Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Zusammenfassung

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Zusammenfassung

Coxiella burnetii, der Agent Q - Fieber verursacht, ist ein obligat intrazelluläres Bakterium. PCR - basierten diagnostischen Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinischen Proben. PCR erfordert spezielle Ausrüstung und umfassende Schulung von Endanwendern, und daher ist es für Routinearbeiten vor allem in einem ressourcenbeschränkte Bereich nicht geeignet. Wir haben eine loop-vermittelte isothermische Amplifikation (LAMP) Assay entwickelt , um die Anwesenheit von C. nachzuweisen burnetii in Patientenproben. Dieses Verfahren wird bei einer einzigen Temperatur etwa 60 ° C in einem Wasserbad oder Heizblock durchgeführt. Die Empfindlichkeit dieses LAMP-Test ist sehr ähnlich wie PCR mit einer Nachweisgrenze von etwa 25 Kopien pro Reaktion. Dieser Bericht beschreibt die Herstellung der Reaktion lyophilisierten Reagenzien und Visualisierung der Ergebnisse mit hydroxynaphthol blau (HNB) oder einer UV-Lampe mit fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff in der Reaktion verwendet wird. Die LAMP-Reagenzien waren lyophilized und bei Raumtemperatur (RT) einen Monat lang ohne Verlust der Detektionsempfindlichkeit gespeichert. Diese LAMP-Test ist besonders robust, da die Reaktionsgemischaufbereitung nicht komplexe Schritte beinhaltet. Diese Methode ist ideal für den Einsatz in begrenzten Ressource-Einstellungen, wo Q-Fieber endemisch ist.

Einleitung

Die kleine Gram-negative Bakterium Coxiella burnetii ist der Erreger des Q - Fiebers, das ein weltweit Zoonose ist. Durch den weltweiten Vertrieb von Q - Fieber und die hohe Infektiosität von C. burnetii, US - Militär- und Zivilpersonal im Ausland im Einsatz sind in Gefahr, in den Endemiegebieten infiziert.

Q-Fieber manifestiert sich in zwei Formen: akute und chronische Infektionen. Akute Q-Fieber präsentiert sich mit grippeähnlichen Symptomen, Hepatitis oder Pneumonie, und ist in der Regel eine selbstlimitierend Krankheit mit einer niedrigen Sterblichkeit. Chronische Q-Fieber, während weniger verbreitet, führt oft zu Endokarditis, die eine viel höhere Mortalitätsrate hat , wenn ^1,2 unbehandelt. Daher ist eine frühzeitige Diagnose führen eine geeignete Behandlung für die Patientenversorgung kritisch ist. Polymerase - Kettenreaktion (PCR) und quantitative Echtzeit - PCR (qPCR) Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinische Proben ^{3-5 <}/ Sup>. Beide PCR und qPCR sind teuer und oft nicht ohne weiteres verfügbar in ressourcenbeschränkte Bereiche für die Routinearbeit.

Ursprünglich von Notomi ⁶ beschrieben, Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) bietet eine alternative DNA - Verstärkungsverfahren. LAMP verwendet Bst DNA - Polymerase zusammen mit speziell entwickelten Primer - Sets Verschiebung DNA Synthese Strang, der mindestens sechs unabhängigen Regionen des Zielgens zu erkennen. Der signifikanteste Vorteil ist, dass LAMP-Amplifikation unter isothermischen Bedingungen auftritt. Daher ist nur ein Wasserbad, Heizblock oder ein Inkubator ist nicht erforderlich. Dieses Verfahren wurde verwendet ^7-9 verschiedene rickettsial Pathogene zu erkennen. Visualisierung von amplifizierte DNA-Produkte durch Gelelektrophorese ist die genaueste Methode, die wahren Positiven von Fehlalarme aufgrund unspezifischer Amplifikation unterscheiden kann. Jedoch sind die in der Gelelektrophorese angewandten Verfahren nicht praktikabel für begrenzten Ressource-areas. Es wurden verschiedene alternative Verfahren entwickelt, um die Reaktionsprodukte zu detektieren. Diese alternativen, wie Trübung , abgeleitet von Magnesiumpyrophosphat Formation ¹⁰ oder unter Verwendung eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff unter UV - Licht visualisiert werden ^11,12 sind günstiger als ein Gel läuft. Die LAMP - Reagenzien waren einen Monat lang stabil , wenn sie bei 25 ° C und 37 ° C gelagert, die sind Umgebungstemperaturen in tropischen und subtropischen Ländern , in denen Q - Fieber endemisch ¹³ ist.

