冻干环介导等温扩增试剂的检测中的发展<em&gt;贝氏柯克斯体</em

摘要

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

摘要

贝氏柯克斯体 ，引起Q热剂，是一种专性细胞内细菌。基于PCR的诊断测定法已经开发了用于检测C.在细胞培养物和临床样品burnetii的DNA。 PCR需要专门的设备和大量的最终用户培训，因此，它不适合用于特别是在资源有限的地区的日常工作​​。我们已经开发出一种环介导等温扩增（LAMP）法检测C的存在burnetii患者样品英寸该方法是在在水浴或加热块约60℃的单一温度下进行。此LAMP检测的灵敏度非常相似的PCR用的每个反应约2​​5拷贝的检测限。本报告描述了使用冷冻干燥的试剂和使用hydroxynaphthol蓝色（HNB）或在反应的荧光嵌入染料UV灯结果的可视化的反应的制备方法。该LAMP试剂均为lyophili捷思并储存于室温（RT）一个月没有检测灵敏度的损失。因为反应混合配制不涉及复杂的步骤，这LAMP检测尤为强劲。这种方法非常适合在资源有限的环境中使用，其中Q热流行。

引言

小革兰氏阴性细菌贝氏柯克斯体是Q热，这是一个世界性的动物传染病的病原体。由于Q热的全球分销和C.高传染性burnetii，海外部署的美国军事人员和文职人员都在被感染的流行地区的风险。

Q热表现为两种形式:急性和慢性感染。急性C-发热呈现本身具有类似流感的症状，肝炎，或肺炎，通常是一种自限性疾病与低死亡率。慢性C-发热，而不太普遍，通常导致心内膜炎，如果不治疗^的1,2-其具有高得多的死亡率。因此，早期诊断，指导适当的治疗为病人护理的关键。聚合酶链反应（PCR）和定量实时PCR（qPCR的）测定法已经开发了用于检测C.在细胞培养和临床标本^3-5 DNA/ SUP>。 PCR和定量PCR是昂贵的，往往不是在日常工作资源受限的地区一应俱全。

最初由Notomi ^6中所述，环介导等温扩增（LAMP）提供了一种替代DNA扩增方法。灯使用为链置换DNA合成的Bst DNA聚合酶与识别靶基因的至少六个独立区域专门设计的引物组沿。灯的最显著优点是，在等温条件下发生扩增。因此，只需要一个水浴，加热块或培养箱。此方法已被用于检测多种立克次氏体的病原体^7-9。通过凝胶电泳的扩增DNA产物的可视化是可区分假阳性真阳性由于非特异性扩增的最精确的方法。然而涉及凝胶电泳的程序不用于资源有限的芳实际EAS。被开发几种可供选择的方法来检测反应产物。这些替代方案中，如从焦磷酸镁的形成¹⁰或使用荧光嵌入染料衍生的浊度在紫外灯下^11,12被可视化比运行凝胶更为有利。当储存在25℃和37℃，这是在热带和亚热带国家的环境温度，其中Q热流行¹³上的LAMP试剂为一个月稳定。

一盏灯试验在我们的实验室开发的检测C.存在burnetii血浆样品^14英寸在这里，我们描述了从冻干试剂的制备上的LAMP反应混合物的一个简单的协议。当储存在室温冻干试剂是一个月稳定。当与方便的可视化相结合的方法，这就是使用检测C.一种理想的方法burnetii在资源有限的设置。

研究方案

1.准备质粒DNA稀释为标准LAMP反应

1. 使用分光光度计在260nm处测量光密度（OD）来确定DNA浓度的质粒（ 贝氏柯克斯 RSA 493的含有靶基因IS1111a）。 1的OD ₂₆₀相当于50微克/μL的DNA。
2. 转换的质粒DNA的量成拷贝数。自质粒的大小是6,330碱基对，该质粒的分子量为4.1×10 ⁶克（6,330 bp的点¯x649克/碱基对）。质粒的DNA浓度为34.2纳克/微升（如来自步骤1.1确定）。 1微升该DNA样品中包含34.2纳克质粒DNA，等同的DNA的5×10 ⁹份（34.2×10 ^-9克/ 4.1×10 ⁶的gx 6.02×10 ^23）。
3. 添加10微升质粒DNA（5×10 ^9个拷贝/微升）的90微升的水用于稀释10倍，使5×10 ⁸拷贝的DNA样品/微升。
4. 重复步骤1.3至制备的5×10 ⁷的DNA样本，5×10 ^{6，5×10 5，5×10 4，5×10 3，5×10 2，5×10 1，}和5×10 ⁰个拷贝/微升。

