El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; Coxiella burnetii</em

Resumen

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Resumen

Coxiella burnetii, el agente que causa la fiebre Q, es una bacteria intracelular obligado. Ensayos de diagnóstico basado en la PCR se han desarrollado para la detección de C. ADN burnetii en cultivos celulares y muestras clínicas. PCR requiere un equipo especializado y una amplia formación de usuario final, y por lo tanto, no es adecuado para el trabajo de rutina especialmente en un área de recursos limitados. Hemos desarrollado un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para detectar la presencia de C. burnetii en muestras de pacientes. Este método se realiza a una única temperatura de alrededor de 60 ° C en un baño de agua o un bloque de calentamiento. La sensibilidad de este ensayo LAMP es muy similar a la PCR con un límite de detección de aproximadamente 25 copias por reacción. Este informe describe la preparación de la reacción usando reactivos liofilizados y visualización de los resultados utilizando azul de hidroxinaftol (HNB) o una lámpara de UV con colorante intercalante fluorescente en la reacción. Los reactivos de LAMP fueron lyophilizeta y se almacena a temperatura ambiente (RT) durante un mes, sin pérdida de sensibilidad de detección. Este ensayo LAMP es particularmente robusto porque la preparación de la mezcla de reacción no implica pasos complejos. Este método es ideal para su uso en entornos con recursos limitados donde la fiebre Q es endémica.

Introducción

La pequeña bacteria Gram-negativa Coxiella burnetii es el agente causante de la fiebre Q, que es una zoonosis en todo el mundo. Debido a la distribución mundial de la fiebre Q y la alta infectividad de C. burnetii, personal militar y civil de Estados Unidos desplegadas en el extranjero están en riesgo de ser infectados en las áreas endémicas.

La fiebre Q se manifiesta en dos formas: infecciones agudas y crónicas. La fiebre Q aguda se presenta con síntomas similares a la gripe, hepatitis, o la neumonía, y suele ser una enfermedad autolimitada con una baja tasa de mortalidad. Q-fiebre crónica, mientras que menos frecuente, a menudo resulta en endocarditis, que tiene una tasa de mortalidad mucho más alta si se deja sin tratamiento ^1,2. Por lo tanto, el diagnóstico precoz para guiar un tratamiento adecuado es fundamental para el cuidado del paciente. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se han desarrollado ensayos para la detección de C. ADN burnetii en cultivos celulares y muestras clínicas ^{3-5 <}/ Sup>. Tanto PCR y qPCR son costosos ya menudo no es fácilmente disponible en las zonas con recursos limitados para el trabajo de rutina.

Originalmente descrito por Notomi ^6, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) ofrece un método de amplificación de ADN alternativo. Lámpara utiliza ADN polimerasa Bst para la síntesis de ADN de desplazamiento de cadena junto con conjuntos de cebadores especialmente diseñados que reconocen al menos seis regiones independientes del gen diana. La ventaja más significativa de LAMP es que la amplificación se produce en condiciones isotérmicas. Por lo tanto, sólo se requiere un baño de agua, calentador o una incubadora. Este método ha sido utilizado para detectar varios patógenos rickettsias ^7-9. La visualización de los productos de ADN amplificados por electroforesis en gel es el método más preciso que puede diferenciar verdaderos positivos de falsos positivos debido a la amplificación no específica. Sin embargo, los procedimientos involucrados en la electroforesis en gel no son prácticos para ar de recursos limitadosEAS. Varios métodos alternativos han sido desarrollados para detectar los productos de reacción. Estos alternativa, como turbidez derivado de la formación de pirofosfato de magnesio ¹⁰ o el uso de un colorante intercalante fluorescente para ser visualizado con luz UV ^11,12 son más favorables que la ejecución de un gel. Los reactivos de LAMP fueron estables durante un mes cuando se almacenaron a 25 ° C y 37 ° C, que son las temperaturas ambiente en los países tropicales y subtropicales donde la fiebre Q es endémica ^13.