Ein LAMP - Assay wurde in unserem Labor entwickelt , um das Vorhandensein von C. zu erkennen burnetii in Plasmaproben ^14. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Herstellung der LAMP Reaktionsmischung aus dem lyophilisierten Reagenzien. Die lyophilisierten Reagenzien sind stabil für einen Monat, wenn bei RT gelagert. Wenn sie mit einem einfachen Visualisierungsverfahren kombiniert werden , ist dies eine ideale Methode zum Nachweis C. verwenden burnetii in einer begrenzten Ressource-Einstellung.

Protokoll

1. Bereiten Sie Plasmid-DNA Verdünnungen als Standard für den LAMP-Reaktion

1. Verwenden eines Spektrophotometers die optische Dichte (OD) bei 260 nm zu messen , um das Plasmid (enthaltend Zielgen IS1111a von C. burnetii RSA 493) DNA - Konzentration zu bestimmen. Eine OD ₂₆₀ von 1 entspricht 50 ug / ul DNA.
2. Konvertieren Sie die Menge von Plasmid-DNA in die Kopienzahl. Da die Größe des Plasmids 6330 bp ist, ist das Molekulargewicht dieses Plasmids 4,1 x 10 ⁶ g (6.330 bp x 649 g / bp). Die DNA-Konzentration des Plasmids ist 34,2 ng / & mgr; l (wie in Schritt bestimmt 1.1). 1 & mgr; l dieser DNA - Probe enthält 34,2 ng Plasmid - DNA, zu gleich 5 x 10 ⁹ Kopien (34,2 x 10 ^-9 g / 4,1 x 10 ⁶ 6,02 x 10 gx ²³⁾ von DNA.
3. Zugabe von 10 & mgr; l Plasmid - DNA (5 x 10 ⁹ Kopien / ul) und 90 ul Wasser für eine 10-fache Verdünnung einer DNA - Probe von 5 x 10 ⁸ Kopien zu erstellen / ul.
4. Wiederholen Sie Schritt 1.3 zur Herstellung von DNA - Proben von 5 x 10 ^7, 5 x 10 ^6, 5 x 10 ^5, 5 x 10 ^4, 5 × 10 ^3, 5 x 10 ^2, 5 x 10 ¹ und 5 x 10 ⁰ Kopien / ul.

2. Bereiten Sie DNA-Vorlage von Proben für die LAMP-Reaktion

1. Führen DNA Extraktion aus Humanplasmaproben Kommerzielle DNA Mini Kit nach Herstellerprotokoll. Verwenden Sie eine Gesamtmenge von 200 ul Probe für die Extraktion und Elution extrahierten DNA in einem 20 & mgr; l Volumen.

3. Bereiten Sie 2x LAMP-Reaktionspuffer

1. Mischen Sie 200 ul 10x Pol Buffer, 320 ul 5 M Trimethylglycin, 12 ul 1 M MgSO _4, 280 & mgr; l dNTP - Gemisch (jeweils 10 mM) und 188 ul Wasser zur Herstellung von 1 ml 2x LAMP - Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden.

4. Führen Sie Standard-LAMP-Reaktion

1. Mix 12,5 ul 2x LAMP - Puffer (wie in Schritt 3 hergestellt; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO _4, 20 mM (NH _{4) 2} SO _4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M Trimethylglycin, 1.4 mM dNTP - Gemisch), 1,2 & mgr; l Primer - Mix, 1 & mgr; l Bst DNA - Polymerase (8 U / ul) und 5,3 ul Wasser Reaktionsmischung (20 ul) in einem 0,2 ml PCR - Röhrchen zu bilden.
2. Zugabe von 5 & mgr; l DNA (aus Schritt 1 oder 2) in die 20 & mgr; l Reaktionsgemisch und gut mischen.
3. Schließen Rohr und für 60 min in einem Wasserbad oder Heizblock bei 60 ° C inkubiert. Dies ist die optimale Reaktionstemperatur zuvor bestimmt.
4. In 5 ul 10x Gelladepuffer, um die Reaktion zu beenden.
5. Last 5 & mgr; l Reaktionsprodukte zu einem 2% Agarosegel, gefärbt mit stain Nukleinsäure interkalierende.
6. Führen Gel bei 100 V für 35 min in 1x TBE-Puffer.
7. Visualisieren Sie die Ergebnisse durch UV-Licht.

