Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Riepilogo

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Abstract

Coxiella burnetii, l'agente che causa la febbre Q, è un batterio intracellulare obbligato. Saggi diagnostici basati sulla PCR sono stati sviluppati per la rilevazione C. DNA burnetii in colture cellulari e campioni clinici. PCR richiede attrezzature specializzate ed estesa formazione degli utenti finali, e quindi non è adatto per il lavoro di routine specialmente in una zona risorse limitate. Abbiamo sviluppato un saggio loop-mediata di amplificazione isotermica (LAMP) per rilevare la presenza di C. burnetii in campioni di pazienti. Questo metodo viene effettuata ad una sola temperatura di circa 60 ° C in un bagnomaria o riscaldamento. La sensibilità di questo test LAMP è molto simile a PCR con un limite di rilevazione di circa 25 copie per reazione. La relazione descrive la preparazione della reazione con reagenti liofilizzati e visualizzazione dei risultati usando blu di idrossinaftolo (HNB) o una lampada UV con colorante fluorescente intercalante nella reazione. I reagenti LAMP erano lyophilized e conservato a temperatura ambiente (RT) per un mese senza perdita di sensibilità di rilevazione. Questo test è particolarmente robusta LAMP perché la preparazione della miscela di reazione non comporta complessi passaggi. Questo metodo è ideale per l'utilizzo in ambienti con risorse limitate, dove la febbre Q è endemica.

Introduzione

Il piccolo batterio Gram-negativi Coxiella burnetii è l'agente eziologico della febbre Q, che è una zoonosi in tutto il mondo. A causa della distribuzione a livello mondiale di febbre Q e l'alta infettività di C. burnetii, militari e civili personale statunitense dispiegate all'estero sono a rischio di infezione nelle zone endemiche.

La febbre Q si manifesta in due forme: infezioni acute e croniche. Acuta febbre Q si presenta con sintomi simil-influenzali, l'epatite, o polmonite, ed è di solito una malattia autolimitante con un basso tasso di mortalità. Cronica febbre Q, mentre meno diffuso, si traduce spesso in endocardite, che ha un tasso di mortalità molto più alto se non trattata ^1,2. Pertanto, la diagnosi precoce per guidare un trattamento appropriato è fondamentale per la cura del paziente. Reazione a catena della polimerasi (PCR) e in tempo reale PCR quantitativa (qPCR) test sono stati sviluppati per la rilevazione C. DNA burnetii in colture cellulari e campioni clinici ^{3-5 <}/ Sup>. Sia PCR e qPCR sono costose e spesso non facilmente disponibili in aree con risorse limitate per il lavoro di routine.

Originariamente descritto da Notomi ^6, l'amplificazione isotermica loop-mediata (LAMP) offre un metodo alternativo amplificazione del DNA. LAMP utilizza polimerasi Bst DNA per la sintesi del DNA filone spostamento lungo con i set di primer appositamente progettati che riconoscono almeno sei regioni indipendenti del gene bersaglio. Il vantaggio più significativo di LAMP è che l'amplificazione avviene in condizioni isoterme. Pertanto, è necessario solo un bagno d'acqua, blocco di riscaldamento o di un incubatore. Questo metodo è stato utilizzato per rilevare diversi patogeni rickettsie ^7-9. Visualizzazione dei prodotti di DNA amplificati mediante elettroforesi su gel è il metodo più accurato che può differenziare i veri positivi da falsi positivi a causa di amplificazione non specifica. Tuttavia le procedure necessarie per elettroforesi su gel non sono pratici per ar risorse limitateEAS. Diversi metodi alternativi sono stati sviluppati per rilevare i prodotti di reazione. Queste alternative, come torbidità derivante dalla formazione di magnesio pirofosfato ¹⁰ o utilizzando un colorante intercalante fluorescente da visualizzare sotto luce UV ^11,12 sono più favorevoli di esecuzione di un gel. I reagenti LAMP erano stabile per un mese se conservato a 25 ° C e 37 ° C, che sono temperature ambientali nei paesi tropicali e sub-tropicali, dove la febbre Q è endemica ^13.

