tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Özet

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Özet

Coxiella burnetii, Q ateşi etkenidir, zorunlu hücre içi bakteridir. PCR bazlı teşhis deneyleri C saptanması için geliştirilmiştir Hücre kültürleri ve klinik örneklerde burnetii'nin DNA. PCR özel ekipman ve kapsamlı son kullanıcı eğitimi gerektirir ve bu nedenle, özellikle kaynak kısıtlı bir alanda rutin işleri için uygun değildir. Bunun C varlığını tespit etmek için bir döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) deneyi geliştirdik hasta numunelerinde burnetti. Bu yöntem, bir su banyosu ya da ısıtma bloğu 60 ° C civarında tek bir sıcaklıkta gerçekleştirilir. Bu lamba tahlilin duyarlılığı reaksiyon başına yaklaşık 25 kopya, algılama sınırı ile PCR için çok benzer. Bu rapor, liyofilize reaktifler ve hydroxynaphthol mavisi (HNB) veya reaksiyon floresan interkalasyon boya ile UV lambası kullanılarak sonuçlar görselleştirmelerine reaksiyon hazırlanmasını tarif etmektedir. LAMP reaktifler lyophili edildized ve algılama hassasiyeti kaybı olmadan bir ay süreyle oda sıcaklığında (RT) saklandı. Reaksiyon karışımı hazırlama karmaşık adımlar içermez, çünkü bu lamba deneyi özellikle sağlamdır. Bu yöntem, Q humması endemik kaynak sınırlı ortamlarda kullanım için idealdir.

Giriş

Küçük Gram-negatif bakteri Coxiella burnetii dünya çapında bir zoonoz olan Q humması etkeni olduğunu. Nedeniyle Q Ateşi dünya çapında dağıtım ve C yüksek bulaşıcılıklarına burnetii, denizaşırı dağıtılan ABD askeri ve sivil personel endemik bölgelerde enfekte olma riski vardır.

akut ve kronik enfeksiyonların: Q humması iki şekilde tezahür eder. Akut Q-humması grip benzeri semptomlar, hepatit, pnömoni veya ile kendini göstermektedir ve genellikle düşük mortalite oranı kendini sınırlayan bir hastalıktır. Kronik Q-humması, daha az yaygın olmakla birlikte, genellikle ^1,2 tedavi edilmediği takdirde çok daha yüksek bir ölüm oranına sahip endokardit ile sonuçlanır. Bu nedenle erken tanı uygun bir tedavi hasta bakımı için önemlidir rehberlik. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) analizleri C saptanması için geliştirilmiştir hücre kültürleri ve klinik örneklerde ^{3-5 burnetii DNA/ Sup>. PCR ve qPCR Hem masraflı ve rutin işleri için kaynak kısıtlı alanlarda genellikle hazır değildir.}

Başlangıçta Notomi ⁶ tarafından açıklanan döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) alternatif bir DNA çoğaltma yöntemi sunuyor. LAMBA hedef genin en az altı bağımsız bölgeleri tanıyan özel olarak tasarlanmış primer kümeleri ile birlikte sarmal yer değiştirme DNA sentezi için Bst DNA polimerazı kullanır. LAMP en önemli avantajı, amplifikasyon izotermal şartlar altında gerçekleşmesidir. Bu nedenle, yalnızca su banyosu ısıtma bloğu ya da bir inkübatör gereklidir. Bu yöntem, birkaç riketsiyal patojenleri ^7-9 algılamak için kullanılır olmuştur. jel elektroforezi ile yükseltilmiş DNA ürünleri Görselleştirme nedeniyle nonspesifik amplifikasyon yanlış pozitif gelen gerçek pozitifler ayırt edebilirsiniz en doğru yöntemdir. Ancak jel elektroforezinde ilgili prosedürler kaynakları sınırlı ar için pratik değildirEAS. Birkaç alternatif yöntemler tepkime ürünlerini tespit etmek için geliştirilmiştir. Magnezyum pirofosfat oluşumu ¹⁰ veya floresan interkalasyon boya kullanılarak elde edilen bulanıklık UV ışığı ^11,12 altında görüntülendi edilecek gibi bu alternatif, bir jel çalışan daha elverişli. Q humması endemik ¹³ olduğu tropikal ve alt tropikal ülkelerde ortam sıcaklığı olan 25 ° C ve 37 ° C'de saklandığında LAMP reaktifleri bir ay boyunca stabil idi.