Un ensayo de lámpara fue desarrollado en nuestro laboratorio para detectar la presencia de C. burnetii en muestras de plasma ^14. Aquí se describe un protocolo sencillo para la preparación de la mezcla de reacción LAMP a partir de los reactivos liofilizados. Los reactivos liofilizados son estables durante un mes cuando se almacena a temperatura ambiente. Cuando se combina con un método de visualización fácil, esto es un método ideal para usar para la detección de C. burnetii en un entorno de recursos limitados.

Protocolo

1. Preparar diluciones de ADN plásmido como estándar para la reacción LAMP

1. Use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica (DO) a 260 nm para determinar el plásmido (que contiene IS1111a gen diana de C. burnetii RSA 493) la concentración de ADN. Un OD ₂₆₀ de 1 equivale a 50 g / l de ADN.
2. Convertir la cantidad de ADN plásmido en el número de copias. Dado que el tamaño del plásmido es 6330 pb, el peso molecular de este plásmido es 4,1 x 10 ⁶ g (6.330 pb x 649 g / bp). La concentración de ADN del plásmido es 34,2 ng / l (como se determina a partir del paso 1.1). 1 l de esta muestra de ADN contiene 34,2 ng de ADN plásmido, lo que equivale a 5 x 10 ⁹ copias (34,2 x 10 ^-9 g / 4,1 x 10 ⁶ gx 6,02 x 10 ²³⁾ de ADN.
3. Añadir 10 l de ADN plásmido (5 x 10 ⁹ copias / l) a 90 l de agua para una dilución de 10 veces para hacer una muestra de ADN de 5 x 10 ⁸ copias / l.
4. Repita el paso 1.3 para preparar muestras de ADN de 5 x 10 ^7, 5 x 10 ^6, 5 x 10 ^5, 5 x 10 ^4, 5 x 10 ^3, 5 x 10 ^2, 5 x 10 ^1, y 5 x 10 ⁰ copias / l.

2. Prepare la plantilla de ADN de muestras para la reacción LAMP

1. Extraer ADN de muestras de plasma humano usando un kit Mini comercial de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Use un total de 200 muestras l para la extracción y eluir el ADN extraído en un volumen de 20 l.

3. Preparar 2x tampón de reacción LAMP se

1. Mezclar 200 l de 10x tampón de Pol, 320 l de 5 M trimetilglicina, 12 l de 1 M MgSO _4, 280 l de mezcla de dNTP (10 mM cada uno) y 188 l de agua para hacer 1 ml de tampón 2x LAMP. Mezcle en un vórtex durante 10 s.

4. Realizar la lámpara estándar de Reacción

1. Mezclar 12,5 l de 2x LATampón MP (tal como se preparó en el paso 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), KCl 20 mM, 16 mM _MgSO4, 20 mM (NH _{4) 2} SO _4, 0,2% de Triton X-100, trimetilglicina 1,6 M, 1,4 mM mezcla dNTP), 1,2 l de mezcla de cebador, 1 l de ADN polimerasa Bst (8 U / l), y 5,3 l de agua para hacer la mezcla de reacción (20 l) en un tubo de PCR de 0,2 ml.
2. Añadir 5 l de ADN (del paso 1 o 2) a la mezcla de reacción de 20 l y mezclar bien.
3. Cerrar el tubo e incubar a 60 ° C durante 60 minutos en un baño de agua o bloque de calentamiento. Esta es la temperatura óptima de reacción previamente determinada.
4. Añadir 5 l de 10x tampón de carga de gel para terminar la reacción.
5. Cargar 5 l de productos de reacción en un gel de agarosa al 2% teñido con intercalantes colorante de ácidos nucleicos.
6. gel a 100 V correr durante 35 minutos en tampón 1x TBE.
7. Visualizar los resultados por la luz UV.