Un test LAMP stato sviluppato nel nostro laboratorio per rilevare la presenza di C. burnetii in campioni di plasma ^14. Qui si descrive un protocollo semplice per la preparazione della miscela di reazione LAMP dai reagenti liofilizzati. I reagenti liofilizzati sono stabili per un mese se conservati a RT. Quando combinato con un metodo di visualizzazione facile, questo è un metodo ideale da utilizzare per la rilevazione C. burnetii in un ambiente risorse limitate.

Protocollo

1. Preparare plasmidi DNA diluizioni come standard per LAMP Reazione

1. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica (OD) a 260 nm per determinare il plasmide (contenente gene target IS1111a di C. burnetii RSA 493) concentrazione di DNA. Un OD ₂₆₀ di 1 equivale a 50 mg / mL di DNA.
2. Convertire la quantità di DNA plasmide nel numero di copie. Poiché la dimensione del plasmide è 6.330 bp, il peso molecolare di questo plasmide è 4,1 x 10 ⁶ g (6.330 bp x 649 g / bp). La concentrazione di DNA del plasmide è 34,2 ng / ml (come determinato dal punto 1.1). 1 ml di questo campione di DNA contiene 34,2 ng di DNA plasmide, pari a 5 x 10 ⁹ copie (34,2 x 10 ^-9 g / 4,1 x 10 ⁶ gx 6,02 x 10 ²³⁾ di DNA.
3. Aggiungere 10 ml di DNA plasmidico (5 x 10 ⁹ copie / ml) a 90 ml di acqua per una diluizione di 10 volte per fare un campione di DNA di 5 x 10 ⁸ copie / ml.
4. Ripetere passaggio 1.3 per preparare campioni di DNA di 5 x 10 ^7, 5 x 10 ^6, 5 x 10 ^5, 5 x 10 ^4, 5 x 10 ^3, 5 x 10 ^2, 5 x 10 ¹ e 5 x 10 ⁰ copie / ul.

2. Preparare modello di DNA da campioni per la lampada di reazione

1. Eseguire l'estrazione del DNA da campioni di plasma umano utilizzando un kit mini DNA commerciale secondo il protocollo del produttore. Utilizzare un totale di 200 campioni microlitri per l'estrazione ed eluire DNA estratto in un volume di 20 ml.

3. Preparare 2x Buffer LAMP Reazione

1. Mescolare 200 ml di 10x Pol Buffer, 320 ml di 5 M trimetilglicina, 12 ml di 1 M MgSO _4, 280 ml ​​di miscela dNTP (10 mm ciascuno) e 188 microlitri di acqua per fare 1 ml di tampone 2x LAMP. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi.

4. Eseguire lampada standard di reazione

1. Mescolare 12,5 ml di 2x LATampone MP (come preparato al punto 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO _4, 20 mM (NH _{4) 2} SO _4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimetilglicina, 1.4 mM miscela dNTP), 1,2 ml di miscela di primer, 1 ml di polimerasi Bst DNA (8 U / ml), e 5,3 l di acqua per fare miscela di reazione (20 ml) in un tubo di 0,2 ml PCR.
2. Aggiungere 5 ml di DNA (dal punto 1 o 2) alla miscela di reazione di 20 microlitri e mescolare bene.
3. Chiudere tubo e incubare a 60 ° C per 60 minuti in un bagnomaria o riscaldamento. Questa è la temperatura di reazione ottimale determinata in precedenza.
4. Aggiungere 5 ml di 10x tampone di caricamento del gel di interrompere la reazione.
5. Carico 5 microlitri di prodotti di reazione di un gel di agarosio al 2% colorato con intercalanti macchia dell'acido nucleico.
6. Eseguire gel a 100 V per 35 min in tampone 1x TBE.
7. Visualizzare i risultati di raggi UV.

