для использования в условиях ограниченных ресурсов, где Q лихорадка является эндемическим заболеванием.

Введение

Небольшой грамотрицательная бактерия Coxiella burnetii является возбудителем лихорадки Ку, который является во всем мире зоонозов. В связи с распространением по всему миру лихорадки Ку и высокой инфекционности C. burnetii, американские военные и гражданский персонал , развернутые за рубежом находятся под угрозой заражения в эндемичных районах.

Q лихорадка проявляется в двух формах: острых и хронических инфекций. Острый Q-лихорадка представляет себя с симптомами гриппа, гепатита или пневмонии, и, как правило, самоограничения заболевание с низкой смертностью. Хронический Q-лихорадка, в то время как менее распространены, часто приводит к эндокардит, который имеет гораздо более высокий уровень смертности при отсутствии лечения 1,2. Таким образом, ранняя диагностика, чтобы направлять соответствующее лечение имеет решающее значение для ухода за пациентами. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) анализы были разработаны для обнаружения C. burnetii ДНК в клеточных культурах и клинических образцах 3-5 </ SUP>. Оба ПЦР и КПЦР являются дорогостоящими и часто не легко доступны в условиях ограниченных ресурсов областей для рутинной работы.

Первоначально описанный Notomi 6, петля-опосредованной изотермические амплификации (LAMP) предлагает альтернативный метод амплификации ДНК. ЛАМПА использует Bst ДНК - полимеразы для синтеза ДНК замещения цепи вместе со специально разработанными наборов праймеров , которые распознают по меньшей мере , шесть независимых областей гена - мишени. Наиболее важным преимуществом является то, что ЛАМПА усиление происходит в изотермических условиях. Таким образом, только на водяной бане, нагревательный блок или инкубатор требуется. Этот метод был использован для обнаружения нескольких риккетсиозные патогены 7-9. Визуализация продуктов амплификации ДНК с помощью гель-электрофореза является наиболее точным методом, который может отличить истинные срабатываний от ложных срабатываний за счет неспецифической амплификации. Однако процедуры, связанные с гель-электрофореза не практичны для ограниченных ресурсов арEAS. Было разработано несколько альтернативных методов для обнаружения продуктов реакции. Эти альтернативные, такие как помутнение полученный из формации пирофосфат магния 10 или с использованием флуоресцентного красителя интеркалирования быть визуализированы под действием УФ - света 11,12 являются более благоприятными , чем при запуске геля. Лампа реагенты были стабильны в течение одного месяца при хранении при температуре 25 ° C и 37 ° C, которые являются температура окружающей среды в тропических и субтропических странах , где Q лихорадка является эндемическим 13.

Пробирного лампа была разработана в нашей лаборатории , чтобы обнаружить присутствие C. burnetii в образцах 14 плазмы. Здесь мы опишем простой протокол для приготовления реакционной смеси в количестве от ЛАМПА лиофилизированных реагентов. Лиофилизированные реагенты стабильны в течение одного месяца при хранении при комнатной температуре. В сочетании с легким методом визуализации, это идеальный способ , чтобы использовать для обнаружения C. burnetii в установлении ограниченных ресурсов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовить плазмидной ДНК разведений в качестве стандарта для LAMP-реакции

  1. С помощью спектрофотометра для измерения оптической плотности (OD) при 260 нм , чтобы определить плазмиду (содержащую гена - мишени IS1111a 493 С. burnetii RSA) концентрации ДНК. OD 260 1 приравнивает до 50 мкг / мкл ДНК.
  2. Преобразование количества плазмидной ДНК в количестве копий. Поскольку размер плазмиды составляет 6330 п.н., молекулярная масса этой плазмиды 4,1 х 10 6 г (6330 п.о. х 649 г / BP). Концентрацию ДНК плазмиды составляет 34,2 нг / мкл (как определено из шага 1.1). 1 мкл этого образца ДНК содержит 34,2 нг ДНК плазмиды, приравнивая к 5 × 10 9 копий (34,2 х 10 -9 г / 4,1 х 10 6 Gx 6,02 × 10 23) ДНК.
  3. Добавить 10 мкл ДНК плазмиды (5 × 10 9 копий / мкл) в 90 мкл воды в течение 10-кратного разведения , чтобы сделать образец ДНК из 5 х 10 8 копий / мкл,
  4. Повторите шаг 1.3 подготовить образцы ДНК 5 х 10 7, 5 × 10 6, 5 × 10 5, 5 × 10 4, 5 × 10 3, 5 х 10 2, 5 х 10 1, и 5 х 10 0 копий / мкл.