5. Realizar reacción LAMP con reconstituidoreactivos

1. Mezclar 125 l de 10x tampón, Pol 200 l de 5 M trimetilglicina, 7,5 l de 1 M MgSO _4, 667,5 l de agua para hacer 1 ml de tampón de reconstitución. Mezcle en un vórtex durante 10 s.
2. Retire los tubos que contienen los reactivos liofilizados de la bolsa de papel de aluminio sellado. No utilizar los tubos si la bolsa de papel de aluminio no está cerrado o si está dañado.
3. Añadir 20 l de tampón de reconstitución en cada tubo para resuspender los reactivos liofilizados.
4. Mezclar pipeteando arriba y abajo de tampón 5 veces. Echar un vistazo para asegurarse de que los reactivos liofilizados están completamente re-suspendido. El polvo blanco debe desaparecer en el tubo.
5. Añadir 5 l de molde de ADN (de la etapa 1 o 2) a los reactivos reconstituidos y mezclar bien.
6. Cerrar el tubo e incubar a 60 ° C durante 60 minutos en un baño de agua o bloque de calentamiento.
7. Añadir 5 l de 10x tampón de carga de gel para terminar la reacción.
8. De carga 5 l de reacciónproductos a un gel de agarosa al 2% teñido con intercalantes colorante de ácidos nucleicos.
9. gel a 100 V correr durante 35 minutos en tampón 1x TBE.
10. Visualizar los resultados por la luz UV.

6. Realizar LAMP reacción con tampón de reconstitución que contiene HNB fluorescente o colorante intercalante

1. Mezclar 125 l de 10x de Pol Buffer, 200 l de 5 M trimetilglicina, 7,5 l de 1 M MgSO _4, 7,5 l de HNB 20 mM (o 12,5 l de 100x colorante fluorescente de intercalación) y 660 l (o 655 l) de agua a hacer 1 ml de tampón de reconstitución. Mezcle en un vórtex durante 10 s.
2. Utilice el tampón reconstituido preparado en la sección 6 para repetir los pasos 5.2 - 5.6.
3. Visualizar los resultados por el ojo desnudo (de reacción que contiene HNB) o una luz UV (de reacción que contiene el colorante intercalante fluorescente).

7. Realizar reacción LAMP en tiempo real con escáner Tubo

1. Añadir 5 l de ADN para la reconstituted reactivos que contienen colorante intercalante fluorescente, cerca del tubo y la inserta en el escáner de tubo.
2. Ajuste la temperatura de incubación a 60 ° C. Medir la fluorescencia a 520 nm durante 60 min.

Resultados

Los reactivos liofilizados de LAMP en el interior del tubo de 0,2 ml contiene ADN polimerasa Bst, cebadores y dNTPs. 20 l de tampón de reconstitución se utiliza para volver a suspender los reactivos liofilizados. La figura 1 muestra los resultados de la reacción de lámpara en geles de agarosa con reactivos recién preparados y reactivos liofilizados. El reactivo liofilizado no reduce su actividad. LAMP reacciones preparados por ambos reactivos puede detectar...

Discusión

Anteriormente, hemos desarrollado un ensayo de lámpara sensible y específico de orientación del elemento de inserción ¹⁴ IS1111a. El elemento IS1111 fue seleccionado porque es muy conservadas entre las diferentes cepas de C. burnetii y su alto número de copias (7-110) en la bacteria (Klee 2006). Nuestros resultados muestran que la lámpara puede detectar aproximadamente 25 copias del elemento IS1111, que puede correlacionarse con tan poco como una copia cromosómica de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP primers	Eurofins MWG operon	10 nmol, salt free	Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase	New England Biolabs	M0275L	8 units/ml
10x Thermo pol buffer	New England Biolabs	B9004S
dNTP mixture	New England Biolabs	N0447L	10 mM each
Betaine	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	gel loading buffer
SYBR green	Invitrogen	S7585	10,000x, visualize products in tubes
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents	Gene Reach
Hydroxynaphthol blue	Fluka	33936-10G
ESEQuant tube scanner	Qiagen		real-time detection