5. Eseguire Reazione lampada con ricostituitoreagenti

1. Mescolare 125 ml di 10x Pol Buffer, 200 ml di 5 M trimetilglicina, 7,5 ml di 1 M MgSO _4, 667.5 ml di acqua per fare 1 ml di tampone di ricostituzione. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi.
2. Rimuovere i tubi che contengono i reagenti liofilizzati dal sacchetto di alluminio sigillato. Non utilizzare i tubi se la borsa foglio di alluminio non è sigillato o se è danneggiato.
3. Aggiungere 20 ml di tampone di ricostituzione in ciascuna provetta per risospendere reagenti liofilizzati.
4. Mescolare pipettando tampone su e giù per 5 volte. Date un'occhiata per assicurarsi che i reagenti liofilizzati sono completamente ri-sospesi. La polvere bianca dovrebbe scomparire nel tubo.
5. Aggiungere 5 ml di DNA stampo (dal punto 1 o 2) per i reagenti ricostituiti e mescolare bene.
6. Chiudere tubo e incubare a 60 ° C per 60 minuti in un bagnomaria o riscaldamento.
7. Aggiungere 5 ml di 10x tampone di caricamento del gel di interrompere la reazione.
8. Carico 5 ml di reazioneprodotti ad un gel di agarosio al 2% colorato con intercalanti macchia dell'acido nucleico.
9. Eseguire gel a 100 V per 35 min in tampone 1x TBE.
10. Visualizzare i risultati di raggi UV.

6. Eseguire LAMP Reazione con tampone di ricostituzione contenenti HNB o fluorescente intercalante Dye

1. Mescolare 125 ml di 10x Pol Buffer, 200 ml di 5 M trimetilglicina, 7,5 ml di 1 M MgSO _4, 7,5 ml di 20 mm HNB (o 12,5 ml di 100x fluorescente intercalante colorante) e 660 ml (o 655 ml) di acqua a fare 1 ml di tampone di ricostituzione. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi.
2. Utilizzare il buffer ricostituito preparato nella sezione 6 di ripetere i passi 5.2 - 5.6.
3. Visualizzare i risultati ad occhio nudo (reazione contenente HNB) o una luce UV (reazione contenente colorante intercalante fluorescente).

7. Eseguire in tempo reale reazione lampada con tubo Scanner

1. Aggiungere 5 microlitri DNA alla reconstitutreagenti ED contenenti colorante fluorescente intercalante, chiudere il tubo e inserirlo allo scanner tubo.
2. Impostare temperatura di incubazione a 60 ° C. Misurare la fluorescenza a 520 nm per 60 min.

Risultati

I reagenti LAMP liofilizzati all'interno del tubo 0,2 ml contiene polimerasi Bst DNA, primer, e dNTP. 20 microlitri di tampone di ricostituzione è usato per risospendere i reagenti liofilizzati. La Figura 1 mostra i risultati di reazione LAMP su gel di agarosio con reagenti appena preparati e reagenti liofilizzati. Il reagente liofilizzato non riduce la sua attività. Reazioni LAMP preparati da entrambi i reagenti in grado di rilevare 25 copie del DNA stamp...

Discussione

In precedenza, abbiamo sviluppato un saggio LAMP sensibile e specifico mira l'elemento di inserimento IS1111a ^14. L'elemento IS1111 è stato scelto perché è altamente conservata tra i diversi ceppi di C. burnetii e il suo alto numero di copie (7-110) nei batteri (Klee 2006). I nostri risultati hanno mostrato che LAMP può rilevare circa 25 copie dell'elemento IS1111, che può correlare il meno una copia cromosomale di Coxiella DNA. In questo studio, p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP primers	Eurofins MWG operon	10 nmol, salt free	Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase	New England Biolabs	M0275L	8 units/ml
10x Thermo pol buffer	New England Biolabs	B9004S
dNTP mixture	New England Biolabs	N0447L	10 mM each
Betaine	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	gel loading buffer
SYBR green	Invitrogen	S7585	10,000x, visualize products in tubes
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents	Gene Reach
Hydroxynaphthol blue	Fluka	33936-10G
ESEQuant tube scanner	Qiagen		real-time detection