2.样品为LAMP反应制备DNA模板

1. 执行从使用根据制造商的协议市售的DNA mini试剂盒的人血浆样品的DNA提取。总共使用提取200微升样品，并在20微升体积洗脱提取的DNA。

3.准备2个LAMP反应缓冲液

1. 混合200μl的10倍聚合酶缓冲液，320微升的5M的三甲基甘氨酸，12微升的1M _硫酸镁 ，280微升dNTP混合液（各10毫摩尔）和188微升的水至1ml 2×LAMP缓冲液中。通过脉冲涡旋10秒混合。

4.执行标准LAMP反应

1. 混合12.5微升2倍洛杉矶MP缓冲液（如在步骤3制备的40mM的Tris-HCl（pH值8.8），20mM的氯化钾，16毫_硫酸镁 ，20mM的（NH _4）2 SO _4，0.2％的Triton X-100，1.6M的三甲基甘氨酸，1.4 10mM的dNTP混合液），1.2微升引物混合物，1μl的的Bst DNA聚合酶（8U /微升），以及5.3微升的水，使在0.2mL的PCR管反应混合物（20微升）。
2. 添加（步骤1或2）5微升DNA到20微升反应混合物中拌匀。
3. 靠近管和孵育在60℃的水浴或加热块60分钟。这是预先确定的最佳反应温度。
4. 加入5微升10×凝胶上样缓冲液以终止反应。
5. 负载5微升反应产物与嵌入核酸染色剂染色的2％琼脂糖凝胶。
6. 对于在1×TBE缓冲液35分钟运行在100伏的凝胶。
7. 可视化紫外光的结果。

5.执行与复溶LAMP反应试剂

1. 混合125微升10X聚合酶缓冲液，200微升的5M的三甲基甘氨酸，7.5微升的1M _硫酸镁的，667.5微升的水至1ml重建缓冲液中。通过脉冲涡旋10秒混合。
2. 删除包含从密封铝箔袋的冻干试剂管。不使用如铝箔袋未被密封的管子，或者如果它被损坏。
3. 加入20μl重建缓冲液到每个管重新悬浮冻干试剂。
4. 吹打缓冲上下5次混匀。看看，以确保冻干试剂完全重悬。白色粉末，应在管消失。
5. 加入5微升DNA模板（从步骤1或2）的重组试剂拌匀。
6. 靠近管和孵育在60℃的水浴或加热块60分钟。
7. 加入5微升10×凝胶上样缓冲液以终止反应。
8. 负载5微升反应产品与嵌入核酸染色剂染色的2％琼脂糖凝胶。
9. 对于在1×TBE缓冲液35分钟运行在100伏的凝胶。
10. 可视化紫外光的结果。

6.重建缓冲液含HNB或荧光嵌入染料进行LAMP反应

1. 混合125微升10X波尔缓冲液，200微升5米的三甲基甘氨酸，7.5微升1M的_硫酸镁 ，7.5微升20毫HNB（12.5微升100倍的荧光嵌入染料）的水和660微升（或655微升）至使1毫升重建缓冲液中。通过脉冲涡旋10秒混合。
2. 使用在第6准备重复步骤5.2重组缓冲区 - 5.6。
3. 可视化的结果用肉眼（含有HNB反应）或UV光（含有荧光嵌入染料反应）。

7.执行与管扫描仪实时LAMP反应

1. 微升的DNA加5至reconstitut含有荧光嵌入染料，靠近管，将其插入到管扫描版试剂。
2. 设定培养温度在60℃。测量在520nm处的荧光60分钟。

结果

0.2毫升管内的冷冻干燥的LAMP试剂包含的Bst DNA聚合酶，引物，和dNTP。 20微升重组缓冲液用于重新暂停冻干试剂。 图1示出了与新鲜制备的试剂和冻干试剂琼脂糖凝胶上的LAMP反应的结果。冻干的试剂不降低其活性。由两种试剂制备可检测DNA模板。 图2的25份的LAMP反应示出了反应产物的HNB或存在于反应荧光嵌入染料的检测。 HNB的除了反应产生?...

讨论

以前，我们开发了一个敏感和特异LAMP检测针对插入元素IS1111a ^14。被选择的IS1111元件，因为它是高度C的不同菌株中保守burnetii和细菌高份数（7〜110）（2006年克利）。我们的结果表明，灯可以检测约25 IS1111元件，其可以关联到贝氏的DNA少则一染色体拷贝的拷贝。在这项研究中， 的Bst DNA聚合酶，LAMP引物和dNTP冻干并包装在压缩铝箔袋。这些冻干...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP primers	Eurofins MWG operon	10 nmol, salt free	Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase	New England Biolabs	M0275L	8 units/ml
10x Thermo pol buffer	New England Biolabs	B9004S
dNTP mixture	New England Biolabs	N0447L	10 mM each
Betaine	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	gel loading buffer
SYBR green	Invitrogen	S7585	10,000x, visualize products in tubes
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents	Gene Reach
Hydroxynaphthol blue	Fluka	33936-10G
ESEQuant tube scanner	Qiagen		real-time detection