2. Подготовка шаблона ДНК из образцов для LAMP-реакции

  1. Выполните извлечение ДНК из образцов плазмы крови человека с использованием коммерческого набора ДНК мини в соответствии с протоколом производителя. Используйте в общей сложности 200 мкл образца для экстракции и элюции извлеченную ДНК в объеме 20 мкл.

3. Подготовьте 2x буфера ЛАМПА Реакция

  1. Смешайте 200 мкл 10 - кратного буфера для Pol, 320 мкл 5 М триметилглицина, 12 мкл 1 М MgSO 4, 280 мкл смеси дНТФ (10 мМ каждый) и 188 мкл воды , чтобы 1 мл буфера 2х лампы. Смешайте импульсно-встряхиванием в течение 10 сек.

4. Выполните стандартную лампу Реакция

  1. Смешайте 12,5 мкл 2x LAБуфер МП (как полученного на стадии 3, 40 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 20 мМ КСl, 16 мМ MgSO 4, 20 мМ (NH 4) 2 SO 4, 0,2% Тритон Х-100, 1,6 М триметилглицин, 1,4 мМ дНТФ смесь), 1,2 мкл смеси праймера, 1 мкл ДНК - полимеразы Bst (8 ед / мкл) и 5,3 мкл воды для приготовления реакционной смеси (20 мкл) в 0,2 мл ПЦР - пробирку.
  2. Добавьте 5 мкл ДНК (со стадии 1 или 2) в 20 мкл реакционной смеси и хорошо перемешать.
  3. Закрыть трубки и инкубировать при 60 ° С в течение 60 мин на водяной бане или нагревательном блоке. Это оптимальная температура реакции определяется ранее.
  4. Добавьте 5 мкл 10х гель загрузочного буфера для остановки реакции.
  5. Нагрузка 5 мкл продуктов реакции в агарозном геле 2%, окрашенном интеркаляции пятно нуклеиновой кислоты.
  6. Выполнить гель при 100 В в течение 35 мин в буфере 1x КЭ.
  7. Визуализируйте результаты от УФ-излучения.

5. Выполните ЛАМПЫ реакции с водостойкихРеагенты

  1. Смешайте 125 мкл 10 - кратного буфера для Pol 200 мкл 5 М триметилглицина, 7,5 мкл 1 М MgSO 4, 667,5 мкл воды , чтобы 1 мл восстанавливающий буфер. Смешайте импульсно-встряхиванием в течение 10 сек.
  2. Снимите трубки, которые содержат лиофилизированные реагенты из запечатанном пакете из алюминиевой фольги. Не следует использовать трубы, если мешок алюминиевой фольги не запечатан или если он поврежден.
  3. Добавьте 20 мкл восстанавливающий буфер в каждую пробирку, чтобы повторно приостанавливать лиофилизированные реагенты.
  4. Смешайте с помощью пипетки буфера вверх и вниз 5 раз. Посмотрите, чтобы убедиться, что лиофилизированные реагенты полностью ресуспендировали. Белый порошок должен исчезнуть в трубке.
  5. Добавьте 5 мкл ДНК-матрицы (от стадии 1 или 2) реконструированных реагентов и хорошо перемешать.
  6. Закрыть трубки и инкубировать при 60 ° С в течение 60 мин на водяной бане или нагревательном блоке.
  7. Добавьте 5 мкл 10х гель загрузочного буфера для остановки реакции.
  8. Нагрузка 5 мкл реакцииПродуктами агарозном геле 2%, окрашенном интеркаляции пятно нуклеиновой кислоты.
  9. Выполнить гель при 100 В в течение 35 мин в буфере 1x КЭ.
  10. Визуализируйте результаты от УФ-излучения.