5. Führen Sie LAMP Reaktion mit RekonstituiertesReagenzien

1. Mischen Sie 125 ul von 10x Pol Puffer, 200 & mgr; l von 5 M Trimethylglycin, 7,5 ul 1 M MgSO _4, 667,5 ul Wasser zur Herstellung von 1 ml Rekonstitution Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden.
2. Entfernen Sie Rohre, die die lyophilisierten Reagenzien aus dem versiegelten Aluminiumfolienbeutel enthalten. Sie nicht die Rohre verwenden, wenn die Aluminiumfolienbeutel nicht abgedichtet ist, oder wenn es beschädigt ist.
3. In 20 ul Rekonstitution Puffer in jedes Röhrchen lyophilisierten Reagenzien erneut zu suspendieren.
4. Mischen durch Pipettieren Puffer nach oben und unten 5-mal. Werfen Sie einen Blick um sicherzustellen, dass die lyophilisierten Reagenzien komplett neu aufgehängt sind. Das weiße Pulver sollte in der Röhre verschwinden.
5. In 5 ul DNA-Template (aus Schritt 1 oder 2) zu den rekonstituierten Reagenzien und gut mischen.
6. Schließen Rohr und für 60 min in einem Wasserbad oder Heizblock bei 60 ° C inkubiert.
7. In 5 ul 10x Gelladepuffer, um die Reaktion zu beenden.
8. Last 5 ul ReaktionsProdukte einem 2% Agarosegel, gefärbt mit Nukleinsäure interkalierende stain.
9. Führen Gel bei 100 V für 35 min in 1x TBE-Puffer.
10. Visualisieren Sie die Ergebnisse durch UV-Licht.

6. Führen Sie LAMP Reaktion mit Rekonstitution Puffer, der HNB oder Fluorescent interkalierende Farbstoff

1. Mischungs 125 ul 10fach Pol Puffer, 200 & mgr; l von 5 M Trimethylglycin, 7,5 ul 1 M MgSO _4, 7,5 ul 20 mM HNB (oder 12,5 & mgr; l 100x fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff) und 660 ul (oder 655 & mgr; l) Wasser machen 1 ml Rekonstitution Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden.
2. Verwenden Sie das aufgelöste Puffer in Abschnitt 6 hergestellt, die Schritte 5.2 zu wiederholen - 5.6.
3. Visualisieren Sie die Ergebnisse mit dem bloßen Auge (Reaktion, die HNB) oder einem UV-Licht (Reaktion fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff enthält).

Führen 7. Echtzeit-LAMP-Reaktion mit Rohr Scanner

1. In 5 ul DNA an die reconstituted Reagenzien fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff, in der Nähe Rohr und legen Sie es auf das Rohr Scanner enthält.
2. Eingestellt Inkubationstemperatur auf 60 ° C. Messen der Fluoreszenz bei 520 nm für 60 min.

Ergebnisse

Die lyophilisierten LAMP Reagenzien innerhalb der 0,2 - ml - Röhrchen enthält Bst DNA - Polymerase, Primer und dNTPs. 20 ul Rekonstitution Puffer wird verwendet , die lyophilisierten Reagenzien erneut zu suspendieren. Abbildung 1 zeigt die LAMP Reaktion führt auf Agarosegelen mit frisch zubereiteten Reagenzien und gefriergetrocknet Reagenzien. Das gefriergetrocknete Reagenz verringert nicht seine Aktivität. LAMP Reaktionen von beiden Reagenzien hergestellt w...

Diskussion

Bisher haben wir eine empfindliche und spezifische LAMP - Targeting - Assay das Einsatzelement IS1111a ^14. Das IS1111 Element wurde ausgewählt , weil es stark unter den verschiedenen Stämmen von C. konserviert burnetii und die hohe Anzahl der Kopien (7-110) in den Bakterien (Klee 2006). Unsere Ergebnisse zeigten , dass LAMP können etwa 25 Kopien des IS1111 Element erkennen, die so wenig wie eine chromosomale Kopie von Coxiella DNA korrelieren. In dieser...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP primers	Eurofins MWG operon	10 nmol, salt free	Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase	New England Biolabs	M0275L	8 units/ml
10x Thermo pol buffer	New England Biolabs	B9004S
dNTP mixture	New England Biolabs	N0447L	10 mM each
Betaine	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	gel loading buffer
SYBR green	Invitrogen	S7585	10,000x, visualize products in tubes
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents	Gene Reach
Hydroxynaphthol blue	Fluka	33936-10G
ESEQuant tube scanner	Qiagen		real-time detection