Bir lamba deneyi C varlığını tespit etmek için laboratuvarda geliştirilmiştir Plazma örneklerinde ¹⁴ burnetti. Burada liyofilize reaktifler lamba Reaksiyon karışımının hazırlanması için bir protokol açıklamaktadır. Oda sıcaklığında muhafaza edildiğinde liyofilize reaktif bir ay boyunca stabildir. Kolay bir görselleştirme yöntemi ile kombine edildiğinde, bu C tespit için kullanılacak ideal bir yöntemdir Bir kaynak sınırlı bir ortamda burnetti.

Protokol

1. LAMBA Reaksiyon Standardı olarak plazmid DNA dilüsyonları hazırlayın

1. DNA konsantrasyonu plazma (C burnetii RSA 493 ihtiva eden hedef gen IS1111a) belirlenmesi için, 260 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçmek için bir spektrofotometre kullanarak. 1 OD ₂₆₀ DNA 50 ug / ul eşittir.
2. kopya sayısında plazmit DNA miktarını dönüştürün. Plazmid büyüklüğü 6330 bp olduğu için, bu plazmid moleküler ağırlığı 4.1 x 10 ⁶ g (6.330 bp'lik bir X 649 g / BP) 'dir. (Adım 1.1 belirlenir) plazmidinin DNA konsantrasyonu 34.2 ng / ml. Bu DNA, örnek 1 ul DNA, 5 x 10 ⁹ kopya (34.2 x 10 ^-9 g / 4.1 x 10 ⁶ gx 6.02 x 10 ²³⁾ denk, plasmid DNA 34.2 ng içerir.
3. 5 x 10 ⁸ kopya DNA örneği yapmak için bir 10-kat seyreltme için su 90 ul plasmid DNA (5 x 10 ⁹ kopya / ml) 10 ul ekle / ml.
4. Tekrar adım 1.3, 5 x 10 ⁷ DNA numuneleri hazırlamak için 5 x 10 ^6, 5 x 10 ^5, 5 x 10 ^4, 5 x 10 ^3, 5 x 10 ^2, 5 x 10 ¹ ve 5 x 10 ⁰ kopya / ul.

2. LAMBA Reaksiyon için Örneklerden DNA şablonu hazırlayın

1. imalatçının protokolüne göre, ticari bir DNA mini kiti kullanılarak insan plazma örneklerinden DNA izolasyonu. çıkarılması için 200 ul örnek bir toplam kullanım ve 20 ul hacim içinde ekstre DNA Zehir.

3. 2x LAMP reaksiyonu tamponu hazırlayın

1. 10x Pol tampon 200 ul, 5 M Trimethylglycine 320 ul, E MgSO _4, dNTP karışımı 280 ul (10 mm) ve suyun 188 ul 2x LAMBASI 1 ml tampon olmak için 1 12 ul karıştırın. 10 saniye boyunca darbe vorteks ile karıştırın.

4. Standart LAMBA Reaksiyonu gerçekleştirin

1. 2x LA 12.5 ul karıştırınAşama 3'te hazırlanan MP tamponu (40 mM Tris-HCI (pH 8.8), 20 mM KCI, 16 mM MgSO _4, 20 mM _{(NH4) 2 SO4,%} 0.2 Triton X-100, 1.6 M Trimethylglycine, 1.4 mM dNTP karışımı), primer karışımının 1.2 ul, Bst DNA polimerazı (8 U / ul) 1 ul ve 0.2 ml PCR tüpü içinde, reaksiyon karışımı (20 ul) yapmak için su 5.3 ul.
2. 20 ul reaksiyon karışımına 5 (aşama 1 ya da 2) DNA ul ekleyin ve iyice karıştırın.
3. Yakın boru ve bir su banyosu ya da ısıtma bloğu içinde 60 dakika süre ile, 60 ° C'de inkübe edin. Bu önceden belirlenmiş optimal reaksiyon sıcaklığıdır.
4. Tepkimeyi sonlandırmak için 10x, jel yükleme tampon maddesi 5 ul ekle.
5. nükleik asit, leke interkalasyon ile boyanmış% 2 agaroz jeli reaksiyon ürünlerin yük 5 ul.
6. 1x TBE tamponu içinde 35 dakika boyunca 100 V'ta jel üzerinde çalıştırıldı.
7. UV ışığı ile sonuçları görselleştirmek.

5. sulandırılmış ile LAMBA Reaksiyonu gerçekleştirinReaktifler

1. 10x Pol Tamponu 125 ul 5 M Trimethylglycine 200 ul, 1 M MgSO ₄ 7.5 ul karıştırın, su 667.5 ul sulandırma tamponu 1 ml yapmak için. 10 saniye boyunca darbe vorteks ile karıştırın.
2. mühürlü alüminyum folyo çanta liyofilize reaktif ihtiva tüpleri çıkarın. alüminyum folyo çanta mühürlü değilse tüpleri kullanmayın veya hasarlı olup olmadığını.
3. Liyofilize reaktifler yeniden askıya almak için her bir tüp halinde yeniden tamponu 20 ul ekle.
4. Tampon yukarı ve aşağı 5 kez pipetleme karıştırın. Liyofilize reaktifler tamamen yeniden askıya alınır emin olmak için bir göz atın. beyaz toz tüp içinde kaybolur.
5. yeniden reaktifler (aşama 1 ya da 2) DNA şablonu 5 ul ilave edin ve iyice karıştırın.
6. Yakın boru ve bir su banyosu ya da ısıtma bloğu içinde 60 dakika süre ile, 60 ° C'de inkübe edin.
7. Tepkimeyi sonlandırmak için 10x, jel yükleme tampon maddesi 5 ul ekle.
8. Yük reaksiyon 5 ulnükleik asit, leke interkalasyon ile boyanmış% 2 agaroz jel ürünleri.
9. 1x TBE tamponu içinde 35 dakika boyunca 100 V'ta jel üzerinde çalıştırıldı.
10. UV ışığı ile sonuçları görselleştirmek.

6. Sulandırma Tampon HNB veya Floresan araya eklenen boyanın İçeren ile LAMBA Reaksiyonu gerçekleştirin

1. 10x Pol Tamponu 125 ul 5 M Trimethylglycine 200 ul, 1 M, 7.5 ul MgSO _4, 20 mM HNB (ya da 100X flüoresan araya eklenen boyanın 12.5 ul) ve 660 ul (veya 655 ul) su için 7.5 ul karıştırın sulandırma tamponu 1 ml yapmak. 10 saniye boyunca darbe vorteks ile karıştırın.
2. 5.6 - adımlarını 5.2 tekrarlamak için 6. bölümde hazırlanan sulandırılmış tampon kullanın.
3. çıplak gözle sonuçları (HNB içeren reaksiyon) ya da bir UV ışığı (floresan interkalasyon boya içeren reaksiyon) gözünüzde canlandırın.

7. Tüp Tarayıcı ile gerçek zamanlı LAMBASI Reaksiyonu gerçekleştirin

1. reconstitut DNA ul 5 ekleyinfloresan interkalasyon boya, yakın tüp içeren ve tüp tarayıcıya yerleştirin ed reaktifleri.
2. 60 ° C'ye ayarlanmış inkübasyon sıcaklığı. 60 dakika boyunca 520 nm de floresan ölçülür.

Sonuçlar

0.2 ml tüp içinde liyofilize LAMP reaktifler Bst DNA polimeraz, astar ve dNTP içerir. Sulandırma tamponu 20 ul yeniden askıya liyofilize reaktifler kullanılır. 1 taze hazırlanmış reaktifler ve liyofilize reaktiflerle agaroz jelleri üzerinde LAMP reaksiyonu sonucu göstermektedir. Liyofilize reaktif aktivitesini azaltmaz. DNA şablonu. Şekil 2'nin 25 kopya tespit her iki reaktiflerle hazırlanan LAMP reaksiyonlar?...

Tartışmalar

Daha önce, ekleme elemanı IS1111a ¹⁴ hedefleyen duyarlı ve özgül LAMBA testi geliştirdi. Derece C arasında, farklı türleri arasında korunduğu için IS1111 elemanı seçilmiştir burnetti ve bakteri kopya yüksek numarası (110 7) (Klee 2006). Bizim sonuçlarımız LAMP Coxiella DNA gibi kısa bir sürede kromozomal kopyasını ilişkili olabilir IS1111 elemanı, yaklaşık 25 kopya tespit edebilen gösterdi. Bu çalışmada, Bst DNA pol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP primers	Eurofins MWG operon	10 nmol, salt free	Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase	New England Biolabs	M0275L	8 units/ml
10x Thermo pol buffer	New England Biolabs	B9004S
dNTP mixture	New England Biolabs	N0447L	10 mM each
Betaine	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	gel loading buffer
SYBR green	Invitrogen	S7585	10,000x, visualize products in tubes
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents	Gene Reach
Hydroxynaphthol blue	Fluka	33936-10G
ESEQuant tube scanner	Qiagen		real-time detection