6. Выполните ЛАМПЫ реакции с Воссоздание буфером, содержащим HNB или флуоресцентная интеркалирования Dye

  1. Смешайте 125 мкл 10х Pol буфера, 200 мкл 5 М триметилглицина, 7,5 мкл 1 М MgSO 4, 7,5 мкл 20 мМ HNB (или 12,5 мкл 100x флуоресцентного интеркалирующего красителя) и 660 мкл (или 655 мкл) , воды для составляют 1 мл восстанавливающей буфера. Смешайте импульсно-встряхиванием в течение 10 сек.
  2. Используйте водостойких буфер, приготовленный в разделе 6, чтобы повторить шаги 5.2 - 5.6.
  3. Визуализируйте результаты невооруженным глазом (реакционной смеси, содержащей HNB) или УФ-света (реакционной смеси, содержащей флуоресцентный краситель интеркалирования).

7. Выполнить в режиме реального времени ЛАМПЫ реакции с сканера Tube

  1. Добавьте 5 мкл ДНК к reconstitutе изд реагенты, содержащие флуоресцентный краситель интеркалирования, закройте трубку и вставить его к сканеру трубки.
  2. Заданная температура инкубации при 60 ° С. Измерение флуоресценции при длине волны 520 нм в течение 60 мин.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Лиофилизированные ЛАМПЫ реагенты внутри 0,2 мл трубки содержит Bst ДНК - полимеразы, праймеров и дНТФ. 20 мкл восстанавливающий буфер используется для повторной приостанавливают лиофилизированные реагенты. На рисунке 1 показаны результаты реакции лампа на ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Ранее мы разработали чувствительный и специфический анализ ЛАМПЫ таргетирования вставки элемента IS1111a 14. Элемент IS1111 был выбран потому , что он высоко консервативна среди различных штаммов C. burnetii и его высокое число копий ( от 7 до 110) в бактериях (Кли 2006). Наши результ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Военно-морской центр медицинских исследований, научно-исследовательское подразделение 6000.RAD1.J.A0310 работы. Мнения, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не обязательно отражают официальную политику или позицию Департамента военно-морского флота, Министерства обороны или правительства США. Вэй-Мэй Чинг является сотрудником правительства США. Эта работа была подготовлена ​​в рамках своих служебных обязанностей. Название 17 USC §105 предусматривает, что «Защита авторских прав в соответствии с этим названием не доступен для любой работы правительства Соединенных Штатов. Название 17 USC §101 определяет работу правительства США в качестве работы, подготовленный членом военной службы или сотрудником правительства США в рамках служебных обязанностей этого лица.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
LAMP primersEurofins MWG operon10 nmol, salt freeSequence designed by customer
Bst DNA polymeraseNew England BiolabsM0275L8 units/ml
10x Thermo pol bufferNew England BiolabsB9004S
dNTP mixtureNew England BiolabsN0447L10 mM each
BetaineSigma-AldrichB03005 M, Trimethylglycine
Magnesium SulfateSigma-AldrichM3409-1ML1 M
10x BluejuiceInvitrogen10816-015gel loading buffer
SYBR greenInvitrogenS758510,000x, visualize products in tubes
GelRedPhenix Research ProductsRGB-410310,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagentsGene Reach
Hydroxynaphthol blueFluka33936-10G
ESEQuant tube scannerQiagenreal-time detection

Ссылки

  1. Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
  2. Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
  3. Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
  4. Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
  5. Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
  6. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  7. Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
  8. Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
  9. Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
  10. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  11. Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
  12. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  13. Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
  14. Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
  15. Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

110LAMPCoxiella burnetiiQ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены